Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové katedra biologických a lékařských věd Sledování hodnot ph u trombocytů z buffy-coatu (bakalářská práce) Hradec Králové, 2010 Eva Csapková
Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracovala samostatně. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu. V Hradci Králové, dne 12. 5. 2010 Eva Csapková 2
Děkuji tímto prim. MUDr. Řeháčkovi za vedení mé bakalářské práce, Mgr. Kofránkové za podporu při psaní bakalářské práce a kolektivu sester na úseku výroby TO FNKV. 3
Abstrakt Teoretická část bakalářské práce je zaměřena na seznámení s druhy trombocytárních přípravků. V hrubých rysech nastiňuje odběr přípravků a požadavky kontroly kvality. Praktická část, jejímž cílem je zhodnotit kvalitu přípravků trombocytů z buffy-coatu a zvážit důležitost výběru dárce pro jejich výrobu, obsahuje výsledky měření a jejich následné vyhodnocení. 4
Abstrakt Theoretical part of this bachelor thesis is specialized on introduction with sorts of thrombocytes preparations. This thesis is drawing out in a rough line taking off a preperations and requirements of quality control. Practical part, which goal is evaluation of quality of preparations of thrombocytes from buffy-coat and consider the significance of a selection the donator for their production, contains results of measurement and their consequential interpretation. 5
Obsah 1 Úvod zadání práce... 7 2 Teoretická část... 10 2.1 Trombocytární přípravky... 11 2.1.1 Použití trombocytárních přípravků... 11 2.1.2 Druhy trombocytárních přípravků... 11 2.1.3 Druhy trombocytárních přípravků v TO FNKV... 12 2.1.4 Způsoby získávání trombocytárních přípravků... 13 2.2 Kontrola kvality... 15 2.2.1 Kritéria kvality... 16 2.2.2 Kontroly kvality... 17 2.2.3 Skladování trombocytárních přípravků... 18 3 Experimentální část... 20 3.1 Cíl práce... 21 3.2 Popis práce... 21 3.3 Použitý materiál... 21 3.3.1 Biologický materiál... 21 3.3.2 Roztoky a činidla... 21 3.3.3 Pomůcky... 22 3.3.4 Přístroje... 22 3.3.5 Pracovní postup... 22 3.4 Vlastní výpočty... 24 3.4.1 Přepočet trombocytů na transfuzní jednotku... 24 3.4.2 Výpočet leukocytů s následným přepočtem na transfuzní jednotku... 24 4 Přehled výsledků... 25 4.1 Přehled výsledků exspirovaných TB... 26 4.2 Přehled výsledků čerstvě vyrobených TB... 31 5 Diskuze... 36 6 Závěr... 38 7 Seznam obrázků:... 39 6
1 Úvod zadání práce Transfuze krve je nezbytnou součástí moderní péče o zdraví. Při správném používání může zachránit život a zlepšit zdravotní stav. Transfuze je proces, během kterého je do krevního oběhu příjemce vpravena krev, nebo její složky, od dárce. Léčení krví má dlouhou a zajímavou historii. O transfuzi krve v dnešním slova smyslu se mohlo uvažovat v době, kdy Angličan William Harvey v roce 1616 objevil krevní oběh. První ověřenou, a technicky úspěšnou, transfuzi u člověka provedl v roce 1667 Jean Babtiste Denis. K transfuzi použil krve jehněte. Jeho další pokusy s transfuzemi zvířecí krve člověku však nebyly úspěšné. Neúspěchy s transfuzemi zvířecí krve zdiskreditovaly tuto metodu, takže na sklonku sedmdesátých let 17. století byly v Anglii, Francii a Itálii pokusy s transfuzemi zakázány. Do začátku 19. století opadl zájem o otázky transfuze. Až v roce 1816 velmi odpovědně přistoupil ke studiu transfuze krve profesor fyziologie a porodnictví James Blundell. Svoji první transfuzi provedl v roce 1819. V roce 1824 vydal knihu o transfuzi krve, v níž zdůraznil správnou zásadu, že člověku lze převádět pouze lidskou krev. Při transfuzi doporučoval velkou opatrnost. Při jakýchkoliv nepříznivých příznacích u příjemce radil transfuzi přerušit, popřípadě použít krev jiného dárce. Hodnota krevního převodu byla posuzována velmi zdrženlivě, protože nebezpečí tohoto zákroku bylo značné. Hlavní příčinou neúspěchu transfuzí byla neznalost krevních skupin. K jejich objevu došlo až v prvních letech 20. století. Teprve po využití tohoto objevu se transfuze mohly stát přiměřeně bezpečným lékařským zákrokem. Nedůvěra k transfuzi byla však v době objevu krevních skupin tak hluboce zakořeněná, že nesmírný význam tohoto objevu si lékaři dost rychle neuvědomili. Trvalo skoro dvacet let, než poznatky o krevních skupinách vstoupily ve všeobecnou známost a než byly zajištěny předpoklady pro běžné vyšetřování krevních skupin a tím i pro široké využití transfuzí. V roce 1901 rozdělil Karl Landsteiner lidské krve podle aglutinačních vlastností do tří skupin. K tomuto závěru dospěl na základě vyšetření krví menší skupiny osob tím způsobem, že mísil vzájemně krvinky a séra všech vyšetřovaných. Je nutno poznamenat, že Landsteiner neobjevil čtvrtou skupinu pouhou náhodou, žádný z jeho vyšetřovaných totiž tuto skupinu neměl. První v českých zemích, kdo správně roztřídil podle aglutinačních vlastností lidskou krev do 4 skupin, byl Čech Jan Janský v roce 7
1907. Krevní skupiny označil I, II, III, IV. Podobný objev jako Janský učinil v roce 1910 W. L. Moss v Americe. Také tento badatel označil krevní skupiny římskými číslicemi, ale v obráceném pořadí. Toto různé označování krevních skupin byl pak po řadu dalších let příčinou mnoha nesrovnalostí. Proto v roce 1921 výbor amerických vědeckých společností doporučil na základě priority objevu klasifikaci Janského. Až ve 30. letech byly krevní skupiny všeobecně označovány velkými písmeny A, B, AB a 0 podle Landsteinera. Po objevu skupinového systému lidské krve AB0 byly postupně objevovány další antigenní vlastnosti červených krvinek. V roce 1941 byl objeven další skupinový systém erytrocytů. Byl nazván Rh podle opice Macacus rhesus, jejíž krvinky byly použity v pokusech, které vedly k objevu této vlastnosti. Vážnou překážku transfuzí, srážení krve, vyřešili v roce 1835 německý fyziolog T. L. W. Bischoff a ruský chirurg V. V. Sutugin tím, že základní surovinu v procesu krevního srážení, bílkovinu fibrinogen odstranili z krve vyšleháním kovovou metlou. Takto získaná nesrážlivá krev mohla být bez úhony přechovávána v chladném prostředí i delší dobu. V první světové válce, při velkém počtu raněných, vyvstala naléhavá potřeba nepřímé transfuze a tedy i konzervování krve. S tímto problémem si poradila trojice badatelů, dva Američané a jeden Belgičan, když v roce 1914 objevili protisrážlivý účinek citronanu sodného. Krev stabilizovanou citronanem bylo možné skladovat 7-9 dní. Poprvé byla podána v roce 1915. Hned v následujícím roce byl tento objev zdokonalen použitím citronanu sodného a glukózy. Krvinky glukózu metabolizují, získávají z ní energii, čímž se exspirace prodlužuje. Smutnou skutečností je, že po válce panovala jistá nedůvěra ke staré, to znamená konzervované krvi. Prakticky došlo k návratu k přímým převodům krve. Větší pozornosti se transfuze konzervované krve začaly těšit od roku 1925. Průkopníky na tomto poli byli sovětští lékaři. Již v roce 1926 byl v Moskvě založen Ústřední ústav krevní transfuze. První pracoviště, kde se prováděly transfuze, se nazývalo hemotéka. S rozvojem vědeckých poznatků se snižovala rizika pro dárce a příjemce krve. Byly vypracovány první testy k zajištění kompatibility. Ke zvýšení bezpečnosti krevní transfuze nemalou měrou přispělo i zavedení tzv. biologické zkoušky, kdy se pacientovi 8
převedlo malé množství krve. Teprve poté, co se neobjevily žádné nežádoucí účinky, se smělo v transfuzi pokračovat. Opět to byla válka, která prověřila akceschopnost transfuziologie i možnost konzervovat krev. V průběhu občanské války ve Španělsku v letech 1936 1939 bylo provedeno 20 tisíc transfuzí konzervované krve. Za druhé světové války zvyšující se kvalitativní a kvantitativní požadavky na konzervovanou krev vyřešili američtí vědci. Do té doby používané skleněné lahve nebyly pro válku ideální a byly proto nahrazeny uzavřeným systémem plastových odběrových vaků, které se prakticky používají dodnes. Významným pokrokem bylo zdokonalení konzervace krve. Roztok citronanu sodného a glukózy byl obohacen kyselinou citronovou, která prodloužila skladovací dobu konzervované krve na 3-4 týdny. Přidáním adeninu se exspirace přípravku prodloužila na 35 dnů. Separace plazmy a následná lyofilizace mnohonásobně prodloužila její použitelnost. V době druhé světové války se také podařilo rozdělit plazmu na její jednotlivé složky v čisté a koncentrované formě. Frakcionace plazmy je dodnes důležitým nástrojem při výrobě krevních derivátů. Dnešní konzervační roztoky obsahují citrát sodný, kyselinu citronovou, dextrózu a fosfát. Fosfát zvyšuje ph a omezuje tak hemolýzu erytrocytů. Pro konzervační roztoky je důležité, že jejich složení musí nejen zabránit srážení krve, ale také v běžných léčebných dávkách nesmí být pro lidský organismus toxické. Po extrakci plazmy se ke krvinkám přidávají resuspenzní roztoky. Ty obsahují dextrózu, chlorid sodný, manitol a adenin. Tyto látky dodávají erytrocytům energii, prodlužují jejich životnost, takže resuspendované erytrocyty můžeme uchovávat při teplotě 2 6 C maximálně 42 dnů. Plazma se šokově mrazí při teplotě nižší než 30 C. Exspirace se uvádí 3 roky. Pro transfuzi ji lze použít po 6 -ti měsíční karanténě. 9
2 Teoretická část 10
2.1 Trombocytární přípravky 2.1.1 Použití trombocytárních přípravků Trombocytární přípravky slouží ke korekci trombocytopenie a k léčbě krvácivých stavů. Cílem substituce je předejít nebo zastavit krvácení způsobenému trombocytopenií nebo trombocytopatií. U dospělých se nejčastěji používají z aferézy deleukotizované TAD. Obsah trombocytů > 2x10 11 /TU je adekvátní pro dospělého člověka. Děti a novorozenci potřebují malé objemy tekutin, může u nich docházet k oběhovému přetížení. Dávkování u dětí se provádí podle jejich hmotnosti. U dětí do 15 kg nejlépe poslouží z buffy-coatu (TB). Obsah trombocytů v jednom vaku je 0,5x10 11 /TU. Jedna terapeutická jednotka pro dospělého jedince obsahuje 4-6 vaků trombocytů z buffy-coatu. Každý z těchto vaků je získán od jiného dárce. Příjemce je tedy 4-6x více imunizován, než u trombocytárních přípravků z aferézy. Ten je totiž získáván jen z jednoho dárce. 2.1.2 Druhy trombocytárních přípravků Podle odběru a způsobu zpracování rozlišujeme tyto druhy trombocytárních přípravků: Trombocyty z aferézy, kterými se rozumí koncentrovaná suspenze trombocytů získaná aferézou. Trombocyty z aferézy, deleukotizované, kterými se rozumí koncentrovaná suspenze trombocytů získaná aferézou, ze které jsou odstraněny. Trombocyty ze standardního odběru, směsné, kterými se rozumí koncentrovaná suspenze trombocytů získaná zpracováním jednotek z plné krve a spojením trombocytů získaných z těchto jednotek během oddělení nebo po něm. Trombocyty ze standardního odběru, směsné, deleukotizované, kterými se rozumí koncentrovaná suspenze trombocytů získaná zpracováním jednotek plné krve a spojením trombocytů získaných z těchto jednotek během oddělení nebo po oddělení, ze které jsou odstraněny. 11
Trombocyty z jednotlivého standardního odběru a) Trombocyty z plné krve b) Trombocyty z buffy-coatu, kterými se rozumí koncentrovaná suspenze trombocytů získaná zpracováním jedné jednotky plné krve. Trombocyty z jednotlivého standardního odběru, deleukotizované a) Trombocyty z plné krve, deleukotizované b) Trombocyty z buffy-coatu deleukotizované, kterými se rozumí koncentrovaná suspenze trombocytů získaná zpracováním jedné jednotky plné krve, ze které jsou odstraněny. Obrázek 1: Trombocyty z BUFFY-COATU a z Aferézy deleukotizované 2.1.3 Druhy trombocytárních přípravků v TO FNKV V TO FNKV na oddělení výroby vyrábíme: Trombocyty z buffy-coatu TB, z jednoho odběru Trombocyty z aferézy TA Trombocyty z aferézy deleukotizované TAD 12
2.1.4 Způsoby získávání trombocytárních přípravků 2.1.4.1 Trombocyty z buffy-coatu Trombocyty z buffy-coatu jsou získávány zpracováním odběru plné krve. Plná krev se pro transfuzi používá jen výjimečně, přednostně se jejím zpracováním vyrábějí erytrocytární přípravky, plazma a z buffy-coatu. K odběru se používá kompletně uzavřený systém. V TO FNKV používáme čtyřvakový systém. V jednom ze čtyř vaků je protisrážlivý roztok, ve druhém je resuspenční roztok, další dva vaky jsou prázdné. Plná krev se odebere do základního vaku, ve kterém je umístěn protisrážlivý roztok. Celá souprava se vloží do speciální odstředivky a při vysokých otáčkách asi 4000 za minutu se po dobu 10-20 minut odstřeďuje. Odstředěná souprava vaků se vloží do tzv. krevního lisu. Stlačením se jednotlivé krevní součásti přemístí do dalších krevních vaků. Nejprve se do třetího z vaků, který je prázdný, vytlačí plazma. Po té se rozmezí mezi plazmou a krví, tzv. buffy-coat, vytlačí do čtvrtého vaku. K erytrocytům, které zůstaly v základním vaku, se přidá resuspenční roztok z druhého vaku, čímž se uvolnil pro vyrobené z buffy-coatu. Tento vak, v němž byl původně resuspenční roztok, slouží pro uchovávání trombocytů z buffy-coatu, pro něž má speciální úpravu. Je polopropustný pro kyslík. 13
Obrázek 2: Krevní lis 2.1.4.2 Trombocyty z aferézy Trombocyty z aferézy jsou získány trombocytaferézou. Získávají se pomocí speciálního přístroje, díky kterému je zajištěn extrakorporální oběh dárce. Krevní separátor umožňuje odběr složek krve od dárců, terapeutickou aferézu nebo terapeutickou výměnu plazmy. Přístroj pracuje na principu diferenciální centrifugace. Odebírány jsou pouze a ostatní komponenty krve jsou vráceny zpět do krevního oběhu dárce. Tímto odběrem můžeme od jednoho dárce získat 200-800x10 9 trombocytů. Destičky jsou suspendovány ve 200-300 ml plazmy a v náhradním roztoku pro. Podle počtu odseparovaných trombocytů můžeme získat až 3 transfuzní jednotky trombocytárního přípravku. Zařízení se ovládá prostřednictvím barevného monitoru 14
o vysokém rozlišení s ovládacími tlačítky po obou stranách. Monitor zobrazuje pouze tlačítka a pomocná hlášení pro uživatele, která jsou v příslušné fázi programu potřebná. Vždy jsou zobrazena aktuální data o separaci. K separační proceduře je nutný jednorázový set, jehož základními součástmi jsou separační komora, sety pump, kapkové komůrky a vaky. V závislosti na druhu procedury musí být použity i různé sety. Separace veškeré krve probíhá v separační komoře pomocí odstředivé síly. Detektor úniku krve uvnitř skříňky odstředivky zabraňuje nebezpečné ztrátě krve u dárce. Krev a její jednotlivé složky transportují čtyři peristaltické pumpy. Správné průtokové dráhy v setu otevírají a zavírají automatické výstřední klapky. Celý proces separace je nepřetržitě monitorován několika čidly, takže je vždy zajištěna bezpečnost dárce. V případě kritického stavu se na monitoru zobrazí varování nebo výstraha a zazní zvukový signál. Zařízení současně uzavře návratovou klapku a tím oddělí oběh dárce od oběhu přístroje. Separace se zastaví. V případě výpadku proudu je zajištěn nouzový provoz přístroje po dobu minimálně 10 minut na integrovanou baterii. Během této doby může být krev vrácena dárci. Všechny separační procedury musí být prováděny pod dohledem lékaře. Během celého separačního procesu musí být zajištěna řádná obsluha, monitorování aferézového systému a dohled nad dárcem. O přípravě, bezpečnostní kontrole a jednotlivých krocích separační procedury musí být vyhotoven záznam. Součástí odběrových setů jsou filtry, které odstraňují bílé krvinky z přípravku a snižují riziko nežádoucích reakcí příjemce. Odběr trvá přibližně 90 minut a jeho výhodou je vysoký obsah buněk. Také riziko přenosu infekce je sníženo na minimum díky jednorázovému setu. 2.2 Kontrola kvality Trombocytární přípravky jsou vyráběny podle zásad správné výrobní praxe s maximálním důrazem na jejich jakost a bezpečnost pro příjemce. Jejich výroba se řídí novelou zákona o léčivech č. 378/2007 Sb. a vyhláškou o lidské krvi č. 143/2008 Sb. Na každý trombocytární přípravek jsou kladeny jiná kritéria kvality a kontroly kvality. 15
2.2.1 Kritéria kvality Trombocyty z buffy-coatu, z jednoho odběru objem: 50 ml sterilní počet trombocytů: 0,5x10 11 /TU u 75% kontrolovaných přípravků počet leukocytů: <0,05x10 9 /TU u 75% kontrolovaných přípravků vizuální kontrola u každého přípravku na viabilnost trombocytů swirling fenomén a nesmí být přítomné růžové zabarvení přípravku ph: 6,5 až 7,4, kontroluje se 6. den výsledky vyšetření HIV Ag-Ab, HCV Ag-Ab, HBsAg, Syphilis total Ab: negativní vyšetření krevní skupiny v systémech AB0, Rh a Kell vyšetřené nepravidelné protilátky proti erytrocytům: negativní neporušenost obalu bez viditelné hemolýzy a agregátů Trombocyty z aferézy objem: > 40 ml na 60x10 9 trombocytů sterilní počet trombocytů: > 2x10 11 /TU u minimálně 75% kontrolovaných přípravků počet leukocytů: < 1,0x10 9 /TU u 75% kontrolovaných přípravků kontaminace erytrocyty: vizuální kontrola, přípravek nesmí mít růžové nebo červené zabarvení, bez agregátů ph: 6,5 až 7,4 neporušenost obalu vyšetření krevní skupiny v systémech AB0, Rh a Kell vyšetřené nepravidelné protilátky proti erytrocytům: negativní výsledky vyšetření HIV Ag-Ab, HCV Ag-Ab, HBsAg, Syphilis total Ab: negativní Trombocyty z aferézy deleukotizované objem: > 40 ml na 60x10 9 trombocytů sterilní 16
počet trombocytů: > 2x10 11 /TU minimálně u 75% kontrolovaných přípravků počet leukocytů: < 1,0x10 6 /TU u 75% kontrolovaných přípravků kontaminace erytrocyty: vizuální kontrola, přípravek nesmí mít růžové nebo červené zabarvení, bez agregátů ph: 6,5 až 7,4 neporušenost obalu vyšetření krevní skupiny v systémech AB0, Rh a Kell vyšetřené nepravidelné protilátky proti erytrocytům: negativní výsledky vyšetření HIV Ag-Ab, HCV Ag-Ab, HBsAg, Syphilis total Ab: negativní 2.2.2 Kontroly kvality Trombocyty z buffy-coatu, z jednoho odběru objem u každého přípravku sterilita přípravků u každého vizuální kontrola u každého přípravku počet trombocytů a leukocytů u 1% přípravků neporušenost obalu, kompletnost a dobrá čitelnost finálního štítku u každého přípravku ph 6. den, minimálně 4 přípravky za měsíc Trombocyty z aferézy objem u každého přípravku počet trombocytů u každého přípravku sterilita u 3% přípravků vizuální kontrola u každého přípravku neporušenost obalu, kompletnost a dobrá čitelnost finálního štítku u každého přípravku Trombocyty z aferézy deleukotizované objem u každého přípravku počet trombocytů u každého přípravku sterilita u 3% přípravků 17
vizuální kontrola u každého přípravku neporušenost obalu, kompletnost a dobrá čitelnost finálního štítku u každého přípravku 2.2.3 Skladování trombocytárních přípravků Destičkové přípravky jsou mimořádně citlivé na skladovací podmínky. Metabolismus destiček, životnost a jejich funkce je závislá na přiměřené dostupnosti pro kyslík, teplotě a ph destičkových přípravků. Uchováváme-li při 22 C trombocytární přípravek, 100x10 9 destiček v přípravku spotřebuje zhruba 10 µmol kyslíku za hodinu. Kyslík je ovlivněn také kontaminujícími. Jejich malá příměs v přípravku však neovlivňuje celkovou potřebu. Potřebný kyslík pro destičky může být ovlivněn různými způsoby třepání, měnícím se ph a teplotou. 18
Obrázek 3: Třepačka Pro uchovávání destiček je doporučované uzavřené zařízení s kontrolou teploty. Teplota v zařízení musí být trvale udržována v rozmezí 20 C až 24 C. Destičky by měly být uloženy na třepačce, která umožní dostatečné míchání vaků, stejně jako výměnu plynů skrz vak. Při třepání však nesmí docházet k pěnění přípravků. Vaky ukládáme do třepačky každý zvlášť. Není vhodné, aby se navzájem překrývaly, nebo ležely na sobě. Třepačka by měla být opatřena termografem a alarmem, který nás informuje o vychýlení teploty od stanoveného rozmezí. Rychlost třepačky je pravidelně testována podle doporučení výrobce a její selhání by mělo být zaznamenáno a sledováno. Použitím speciálních vaků propustných pro plyny, vhodnou teplotou a dostatečným třepáním v průběhu skladování jsou zajištěny všechny potřebné podmínky pro správné uchovávání přípravků. 19
3 Experimentální část 20
3.1 Cíl práce Hlavním cílem praktické části je zhodnotit kvalitu trombocytárních přípravků trombocytů z buffy-coatu. Dalším cílem je posoudit, jak výběr dárce pro výrobu těchto přípravků může ovlivnit jeho kvalitu. Výběr dárců pro tuto skupinu transfuzních přípravků je možný právě pro zmenšující se potřebu těchto přípravků a pro velký počet dárců, ze kterých se dá vybírat. Z možných kriterií jakosti byl hlavní důraz kladen na hodnoty ph. Mezi další kritéria k posouzení jsem použila objem přípravku, hodnoty trombocytů a leukocytů. Všichni dárci byli vyšetřeni na virologické markery, krevní skupinu, systém Rh a Kell. 3.2 Popis práce První skupinu hodnocených přípravků tvoří přípravky vyrobené pro účely klinického použití. Všechny získané výsledky od této skupiny byly získány až po uplynutí exspirace, tj. 6. den. Druhou skupinu přípravků tvoří čerstvě vyrobené z buffy-coatu. Tato skupina přípravků byla vyrobena pouze pro experimentální účely a v žádném případě nesloužila pro klinické použití. Dárci v této skupině byli vybíráni náhodně. Výsledky této skupiny byly získány hned druhý den po výrobě těchto přípravků. 3.3 Použitý materiál 3.3.1 Biologický materiál 150 trombocytárních přípravků Trombocyty z buffy-coatu určených pro klinické použití na konci doby použitelnosti 150 trombocytárních přípravků z buffy-coatu vyrobených pro experimentální účely 3.3.2 Roztoky a činidla Kalibrátor pro ph metr Hamilton Duracal Buffer 7,00 ± 0,01 (Hamilton Bonaduz AG, Switzerland) Destilovaná voda (TO FNKV) Fyziologický roztok (TO FNKV) Türkův roztok (lékárna FNKV) 21
3.3.3 Pomůcky Skleněné kádinky, plastové zkumavky s uzávěrem, plastové zkumavky bez uzávěru, Nageottova komůrka, krycí sklíčka, Pasteurova pipeta Lihový fix, nůžky, peány, stojánky na zkumavky, automatické pipety a špičky 3.3.4 Přístroje ph metr ph ETMeter (Labo-ms spol. s. r. o) automatický hematologický analyzátor Celltac Auto mek-8118k (NIHON, KOHDEN) valivá třepačka mikroskop 3.3.5 Pracovní postup Před celým zpracováním a měřením produktů je nutné si uvědomit, že žádný trombocytární přípravek nesmí dlouho ležet mimo třepačku. 3.3.5.1 Měření ph Před každým měřením ph musíme provést kalibraci ph metru. Pro kalibraci nám slouží pufr uchovávaný v ledničce kolem teploty 4 C. Před jeho použitím musí dojít k jeho vytemperování na teplotu, při které chceme měřit ph. ph měříme v laboratoři, kde je stálá teplota 22 C. Kalibrátor si tedy vyndáme z lednice a necháme v laboratoři přibližně jednu hodinu. V této době si můžeme připravit všechny potřebné pomůcky jednak pro měření ph a jednak pro měření počtu trombocytů hematologickým analyzátorem. Všechno musí být pečlivě označené. Máme-li vytemperovaný kalibrační roztok, připojíme ph metr ke zdroji, zapneme a provedeme kalibraci. Tímto je ph metr připraven k měření. S ohledem na skladování trombocytů není vhodné vyndat ze třepačky všechny přípravky najednou. Vzhledem k množství přípravků je vhodné si měření rozdělit na několik částí asi tak po pěti přípravcích. U každého přípravku nejprve otevřeme vak, přestřihnutím hadičky a do příslušné zkumavky odebereme vzorek na hematologické vyšetření. Při manipulaci se zkumavkou je dobré zavřít otevřený vak peánem. Zabráníme tak vylití přípravku. Zkumavky se vzorky ukládáme do stojánku. Po uložení zkumavky se vzorkem zbylý 22
obsah přípravku převedeme do kádinky a změříme jeho ph. Hodnotu si pečlivě zaznamenáme do připravené tabulky. Při první manipulaci s vakem rozhodně nesmíme zapomenut zaznamenat i objem přípravku. Zhruba po pěti přípravcích znovu provedeme kalibraci, tím kontrolujeme, že naše měření je správné. Po skončení měření, zkumavky umístíme na valivou třepačku po dobu 30 minut až jedné hodiny. Dosáhneme tím řádného promíchání vzorků. Prázdné vaky a případné zbytky trombocytárních přípravků likvidujeme podle odpadního řádu TO FNKV. 3.3.5.2 Měření na hematologickém analyzátoru a počítání leukocytů v Nageottově komůrce Po dostatečném promíchání, vzorky po jednom měříme na hematologickém analyzátoru. Neumisťujeme všechny do zásobníku pro uzavřený systém, neboť bychom poslední vzorky neměli dostatečně promíchané. Hodnoty trombocytů zapisujeme do tabulky a vzorky vracíme k dalšímu míchání zpět na třepačku. Po doměření si připravíme další sadu zkumavek a řádně označíme. V těchto zkumavkách ředíme vzorky Türkovým roztokem a zároveň zde dochází k rozpadu nežádoucích elementů a k obarvení jader leukocytů. Do zkumavky pipetujeme automatickou pipetou 380 µl Türckova roztoku a 20 µl vzorku. Všechny zkumavky v ruce několikrát protřepeme a necháme stát nejméně 10 minut při pokojové teplotě. Mezitím si připravíme mikroskop a Nageottovu komůrku. Na komůrku umístíme krycí sklíčko a před plněním komůrky Pasteurovou pipetou každý vzorek znovu promícháme. Leukocyty počítáme v celém jejím objemu, tj. 100 µl. Komůrka obsahuje v horní části 20 řad a dalších 20 řad v dolní části. 23
3.4 Vlastní výpočty Pro všechny následující výpočty je důležité převést všechny objemy přípravků z mililitrů na litry. 3.4.1 Přepočet trombocytů na transfuzní jednotku Přepočet trombocytů na transfuzní jednotku probíhá následovně: objem přípravku v litrech vynásobíme počtem trombocytů získaných z hematologického analyzátoru. Výsledek vyjádříme jako hodnotu v 10 11 /TU. Např.: objem přípravku je 50 ml = 0,05 l Hodnota trombocytů získaná z analyzátoru je 845 x 10 9 /l 0,05 x 845 = 42,25 x 10 9 /TU = 0,4225 x 10 11 /TU 3.4.2 Výpočet leukocytů s následným přepočtem na transfuzní jednotku Nejprve je nutné zjistit počet leukocytů v jednom litru. To probíhá následovně: podíl počtu buněk z Nageottovy komůrky a objemu komůrky vynásobíme použitým ředěním. ( ) Např.: 800 leukocytů v komůrce Objem komůrky je 100 µ Ředění je 20x (800/100) x 20 = 160 x 10 6 /l Nyní, když víme, kolik leukocytů je v jednom litru, není problém spočítat, kolik leukocytů připadá na transfuzní jednotku. Výsledek vyjadřujeme jako hodnotu v 10 9 /TU. Např.: Počet leukocytů 160 x 10 6 /l Objem přípravku 0,05 l 160 x 0,05 = 8 x 10 6 /TU = 0,008 x 10 9 /TU 24
4 Přehled výsledků 25
4.1 Přehled výsledků exspirovaných TB číslo dárce objem (l) ph výchozí x10 9 /l x10 9 /l x10 11 /TU v komůrce x10 6 /l x10 9 /TU 1 0,06 7,27 278 990 0,594 867 173,4 0,010404 2 0,052 7,18 171 889 0,46228 675 135 0,00702 3 0,065 7,3 243 807 0,52455 897 179,4 0,011661 4 0,056 7,15 276 1015 0,5684 765 153 0,008568 5 0,054 7,33 169 645 0,3483 654 130,8 0,0070632 6 0,051 7,27 329 1311 0,66861 900 180 0,00918 7 0,059 7,21 293 1011 0,59649 967 193,4 0,0114106 8 0,057 7,18 269 990 0,5643 865 173 0,009861 9 0,054 7,09 243 961 0,51894 453 90,6 0,0048924 10 0,052 7,33 223 986 0,51272 675 135 0,00702 11 0,051 6,7 293 1106 0,56406 896 179,2 0,0091392 12 0,05 7,21 274 1005 0,5025 765 153 0,00765 13 0,051 7,14 287 1033 0,52683 468 93,6 0,0047736 14 0,06 7,24 246 856 0,5136 998 199,6 0,011976 15 0,061 7,26 276 1209 0,73749 897 179,4 0,0109434 16 0,063 7,12 245 870 0,5481 906 181,2 0,0114156 17 0,06 7,29 173 642 0,3852 896 179,2 0,010752 18 0,07 7,29 202 740 0,518 675 135 0,00945 19 0,05 7,04 258 1011 0,5055 487 97,4 0,00487 20 0,061 7,24 157 557 0,33977 786 157,2 0,0095892 21 0,075 7,26 228 785 0,58875 987 197,4 0,014805 22 0,056 7,27 171 675 0,378 564 112,8 0,0063168 23 0,063 7,18 256 960 0,6048 897 179,4 0,0113022 24 0,073 7,11 284 1112 0,81176 896 179,2 0,0130816 25 0,064 7,34 321 1207 0,77248 654 130,8 0,0083712 26 0,051 7,39 191 616 0,31416 785 157 0,008007 27 0,059 7,8 239 65 0,03835 987 197,4 0,0116466 28 0,068 7,32 213 750 0,51 654 130,8 0,0088944 29 0,059 7,3 261 987 0,58233 807 161,4 0,0095226 30 0,058 7,24 256 943 0,54694 887 177,4 0,0102892 31 0,051 6,55 335 1527 0,77877 664 132,8 0,0067728 32 0,05 7,35 251 1360 0,68 994 198,8 0,00994 33 0,053 7,22 350 1287 0,68211 547 109,4 0,0057982 34 0,059 7,43 245 946 0,55814 897 179,4 0,0105846 35 0,089 7,38 267 995 0,88555 658 131,6 0,0117124 36 0,052 7,27 244 998 0,51896 765 153 0,007956 37 0,053 7,44 282 1011 0,53583 897 179,4 0,0095082 38 0,053 7,41 261 965 0,51145 877 175,4 0,0092962 39 0,064 7,32 260 845 0,5408 890 178 0,011392 40 0,065 7,4 245 786 0,5109 587 117,4 0,007631 26
číslo dárce objem (l) ph výchozí x10 9 /l x10 9 /l x10 11 /TU v komůrce x10 6 /l x10 9 /TU 41 0,054 7,27 239 993 0,53622 988 197,6 0,0106704 42 0,053 6,95 276 1013 0,53689 776 155,2 0,0082256 43 0,059 7,03 242 941 0,55519 790 158 0,009322 44 0,051 7,2 291 1142 0,58242 654 130,8 0,0066708 45 0,069 6,95 301 1301 0,89769 778 155,6 0,0107364 46 0,059 7,22 214 845 0,49855 907 181,4 0,0107026 47 0,053 7,05 344 1178 0,62434 893 178,6 0,0094658 48 0,06 7,04 234 868 0,5208 871 174,2 0,010452 49 0,08 7,5 249 843 0,6744 763 152,6 0,012208 50 0,062 7,4 216 994 0,61628 761 152,2 0,0094364 51 0,058 7,26 249 869 0,50402 876 175,2 0,0101616 52 0,07 7,37 264 756 0,5292 998 199,6 0,013972 53 0,064 6,82 332 1143 0,73152 765 153 0,009792 54 0,056 7,13 268 982 0,54992 908 181,6 0,0101696 55 0,063 7,55 235 862 0,54306 800 160 0,01008 56 0,051 6,38 321 1375 0,70125 876 175,2 0,0089352 57 0,065 7,21 265 783 0,50895 897 179,4 0,011661 58 0,05 7,06 256 1014 0,507 897 179,4 0,00897 59 0,059 6,67 320 1115 0,65785 765 153 0,009027 60 0,063 7,24 303 1054 0,66402 900 180 0,01134 61 0,055 7,45 284 1281 0,70455 807 161,4 0,008877 62 0,051 7,23 280 1311 0,66861 876 175,2 0,0089352 63 0,05 7,32 268 1265 0,6325 873 174,6 0,00873 64 0,06 7,33 234 896 0,5376 498 99,6 0,005976 65 0,064 7,33 287 996 0,63744 765 153 0,009792 66 0,055 7,42 175 664 0,3652 894 178,8 0,009834 67 0,051 7,38 259 983 0,50133 673 134,6 0,0068646 68 0,054 7,32 256 999 0,53946 897 179,4 0,0096876 69 0,054 7,25 218 743 0,40122 896 179,2 0,0096768 70 0,055 7,4 238 932 0,5126 763 152,6 0,008393 71 0,058 7,37 199 628 0,36424 908 181,6 0,0105328 72 0,05 7,38 175 783 0,3915 965 193 0,00965 73 0,054 7,22 279 1022 0,55188 886 177,2 0,0095688 74 0,078 6,95 303 1107 0,86346 796 159,2 0,0124176 75 0,051 7,32 210 997 0,50847 657 131,4 0,0067014 76 0,05 7,17 269 1031 0,5155 852 170,4 0,00852 77 0,061 6,61 375 1341 0,81801 871 174,2 0,0106262 78 0,073 7,37 261 741 0,54093 784 156,8 0,0114464 79 0,058 7,44 194 541 0,31378 786 157,2 0,0091176 80 0,055 7,34 264 967 0,53185 772 154,4 0,008492 27
číslo dárce objem (l) ph výchozí x10 9 /l x10 9 /l x10 11 /TU v komůrce x10 6 /l x10 9 /TU 81 0,05 7,3 280 1296 0,648 876 175,2 0,00876 82 0,067 7,3 219 756 0,50652 895 179 0,011993 83 0,052 7,3 258 1011 0,52572 785 157 0,008164 84 0,06 7,2 266 956 0,5736 774 154,8 0,009288 85 0,051 7,3 260 984 0,50184 779 155,8 0,0079458 86 0,075 7,3 280 887 0,66525 881 176,2 0,013215 87 0,064 7,1 236 786 0,50304 786 157,2 0,0100608 88 0,05 7,5 265 1154 0,577 764 152,8 0,00764 89 0,055 7,3 222 999 0,54945 981 196,2 0,010791 90 0,055 7,3 190 626 0,3443 893 178,6 0,009823 91 0,07 7,3 270 883 0,6181 894 178,8 0,012516 92 0,05 7,2 290 1306 0,653 898 179,6 0,00898 93 0,056 7,2 288 981 0,54936 876 175,2 0,0098112 94 0,054 7,1 243 990 0,5346 682 136,4 0,0073656 95 0,054 7,2 252 976 0,52704 961 192,2 0,0103788 96 0,054 7,3 313 1017 0,54918 876 175,2 0,0094608 97 0,061 7,5 205 879 0,53619 608 121,6 0,0074176 98 0,054 7,1 259 979 0,52866 781 156,2 0,0084348 99 0,056 7,4 198 674 0,37744 792 158,4 0,0088704 100 0,063 7,4 182 601 0,37863 884 176,8 0,0111384 101 0,058 7,5 212 874 0,50692 731 146,2 0,0084796 102 0,067 7,4 244 768 0,51456 897 179,4 0,0120198 103 0,068 7,4 264 834 0,56712 765 153 0,010404 104 0,069 7,5 226 798 0,55062 743 148,6 0,0102534 105 0,063 7,3 235 912 0,57456 633 126,6 0,0079758 106 0,051 6,9 280 1138 0,58038 896 179,2 0,0091392 107 0,082 6,8 266 751 0,61582 731 146,2 0,0119884 108 0,067 7,2 266 853 0,57151 974 194,8 0,0130516 109 0,055 6,8 313 1216 0,6688 801 160,2 0,008811 110 0,068 7,2 224 786 0,53448 892 178,4 0,0121312 111 0,068 6,9 333 1100 0,748 785 157 0,010676 112 0,069 7,3 207 834 0,57546 785 157 0,010833 113 0,053 6,7 272 1144 0,60632 895 179 0,009487 114 0,068 7,2 243 1064 0,72352 978 195,6 0,0133008 115 0,064 7,5 291 1075 0,688 889 177,8 0,0113792 116 0,051 7,3 219 963 0,49113 888 177,6 0,0090576 117 0,053 7,3 209 998 0,52894 541 108,2 0,0057346 118 0,052 6,8 302 1082 0,56264 896 179,2 0,0093184 119 0,059 7,2 264 978 0,57702 987 197,4 0,0116466 120 0,06 7,5 230 854 0,5124 559 111,8 0,006708 28
číslo dárce objem (l) ph výchozí x10 9 /l x10 9 /l x10 11 /TU v komůrce x10 6 /l x10 9 /TU 121 0,05 7,02 321 1048 0,524 807 161,4 0,00807 122 0,065 7,4 224 872 0,5668 871 174,2 0,011323 123 0,055 7,31 233 997 0,54835 889 177,8 0,009779 124 0,058 7,26 256 934 0,54172 900 180 0,01044 125 0,056 7,17 289 1041 0,58296 701 140,2 0,0078512 126 0,055 6,82 312 1334 0,7337 815 163 0,008965 127 0,054 6,98 255 1043 0,56322 815 163 0,008802 128 0,055 7,24 240 998 0,5489 672 134,4 0,007392 129 0,056 7,35 248 945 0,5292 715 143 0,008008 130 0,063 7,19 231 867 0,54621 910 182 0,011466 131 0,075 7,26 206 724 0,543 931 186,2 0,013965 132 0,05 7,41 319 1131 0,5655 618 123,6 0,00618 133 0,064 7,13 260 840 0,5376 117 23,4 0,0014976 134 0,055 7,2 278 912 0,5016 784 156,8 0,008624 135 0,051 7,25 257 1043 0,53193 845 169 0,008619 136 0,054 6,8 330 1086 0,58644 673 134,6 0,0072684 137 0,05 7,35 281 1150 0,575 886 177,2 0,00886 138 0,07 7,37 228 765 0,5355 895 179 0,01253 139 0,066 6,88 291 1168 0,77088 943 188,6 0,0124476 140 0,065 7,29 226 871 0,56615 775 155 0,010075 141 0,054 7,35 249 946 0,51084 732 146,4 0,0079056 142 0,05 7,45 267 1065 0,5325 693 138,6 0,00693 143 0,052 7,08 242 991 0,51532 661 132,2 0,0068744 144 0,05 7,27 313 1342 0,671 814 162,8 0,00814 145 0,054 7,21 277 1082 0,58428 916 183,2 0,0098928 146 0,063 7,76 269 153 0,09639 936 187,2 0,0117936 147 0,053 7,18 281 1207 0,63971 734 146,8 0,0077804 148 0,053 7,18 231 925 0,49025 896 179,2 0,0094976 149 0,05 6,9 355 1506 0,753 845 169 0,00845 150 0,05 7,25 218 992 0,496 981 196,2 0,00981 29
Ve skupině exspirovaných TB jsem provedla vyšetření u 150 přípravků. Posoudíme-li přípravky z celkového hlediska všech vybraných kritérií, požadovaných kontrolou kvality, ze 150 jich vyhovuje 116. Počet vyhovujících přípravků z hlediska ph je 132 a z hlediska počtu trombocytů 131. Požadovaný objem přípravku a počet leukocytů je vyhovující u všech vyšetřovaných přípravků. 155 Počet vyhovujících exspirovaných přípravků z hlediska kontroly kvality dle Vyhl. 143/2008 Sb. - O lidské krvi P o č e t 150 145 p ř í p r a v k ů 140 135 130 125 132 131 150 150 120 ph Trombo Leuko Objem 30
4.2 Přehled výsledků čerstvě vyrobených TB číslo dárce objem (l) ph výchozí x10 9 /l x10 9 /l x10 11 /TU v komůrce x10 9 /l x10 9 /TU 1 0,051 7,19 156 741 0,37791 708 141,6 0,0072216 2 0,051 7,1 284 1022 0,52122 543 108,6 0,0055386 3 0,064 7,29 179 753 0,48192 675 135 0,00864 4 0,051 7,14 274 1129 0,57579 867 173,4 0,0088434 5 0,059 6,96 186 734 0,43306 976 195,2 0,0115168 6 0,051 7,27 211 994 0,50694 342 68,4 0,0034884 7 0,06 7,31 330 1287 0,7722 954 190,8 0,011448 8 0,058 7,22 196 684 0,39672 409 81,8 0,0047444 9 0,062 7,44 201 812 0,50344 778 155,6 0,0096472 10 0,061 6,48 367 1555 0,94855 967 193,4 0,0117974 11 0,051 6,81 165 712 0,36312 651 130,2 0,0066402 12 0,051 6,95 188 624 0,31824 786 157,2 0,0080172 13 0,052 6,84 164 684 0,35568 906 181,2 0,0094224 14 0,067 6,88 214 850 0,5695 636 127,2 0,0085224 15 0,061 6,72 162 776 0,47336 786 157,2 0,0095892 16 0,05 6,65 232 1106 0,553 534 106,8 0,00534 17 0,051 6,79 199 739 0,37689 890 178 0,009078 18 0,059 7,36 206 941 0,55519 453 90,6 0,0053454 19 0,05 7,36 188 691 0,3455 665 133 0,00665 20 0,05 7,33 272 1017 0,5085 436 87,2 0,00436 21 0,059 7,29 178 814 0,48026 748 149,6 0,0088264 22 0,051 7,39 180 883 0,45033 876 175,2 0,0089352 23 0,05 7,9 238 101 0,0505 349 69,8 0,00349 24 0,066 7,35 167 734 0,48444 674 134,8 0,0088968 25 0,051 7,04 276 1063 0,54213 897 179,4 0,0091494 26 0,076 6,93 220 792 0,60192 548 109,6 0,0083296 27 0,051 6,92 196 813 0,41463 975 195 0,009945 28 0,054 6,92 341 1352 0,73008 945 189 0,010206 29 0,073 6,66 480 1565 1,14245 734 146,8 0,0107164 30 0,051 7,25 232 1174 0,59874 896 179,2 0,0091392 31 0,051 7,17 175 739 0,37689 673 134,6 0,0068646 32 0,051 7,23 198 952 0,48552 538 107,6 0,0054876 33 0,053 6,65 180 895 0,47435 236 47,2 0,0025016 34 0,059 6,71 299 1020 0,6018 675 135 0,007965 35 0,05 7,38 165 906 0,453 764 152,8 0,00764 36 0,06 7,35 262 998 0,5988 745 149 0,00894 37 0,059 7,35 197 856 0,50504 765 153 0,009027 38 0,061 7,4 199 826 0,50386 674 134,8 0,0082228 39 0,06 6,9 203 859 0,5154 984 196,8 0,011808 40 0,056 6,91 209 951 0,53256 685 137 0,007672 31
číslo dárce objem (l) ph výchozí x10 9 /l x10 9 /l x10 11 /TU v komůrce x10 9 /l x10 9 /TU 41 0,05 6,73 188 875 0,4375 876 175,2 0,00876 42 0,051 6,8 170 799 0,40749 896 179,2 0,0091392 43 0,061 6,82 196 888 0,54168 754 150,8 0,0091988 44 0,058 6,77 171 937 0,54346 865 173 0,010034 45 0,075 7,37 279 1013 0,75975 769 153,8 0,011535 46 0,05 7,35 458 1529 0,7645 793 158,6 0,00793 47 0,068 7,41 208 971 0,66028 875 175 0,0119 48 0,065 7,37 275 895 0,58175 576 115,2 0,007488 49 0,064 7,41 209 841 0,53824 532 106,4 0,0068096 50 0,056 6,82 315 1106 0,61936 698 139,6 0,0078176 51 0,059 6,69 322 1257 0,74163 757 151,4 0,0089326 52 0,061 6,8 316 1212 0,73932 804 160,8 0,0098088 53 0,05 6,89 186 704 0,352 705 141 0,00705 54 0,06 6,86 195 699 0,4194 670 134 0,00804 55 0,06 6,8 217 947 0,5682 743 148,6 0,008916 56 0,052 7,33 173 897 0,46644 800 160 0,00832 57 0,053 7,32 250 994 0,52682 769 153,8 0,0081514 58 0,073 7,37 257 863 0,62999 895 179 0,013067 59 0,057 7,34 196 810 0,4617 548 109,6 0,0062472 60 0,067 7,38 169 459 0,30753 885 177 0,011859 61 0,055 7,41 212 906 0,4983 793 158,6 0,008723 62 0,069 7,32 213 775 0,53475 732 146,4 0,0101016 63 0,051 7,41 171 672 0,34272 777 155,4 0,0079254 64 0,05 7,44 188 741 0,3705 895 179 0,00895 65 0,069 7,4 241 990 0,6831 439 87,8 0,0060582 66 0,05 7,45 207 813 0,4065 656 131,2 0,00656 67 0,05 7,55 199 740 0,37 732 146,4 0,00732 68 0,056 6,89 354 1200 0,672 765 153 0,008568 69 0,053 6,6 308 1217 0,64501 897 179,4 0,0095082 70 0,05 7,42 178 668 0,334 654 130,8 0,00654 71 0,05 7,4 236 1008 0,504 700 140 0,007 72 0,05 6,69 199 990 0,495 971 194,2 0,00971 73 0,05 6,66 302 1130 0,565 895 179 0,00895 74 0,054 7,36 288 1031 0,55674 980 196 0,010584 75 0,058 7,34 175 975 0,5655 703 140,6 0,0081548 76 0,055 7,28 277 1107 0,60885 804 160,8 0,008844 77 0,054 6,83 169 594 0,32076 785 157 0,008478 78 0,06 6,73 211 965 0,579 677 135,4 0,008124 79 0,074 7,21 176 657 0,48618 654 130,8 0,0096792 80 0,068 7,38 200 781 0,53108 687 137,4 0,0093432 32
číslo dárce objem (l) ph výchozí x10 9 /l x10 9 /l x10 11 /TU v komůrce x10 9 /l x10 9 /TU 81 0,06 7,29 165 812 0,4872 534 106,8 0,006408 82 0,056 7,38 253 1084 0,60704 798 159,6 0,0089376 83 0,056 7,43 275 998 0,55888 329 65,8 0,0036848 84 0,061 7,27 258 1041 0,63501 687 137,4 0,0083814 85 0,059 7,39 243 996 0,58764 548 109,6 0,0064664 86 0,052 7,35 209 717 0,37284 768 153,6 0,0079872 87 0,05 6,59 321 1264 0,632 890 178 0,0089 88 0,062 7,28 286 1100 0,682 907 181,4 0,0112468 89 0,058 7,24 343 1150 0,667 871 174,2 0,0101036 90 0,055 7,37 264 935 0,51425 546 109,2 0,006006 91 0,051 7,36 254 749 0,38199 675 135 0,006885 92 0,05 6,58 367 1214 0,607 329 65,8 0,00329 93 0,05 6,47 195 832 0,416 876 175,2 0,00876 94 0,054 7,39 287 960 0,5184 875 175 0,00945 95 0,063 7,46 229 864 0,54432 896 179,2 0,0112896 96 0,056 7,36 256 895 0,5012 786 157,2 0,0088032 97 0,055 7,38 245 916 0,5038 895 179 0,009845 98 0,05 7,43 309 1287 0,6435 886 177,2 0,00886 99 0,056 7,4 230 940 0,5264 905 181 0,010136 100 0,06 7,44 217 882 0,5292 795 159 0,00954 101 0,05 7,12 246 1052 0,526 996 199,2 0,00996 102 0,05 7,06 188 994 0,497 840 168 0,0084 103 0,054 7,17 246 1011 0,54594 754 150,8 0,0081432 104 0,05 7,15 165 946 0,473 609 121,8 0,00609 105 0,05 7,23 235 1004 0,502 559 111,8 0,00559 106 0,064 7,01 244 1101 0,70464 908 181,6 0,0116224 107 0,05 7,5 196 715 0,3575 976 195,2 0,00976 108 0,052 7,22 256 1119 0,58188 787 157,4 0,0081848 109 0,055 7,33 243 1088 0,5984 756 151,2 0,008316 110 0,057 7,36 199 779 0,44403 754 150,8 0,0085956 111 0,055 7,22 239 1006 0,5533 723 144,6 0,007953 112 0,05 7,33 201 960 0,48 675 135 0,00675 113 0,068 7,17 229 996 0,67728 564 112,8 0,0076704 114 0,05 7,4 213 890 0,445 897 179,4 0,00897 115 0,055 7,11 176 658 0,3619 674 134,8 0,007414 116 0,056 7,25 291 896 0,50176 663 132,6 0,0074256 117 0,052 7,39 145 753 0,39156 761 152,2 0,0079144 118 0,065 7,4 271 869 0,56485 531 106,2 0,006903 119 0,057 7,4 147 698 0,39786 780 156 0,008892 120 0,053 7,41 281 1011 0,53583 908 181,6 0,0096248 33
číslo dárce objem (l) ph výchozí x10 9 /l x10 9 /l x10 11 /TU v komůrce x10 9 /l x10 9 /TU 121 0,058 7,32 234 907 0,52606 856 171,2 0,0099296 122 0,06 7,35 276 945 0,567 834 166,8 0,010008 123 0,061 7,39 196 812 0,49532 876 175,2 0,0106872 124 0,058 7,4 269 961 0,55738 907 181,4 0,0105212 125 0,06 7,17 225 860 0,516 988 197,6 0,011856 126 0,05 7,01 276 1023 0,5115 796 159,2 0,00796 127 0,053 6,95 190 576 0,30528 653 130,6 0,0069218 128 0,052 7,12 274 996 0,51792 956 191,2 0,0099424 129 0,05 7,2 216 906 0,453 836 167,2 0,00836 130 0,053 6,95 206 959 0,50827 986 197,2 0,0104516 131 0,05 7,22 229 1004 0,502 894 178,8 0,00894 132 0,05 7,33 174 754 0,377 804 160,8 0,00804 133 0,054 7,04 262 1064 0,57456 877 175,4 0,0094716 134 0,066 7,03 265 991 0,65406 798 159,6 0,0105336 135 0,055 7,22 252 1012 0,5566 734 146,8 0,008074 136 0,053 7,18 186 983 0,52099 725 145 0,007685 137 0,057 6,55 241 895 0,51015 823 164,6 0,0093822 138 0,063 7,32 222 899 0,56637 564 112,8 0,0071064 139 0,066 7,3 196 688 0,45408 785 157 0,010362 140 0,062 7,35 220 917 0,56854 895 179 0,011098 141 0,06 7,4 195 764 0,4584 125 25 0,0015 142 0,059 7,24 263 968 0,57112 906 181,2 0,0106908 143 0,056 7,28 251 986 0,55216 674 134,8 0,0075488 144 0,058 7,3 197 853 0,49474 986 197,2 0,0114376 145 0,059 7,4 199 825 0,48675 784 156,8 0,0092512 146 0,059 7,31 201 856 0,50504 674 134,8 0,0079532 147 0,057 7,36 231 916 0,52212 697 139,4 0,0079458 148 0,055 7,41 211 973 0,53515 763 152,6 0,008393 149 0,053 7,15 208 946 0,50138 642 128,4 0,0068052 150 0,058 7,29 300 1521 0,88218 897 179,4 0,0104052 34
Ve skupině čerstvě vyrobených TB jsem také vyšetřila 150 přípravků. Z hlediska požadavků na kontrolu kvality jich ze 150 vyhovuje pouze 85. Při posouzení jednotlivých kritérií jich z hlediska ph vyhovuje 133 a z hlediska počtu trombocytů 94. Požadovaný objem přípravku a počet leukocytů vyhovuje u všech vyšetřovaných přípravků. 160 Počet vyhovujících vyrobených přípravků z hlediska kontroly kvality dle Vyhl. 143/2008 Sb. - O lidské krvi P o č e t p ř í p r a v k ů 140 120 100 80 60 40 20 133 94 150 150 0 ph Trombo Leuko Objem 35
5 Diskuze Z hlediska měření ph se ve sledovaném vzorku přípravků vyskytlo pouze cca 10% nevyhovujících přípravků. U žádného ze sledovaných přípravků se nejedná o snižující se hodnotu pod stanovenou dolní hranici ph 6,4. Ve většině případů dochází ke zvýšení ph nad stanovenou horní mez 7,4 pouze o několik setin. Ve 3 případech, z celkového počtu 300 přípravků obou skupin, došlo ke zvýšení ph až o několik desetin. V těchto případech došlo také ke značnému snížení počtu trombocytů v přípravcích bez ohledu na počáteční hodnoty dárce. Domnívám se, že tak markantní úbytek počtu trombocytů, ke kterému došlo v těchto případech, může mít přímou souvislost se zvýšenou hodnotou ph. Bohužel na základě 3 výsledků není možné vyvodit příslušné závěry. Bylo by vhodné pokračovat v dalším měření k nasbírání dostatečného počtu výsledků, na jejichž základě bude tato domněnka potvrzena, případně vyvrácena. Další měření bych také v konkrétních případech rozšířila o vyšetření na sterilitu přípravků. Vzhledem k chybějícím dalším výsledkům se mohu o příčině pouze dohadovat. Riziko bakteriální kontaminace není možné, za stávajících podmínek, vyloučit. Může být způsobeno bakteriemi z kůže dárce během odběru krve, bakteriémií přítomnou v krvi dárce během odběru krve, nesprávným zacházením při zpracování krve nebo poškozením konzervy. Záchyt bakteriální kontaminace je literárně u 1-2% destičkových přípravků. Následnou bakteriální kontaminaci nelze vyloučit ani u přípravků, u nichž se ph zvýšilo jen o několik setin. Pro potvrzení mých předpokladů čerstvě vyrobených TB je nutné sledovat hodnoty ph po celou dobu jejich použitelnosti. Toto měření musí probíhat v naprosto sterilním prostředí, které poskytuje pouze laminární box. Náklady na provoz tohoto zařízení pro výzkumné účely není možné přenášet na FNKV. Další nezanedbatelné náklady vyplývají z nutnosti použití přesných, kalibrovaných měřících přístrojů a z nutnosti skladovat v přesně definovaných podmínkách přípravky, které slouží pouze k výzkumným účelům a po skončení výzkumu jsou likvidovány. Z těchto důvodů se domnívám, že tato měření jsem schopna provádět pouze v rámci zadaného, dlouhodobého, výzkumu. 36
Z výsledků počtu trombocytů v TB, čerstvě vyrobených nebo exspirovaných, jednoznačně vyplývá souvislost s počátečními hodnotami trombocytů u dárce. Ve skupině exspirovaných přípravků byl kladen důraz na selekci dárců z hlediska počátečních hodnot trombocytů. U čerstvě vyrobených TB k této selekci nedošlo, a proto se zvýšil počet přípravků s nízkým počtem trombocytů. Měření tyto závěry jednoznačně dokazuje. Pro výrobu co nejvyšší výtěžnosti trombocytů v přípravku TB doporučuji provádět pečlivý výběr dárců, z jejichž plné krve se tyto přípravky vyrábějí. Navrhuji zpracovat podrobnou statistiku o potřebách těchto přípravků pro jednotlivá oddělení ve Fakultní nemocnici Královské Vinohrady i o jejich dalších prodejích jiným transfuzním stanicím v Praze. Z vlastní praxe se domnívám, že tato statistika by potvrdila můj předpoklad, že vhodná selekce dárců plné krve (dárci s vysokou hodnotou trombocytů) znamená úsporu jak z hlediska ekonomického (výrobní a skladovací náklady), tak i z hlediska kvality vyrobených přípravků. Počty leukocytů v přípravcích a objemy přípravků vyhověly ve 100% případů stanoveným požadavkům. Těchto výsledků je dosaženo především díky zpracování plné krve na automatických lisech a prováděním případné deleukotizace standardními filtry. 37
6 Závěr Hlavním cílem práce bylo zhodnotit kvalitu TB a posoudit, jak výběr dárce ovlivňuje kvalitu přípravků. Vyšetřila jsem 300 přípravků TB. Na základě získaných výsledků jsem dospěla k závěru, že souvislost výběru dárce a ph hodnoty přípravku se přímo neprokázala. Z výsledků také vyplývá, že výběr dárce ovlivňuje hodnoty trombocytů v TB a na to je potřeba se zaměřit při výrobě těchto přípravků. Jistou souvislost mezi ph a počtem trombocytů vidím ve 3 případech. U těchto přípravků došlo ke zvýšení hodnoty ph a snížení počtu trombocytů. Při potvrzení bakteriální kontaminace nelze přímou souvislost s dárcem jednoznačně vyloučit. 38
7 Seznam obrázků: Obrázek 1: Trombocyty z BUFFY-COATU a z Aferézy deleukotizované... 12 Obrázek 2: Krevní lis... 14 Obrázek 3: Třepačka... 19 39
Použitá literatura Klinické použití krve (vydavatelství Grada) Guide to the preparation, use and quality assurance of blood components Standardní operační postupy TO FNKV Vyhláška o lidské krvi, č. 148/2008 Sb. Novela zákona o léčivech č. 378/2007 Sb. 40