4.3.2. Významné metabolické produkty a substráty Kapitola zahrnuje přehled základních biochemických analytů, které se stanovují v laboratořích všech velikostí. Tyto analyty tvoří poměrně nehomogenní skupinu a to jak z hlediska analytického (metodického), tak klinického (význam a funkce v organismu). Následně je tedy kapitola rozdělena do pěti částí, které korespondují se základním dělením z pohledu obecné biochemie (struktura, funkce, metabolismus). Jedná se o proteiny, nebílkovinné dusíkaté látky, lipidy, sacharidy a barviva. V každé části jsou uvedeny základní analyty ev. analyty, které s danou problematikou souvisí a jejichž stanovení patří k běžné laboratorní praxi. Principy zde uváděných metod patří mezi doporučené rutinní metody dle EHK (Externí hodnocení kvality). Kromě toho lze použít též metody referenční (většinou ale ne v běžné praxi). Proteiny (bílkoviny) Jsou vysokomolekulární látky složené z více než 100 aminokyselin a s relativní molekulovou hmotností nad 10000. Jsou to látky amfoterní povahy. Při ph > 7 se chovají jako kyseliny a nesou záporný náboj. Při ph < 7 se chovají jako zásady a nesou kladný náboj. Elektroneutrální jsou při ph svého isoelektrického bodu. V krevním séru (plasmě) se dají prokázat stovky různých bílkovin, které se liší koncentrací, velikostí molekuly a funkcí. Většina je syntetizována v játrech a secernována do krve. V organismu plní řadu funkcí. Jsou zdrojem pro výstavbu a regeneraci buněk i tkání; zajišťují transport minerálů, lipidů, hormonů i katabolitů; podílejí se na udržení onkotického tlaku; zajišťují hemokoagulaci i fibrinolýzu; jsou energetickým zdrojem a součástí enzymů; plní některé speciální funkce (např. ochrana před volnými radikály). Principy metod používaných pro dělení, identifikaci a stanovení bílkovin jsou velmi rozdílné. K základním metodám patří metody elektroforetické (ELFO). Využívají se pro různé biologické materiály, zejména sérum (plasmu), moč a mozkomíšní mok. Pro rutinní ELFO se používá jako nosič agarosový gel nebo acetátcelulosa. Tak lze rozdělit bílkoviny krevního séra na 5 až 6 základních frakcí. Jsou to albumin a globuliny α 1, α 2, β 1, β 2, γ.
Elektroforéza bílkovin krevní plasmy v agarosovém gelu Vyhodnocení elektroforeogramu se provádí denzitometricky a poskytuje o frakcích bílkovin jen arbitrární číselné hodnoty. Pokud je známa i koncentrace celkové bílkoviny, lze jednotlivé frakce kvantifikovat. Při hodnocení výsledku je nutné počítat s faktem, že pouze frakce albuminu je homogenní (je tvořena jedinou bílkovinou). Zbylé frakce (globulinové) zahrnují množství různých proteinů, které se odlišují barvitelností, podílem na celkovém objemu a zejména funkcí. Ke kvantitativnímu stanovení jednotlivých proteinů (specifické proteiny) se používají metody imunochemické (imunoturbidimetrie, nefelometrie) v roztoku, ev. v gelu. Kromě základní zónové elektroforézy se využívá řada modifikací: agarosový gel + SDS; polyakrylamidový gel (PAAG); PAAG + SDS; kapilární elfo; izoelektrická fokusace; izotachoforesa. Pro identifikaci (průkaz) bílkovin je nejčastěji používána imunofixační elektroforéza a imunoelektroforéza. I tyto metodiky lze použít v různých úpravách pro speciální účely (např. protisměrné imunoelfo). Kromě metodik elektroforetických patří k běžným laboratorním metodám stanovení celkové bílkoviny, albuminu, specifických proteinů (jednotlivé bílkoviny krevní plasmy) a apoproteinů. Apoproteiny A, B (stanovují se nejčastěji) mají význam v metabolismu lipidů. Protože se jedná o proteinovou složku jednotlivých lipoproteinových tříd, jsou uváděny v této části. Též princip stanovení (imunochemie v roztoku) je shodný se stanovením specifických proteinů.
Celková bílkovina (TP) Referenční metoda: reakce s biuretovým činidlem. Doporučená metoda: reakce s biuretovým činidlem. Nejběžnější metoda pro stanovení bílkovin v séru. Reagují všechny látky se dvěma nebo více CONH skupinami. Peptidové vazby reagují s měďnatými ionty (Cu 2+ ) v alkalickém prostředí za vzniku modrofialového komplexu. Součástí reakčního činidla je i vinan sodno-draselný (jako komplexotvorné činidlo zabraňuje precipitaci Cu(OH) 2 ) a jodid draselný, který zabraňuje autoredukci Cu 2+. protein + Cu 2+ ph > 7 Cu protein komplex Intenzita zbarvení je úměrná koncentraci bílkoviny ve vzorku. Absorpční max.je při vlnové délce 545 552 nm. Lze použít i bichromatické uspořádání (540, 700 nm), end-point měření. Pro stanovení celkové bílkoviny v jiných biologických tekutinách (moč, mozkomíšní mok) se používají metodiky na principu turbidimetrie, nefelometrie, ev. též fotometrie. Látky reagující s bílkovinami jsou nejčastěji benzethonium chlorid, pyrogallová červeň + molybdenan sodný, Coomasie blue, ev. kyselina sulfosalicylová, kyselina trichloroctová. Podmínky měření pak závisí na výsledném produktu reakce, tj. zda vzniká zákal nebo barevný komplex. Albumin Referenční metoda není k dispozici. Doporučená metoda: fotometrické metody (BCG, BCP), imunoturbidimetrie, imunonefelometrie. Pro rutinní stanovení v séru se používají metody fotometrické. BCP (bromkrezolový purpur) se ve slabě kyselém prostředí (za přítomnosti povrchově aktivních látek) váže na albumin za vzniku červeného komplexu. Jeho množství je úměrné koncentraci albuminu ve vzorku. Absorpční max. je při vlnové délce 600 nm, end-point měření. Lze použít i polychromatické měření (600, 540, 700 nm), které zvyšuje citlivost a minimalizuje spektrální interferenci lipemie. ph 4,9 Albumin + BCP Albumin BCP komplex
BCG (bromkresolová zeleň) dává s albuminem (ve slabě kyselém prostředí) modrozeleně zbarvený komplex. Jeho množství je úměrné koncentraci albuminu ve vzorku. Absorpční max. je při vlnové délce 595 630 nm, end-point měření. ph 4,3 Albumin + BCG Albumin BCG komplex Metody imunoturbidimetrické nejsou pro tento účel časté. Za použití specifického antiséra vzniká precipitát, intenzita zákalu je úměrná koncentraci albuminu ve vzorku. Absorpční max. je při vlnové délce 340 nm. Vzhledem k vysoké koncentraci albuminu v séru a charakteru metody jsou vzorky vždy před analytickou reakcí ředěny. Imunoturbidimetrie se využívá pro stanovení albuminu zejména v moči (mikroalbuminurie). Albumin reaguje se specifickou protilátkou za tvorby precipitátu; jeho intenzita se měří při 340 nm. Pro ovlivnění stability vzniklého komplexu se přidává polyethylenglykol (PEG). PEG Albumin + anti-alb. Albumin anti-alb. komplex Tento typ měření vyžaduje sestrojení kalibrační křivky. Imunoturbidimetrie (ev. imunonefelometrie) se používá běžně pro stanovení koncentrace jednotlivých specifických proteinů a apoproteinů. Tyto reakce jsou založeny na imunochemickém principu, tj. reakci mezi antigenem (Ag) a specifickou protilátkou (Ab) za vzniku imunokomplexu (Ag Ab) = precipitát. Množství precipitátu je závislé na kvantitativním poměru Ag/Ab. Při imunochemických reakcích v roztoku by reakce měla probíhat v zóně ekvivalence; precipitát je stabilizován přídavkem PEG; intenzita zákalu je úměrná koncentraci Ag ve vzorku; absorpční max. je při vlnové délce 340 nm. PEG Ag + Ab Ag Ab Specifické proteiny (příklad): C-reaktivní protein (CRP), α 1 -kyselý glykoprotein (orosomukoid), prealbumin, transferin, imunoglobuliny IgA, IgG, IgM.
Apoproteiny: apo-ai, apo-b V některých případech (pro zvýšení citlivosti metody) je používána varianta, kdy jsou příslušné protilátky navázány na latexové částice (PETIA). Nejčastěji u stanovení CRP. Měření probíhá při 340 nm; ev. bichromaticky (340, 700 nm), end-point měření. Nebílkovinné dusíkaté látky Značnou část dusíkatých látek v séru (plasmě) tvoří bílkoviny. Mimoto jsou zde přítomny i dusíkaté látky nebílkovinné povahy. Řada z nich má diagnostický význam. Nejčastěji se jedná o látky odpadní (konečné metabolity); liší se jak svým původem a významem tak i koncentrací. Nejdůležitější je močovina (urea, diamid kyseliny uhličité), která tvoří 48% těchto látek. Močovina je konečný metabolit dusíku bílkovin (aminokyselin) a primárním produktem detoxikace amoniaku. Kreatinin (cyklický imid kreatinu) vzniká jako metabolit kreatinu a kreatinfosfátu. Kyselina močová (1,3,8 trioxopurin) je u člověka konečným produktem metabolismu purinových basí (adenin, guanin). Amoniak vzniká při degradaci dusíku aminokyselin v játrech. Jedná se o toxickou látku, která je ihned metabolizována dále na močovinu. Močovina (urea) Referenční metoda: ID-GC/MS Doporučená metoda: UV enzymová metoda (s GMD), elektrochemické stanovení (biosenzory). Všechny enzymové metody jsou založeny na specifickém štěpení ureasou. Produkty reakce je oxid uhličitý a amoniak. Ten dále reaguje s 2-oxoglutarátem za přítomnosti glutamátdehydrogenasy (GMD) a koenzymu NADH. Vzniká L-glutamát za současné oxidace NADH na NAD +. Rychlost úbytku NADH je přímo úměrná koncentraci močoviny. Průběh reakce je sledován změnou absorbance (340 nm), kinetické uspořádání. Lze měřit i bichromaticky (340, 383 nm). ureasa močovina + H 2 O 2 NH 4 + + CO 3 2-
GMD NH 4 + + 2-oxoglutarát + NADH L-glutamát + NAD + + H 2 O Při využití enzymových elektrod je ureasa zakotvena v příslušném nosiči na povrchu elektrody (možnost různého konstrukčního uspořádání). ureasa močovina + H 2 O CO 2 + 2 NH 3 NH 3 + H 2 O NH 4 OH NH 4 OH NH 4 + + OH - Lze měřit jednotlivé produkty reakcí (tj. CO 2, NH 3 v plynném stavu, NH 4 + ). Měří se vždy rozdíl potenciálu mezi měrnou a referenční elektrodou; potenciometrické stanovení. Kreatinin (KNN) Referenční metoda: ID-GC/MS, ID-LC/MS. Doporučená metoda: HPLC, Jaffé bez deproteinace, enzymové metody. Většina metod je založena na modifikacích Jaffého reakce spočívající v reakci kyseliny pikrové s kreatininem v alkalickém prostředí. Modifikace zvyšuje specifitu reakce a eliminuje vliv tzv. Jaffé pozitivních látek, které falešně pozitivně ovlivňují výsledky. Kreatinin reaguje s kyselinou pikrovou (ph > 7) za vzniku barevného komplexu (oranžově-červený). Rychlost tvorby komplexu je přímo úměrná koncentraci v séru. Absorpční max. je při vlnové délce 500 515 nm, kinetické měření. Lze měřit i bichromaticky (510, 600 nm). ph > 7 kreatinin + kys. pikrová oranžově červený komplex NaOH Enzymové metody nejsou časté, ale jejich používání se zvyšuje. Lze použít několik variant. První je založena na Tanganelliho reakci. Kreatinin je za přítomnosti
kreatindeimininasy (CRDIM) rozložen na amoniak a N-methylhydantoin. Následně (za katalýzy glutamátdehydrogenasou, GMD) vzniká z amoniaku, 2-oxoglutarátu a NADPH glutamát a NADP +. Rychlost úbytku NADPH je přímo úměrná koncentraci kreatininu. Průběh reakce je sledován změnou absorbance (340 nm), používá se kinetické uspořádání. CRDIM kreatinin N-methylhydantoin + NH 3 GMD NH 3 + 2-oxoglutarát + NADPH L-glutamát + NADP + + H 2 O Další varianta vychází z přeměny kreatininu kaskádou enzymatických reakcí na sarkosin. Jeho oxidací sarkosinoxidasou (SOD) vzniká glycin, formaldehyd a peroxid vodíku. Ten se stanoví modifikovanou Trinderovou reakcí s 4-aminoantipyrinem (4-AAP) a N-ethyl- N-sulfopropyl-m-toluidinem (TOPS) za vzniku červeně zbarveného chinoniminového komplexu. Intenzita zbarvení je úměrná koncentraci kreatininu v séru. Absorpční max. je při vlnové délce 552 nm, end-point měření. CRIMI kreatinin + H 2 O N-methylhydantoin + NH 3 NMHasa N-methylhydantoin + ATP + 2H 2 O N-karbamoylsarkosin + ADP + P i GSHase N-karbamoylsarkosin + H 2 O sarkosin + NH 3 + CO 2 SOD sarkosin + O 2 + H 2 O glycin + HCHO + H 2 O 2 POD H 2 O 2 + 4-AAP + TOPS červeně zbarvený komplex + 2H 2 O
V poslední variantě lze kreatinin převést pomocí hexokinasy a ATP na kreatinfosfát a ADP. ADP se za přítomnosti pyruvátkinasy a fosfoenolpyruvátu přemění na pyruvát a ATP. V posledním kroku laktátdehydrogenasa (LD) oxiduje NADH na NAD + za současné redukce pyruvátu na laktát. Koncentrace kreatininu je přímo úměrná úbytku absorbance (340 nm), kinetické měření. Kyselina močová (KM, UA) Referenční metoda: ID-GC/MS, HPLC. Doporučená metoda: enzymové fotometrické metody. Všechny metodiky vycházejí z oxidace kyseliny močové kyslíkem za katalýzy urikasou. Vzniká peroxid vodíku a allantoin. Koncentraci kyseliny močové lze stanovit nepřímo (stanovení vzniklého H 2 O 2 ) nebo přímo ze změny absorbance při 293 nm. U nepřímého stanovení reaguje 4-aminoantipyrin (4-AAP) a N-ethyl-N-(2-hydroxy-2- sulfopropyl)-m-toluidin (TOOS) se vzniklým peroxidem vodíku za vzniku červeně zbarveného chinoniminového komplexu. Intenzita zbarvení je úměrná koncentraci kyseliny močové ve vzorku. Absorpční maximum je při vlnové délce 520 nm, ev. 545 nm, end-point měření. urikasa kys. močová + O 2 + 2H 2 O allantoin + H 2 O 2 + CO 2 POD 2H 2 O 2 + 4-AAP + TOOS červeně zbarvený komplex + 4H 2 O Přímé stanovení vychází z faktu, že kyselina močová absorbuje světlo při vlnové délce 293 nm. Allantoin, který vzniká oxidací kyseliny močové při 293 nm neabsorbuje. Změna absorbance způsobená úbytkem kys. močové je přímo úměrná koncentraci ve vzorku. Měření je bichromatické (293, 700 nm), end-point. urikasa kys. močová + O 2 + 2H 2 O allantoin + H 2 O 2 + CO 2 (absorbuje při 293 nm) (neabsorbuje při 293 nm)
Pro stanovení lze použít i metody elektrochemické (měření úbytku kyslíku Clarkovou elektrodou po přidání vzorku do reakční směsi, která obsahuje urikasu). Stejný princip se využívá i při stanovení pomocí enzymových elektrod. Amoniak Pro stanovení amoniaku se používají enzymové metody využívající glutamátdehydrogenasu (GMD). Ta katalyzuje kondenzaci amoniaku s 2-oxoglutarátem za souběžné oxidace NADPH. Změna absorbance (340nm) způsobená úbytkem NADPH je přímo úměrná koncentraci amoniaku při kinetickém měření. Lze měřit i bichromaticky (340, 383 nm). GMD NH 3 + 2-oxoglutarát + NADPH L-glutamát + NADP + + H 2 O Specifické podmínky preanalytické fáze: Odběr do EDTA (plasma), plná zkumavka, uzavřená; ihned po odběru uchovávat a transportovat v ledové tříšti; okamžitá centrifugace (nejlépe +4 C); analýza do 20-ti (max. 30-ti) minut. Lipidy (tuky) Jsou strukturně i funkčně velmi různorodé látky a mají i rozdílné chemické vlastnosti. Převážná část lipidů je dobře rozpustná v organických rozpouštědlech (aceton, chloroform, ether) a prakticky nerozpustná ve vodě. Proto jsou v séru (plasmě) transportovány pomocí vazby na bílkoviny. Vzniklé částice se nazývají lipoproteiny. Jádro lipoproteinů tvoří nepolární triacylglyceroly a esterifikovaný cholesterol, na povrchu jsou fosfolipidy, volný cholesterol a proteiny (apoproteiny). V organismu jsou lipidy zdrojem pro výstavbu membránových buněčných útvarů, zdrojem energie a jsou prekurzory řady biologicky aktivních látek (steroidní hormony, prostaglandiny, žlučové kyseliny, aj.). K rozdělení lipoproteinů na jednotlivé třídy se využívá ultracentrifugace (dělení dle hmotnosti). Mezi starší metodiky patří elektroforéza (dělení dle pohyblivosti). Ultracentrifugací lze lipoproteiny rozdělit na 5 základních tříd: chylomikrony, VLDL, IDL, LDL, HDL.
Tab. 4.3.2. 1: Rozdělení a vlastnosti hlavních tříd lipoproteinů Typ lipoproteinu Hustota Elektroforetická Hlavní Zdroj [g/ml] pohyblivost apoprotein chylomikrony cca 0,980 zůstávají na startu tenké střevo B-48 lipoproteiny o velmi nízké hustotě (VLDL) cca 1,006 preβ játra B-100 lipoproteiny o střední hustotě (IDL) 1,006-1,019 - katabolismus VLDL B-100 lipoproteiny o nízké hustotě (LDL) 1,019-1,063 β katabolismus IDL B-100 lipoproteiny o vysoké hustotě (HDL) 1,063-1,210 α játra, tenké střevo aj. A-I (A-II) K nejběžnějším analytům patří cholesterol. Asi 70 % z celkového množství je esterifikováno; v krevním séru je součástí lipoproteinů, nejvíce LDL. Vzhledem k jeho významu (rizikový faktor rozvoje aterosklerosy) se stanovuje i cholesterol v těch třídách lipoproteinů, které mají rozhodující význam v patogenesi aterosklerosy, tj. HDL cholesterol a LDL cholesterol. Součástí lipoproteinů jsou dále triacylglyceroly. Skládají se z glycerolu, na který jsou esterovou vazbou vázány tři vyšší mastné kyseliny (převážně se 16-ti a 18-ti atomy uhlíku). Spektrum základních lipidových parametrů doplňují ještě apoproteiny A, B. Ty regulují a kontrolují metabolismus lipoproteinů, působí jako kofaktory lipolytických enzymů a zprostředkovávají vazbu lipoproteinů na specifické receptory. Lp(a) je částice řadící se do třídy LDL. Dědí se autosomálně dominantně, zvýšená koncentrace v séru (plasmě) je dána geneticky. Metabolicky nejaktivnější složkou lipidů jsou mastné kyseliny (tzv. neesterifikované FA). V séru se vyskytují hlavně kyselina olejová, palmitová a stearová. Pro většinu orgánů jsou (vedle glukosy) nejdůležitějším energetickým substrátem. Biologický poločas je velmi krátký (2 5 min). Cholesterol (TCH) Referenční metoda: ID-GC/MS; ID-LC/MS Doporučená metoda: CHOD-PAP. Protože asi 70 % cholesterolu je esterifikováno, prvním krokem stanovení je hydrolýza na volný cholesterol a mastné kyseliny za katalýzy cholesterolesterasou (CE). Cholesterol je poté (spolu s volným cholesterolem) oxidován za katalýzy cholesteroloxidasou (CHOD) na cholesten-3-on a peroxid vodíku (H 2 O 2 ). Poslední fází je oxidační kopulace 4-aminoantipyrinu (4-AAP) s fenolem za přítomnosti H 2 O 2. Reakce je katalyzována peroxidasou (POD). Vzniká červeně zbarvený chinoniminový komplex.
Intenzita zbarvení je přímo úměrná koncentraci cholesterolu ve vzorku. Absorpční max. je při vlnové délce 505 520 nm; end-point měření. estery cholesterolu + H 2 O cholesterol + FA CE CHOD cholesterol + O 2 cholesten-3-on + H 2 O 2 POD 2 H 2 O 2 + 4-AAP + fenol červeně zbarvený komplex + 4 H 2 O Poslední krok této reakce (oxidační kopulace) může být ve variantě, kdy H 2 O 2 oxiduje (katalýza POD) N, N-diethylanilin-HCl/4-AAP (DEA-HCl/AAP) na červeně zbarvený komplex. Absorpční max. je při vlnové délce 540 nm. Měření je polychromatické (540, 450, 700 nm), end-point. Triacylglyceroly (TAG) Referenční metoda: ID-GC/MS. Doporučená metoda: GPO-PAP. Triacylglyceroly jsou hydrolyzovány lipoproteinovou lipasou (LPL) na glycerol a volné mastné kyseliny. Následně je glycerol fosforylován ATP za katalýzy glycerolkinasou (GK) na glycerol-3-fosfát. Ve třetím kroku se glycerol-3-fosfát oxiduje (katalýza glycerolfosfátoxidasou GPO) na dihydroxyacetonfosfát za vzniku H 2 O 2. Poslední fází je opět oxidační kopulace 4-AAP s 4-chlorfenolem za přítomnosti H 2 O 2 a katalýzy peroxidasou (POD). Vzniká červeně zbarvený chinoniminový komplex. Intenzita zbarvení je přímo úměrná koncentraci triacylglycerolů ve vzorku. Absorpční max. je při vlnové délce 505 520 nm; end-point měření. LPL Triacylglyceroly + 3 H 2 O glycerol + 3 FA
GK glycerol + ATP glycerol-3-fosfát + ADP GPO glycerol-3-fosfát + O 2 dihydroxyacetonfosfát + H 2 O 2 POD 2 H 2 O 2 + 4-AAP + 4-chlorfenol červeně zbarvený komplex + 4 H 2 O Vzniklý glycerol (1. krok reakce) lze též stanovit užitím glyceroldehydrogenasy (GD) a NAD +. Změna absorbance při 340 nm způsobená vznikem NADH je přímo úměrná množství glycerolu. Měření je bichromatické (340, 383 nm), kinetické. GD glycerol + NAD + dihydroxyaceton + NADH + H + Další možností je stanovení ADP (2. krok základní reakce). Využívá se jeho fosforylace na ATP za přítomnosti fosfoenolpyruvátu (PEP) a katalýzy pyruvátkinasou (PK). Vzniklý pyruvát je redukován na laktát. Reakci katalyzuje laktátdehydrogenasa (LD). Současně dochází k oxidaci NADH. Změna absorbance při 340 nm je úměrná množství glycerolu ve vzorku. PK ADP + PEP pyruvát + ATP POD pyruvát + NADH + H + NAD + + laktát HDL cholesterol (přímé stanovení) Stanovení cholesterolu v HDL částicích je homogenní metoda, která již nepočítá s úpravou vzorků (separační kroky) a centrifugací. Stanovení probíhá vždy ve dvou krocích. V prvním kroku se polyanionty selektivně adsorbují na povrch lipoproteinových částic LDL, VLDL a chylomiker. Vznikají komplexy, které jsou rezistentní vůči detergentu. Zvyšuje se tak selektivita pro vlastní působení detergentu a příslušných enzymů na částice
HDL. Ve druhém kroku pak detergent rozpustí HDL částice, rozštěpí je a současně inhibuje reakci enzymů (pro stanovení cholesterolu) s LDL, VLDL a chylomikrony tak, že se souběžně adsorbuje na jejich povrch. Následně jsou estery cholesterolu a cholesterol uvolněny z HDL částic a je stanoven cholesterol metodou CHOD-PAP (viz výše). LDL, VLDL, chylomikra + polyanionty lipoprotein-polyaniont komplex (stabilní) HDL + detergent rozštěpení HDL (micelární komplexy) CE, CHOD rozštěpený HDL cholesten-3-on + H 2 O 2 POD H 2 O 2 + 4-AAP + DSBmT červeně zbarvený komplex Absorpční max. je při vlnové délce 552 600 nm. Lze použít i bichromatické měření (600, 700 nm); end-point (DSBmT = N, N-bis(4-sulfobutyl)-m-toluidin). V modifikaci této reakce lze nejprve ochránit HDL částice. Uvolnit a eliminovat cholesterol a estery cholesterolu z ostatních částic. Teprve poté je pomocí detergentu cholesterol a jeho estery uvolněn z částic HDL a následně stanoven běžným postupem CHOD-PAP. LDL cholesterol (přímé stanovení) Obdobně jako u HDL cholesterolu i toto stanovení probíhá ve dvou krocích. Nejprve je uvolněn (pomocí detergentu 1) cholesterol ze všech lipoproteinových částic vyjma LDL. Proběhne reakce (CHO-PAP) za vzniku barevného produktu. Částice LDL jsou během tohoto kroku inaktivní. Vlastní stanovení cholesterolu v LDL proběhne následně po přidání specifického detergentu 2, který rozštěpí LDL částice a uvolní k reakci cholesterol i jeho estery. Stanovení pak probíhá standardní metodou. 1. detergent 1 HDL, VLDL, chylomikra cholesterol
CE, CHOD cholesterol cholesten-3-on + H 2 O 2 POD H 2 O 2 + 4-AAP + DSBmT červeně zbarvený komplex 2. detergent 2 LDL cholesterol CE, CHOD cholesterol cholesten-3-on + H 2 O 2 POD H 2 O 2 + 4-AAP + DSBmT červeně zbarvený komplex V modifikaci tohoto stanovení je peroxid vodíku vznikající v kroku 1 eliminován reakcí s katalasou. Ta je poté inhibována azidem sodným. Pro oxidační kopulaci lze použít TOOS (N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylanilin) místo DSBmT. Stanovení neesterifikovaných mastných kyselin (NEFA) se běžně neprovádí, přestože metoda je k dispozici. Sacharidy (cukry) Představují nejdůležitější a nejrychleji využitelný zdroj energie. Fyziologicky důležité jsou zejména monosacharidy, a to jak hexosy (glukosa, fruktosa, galaktosa) tak pentosy (ribosa, deoxyribosa). Z disacharidů lze uvést (jako významné) sacharosu, laktosu a maltosu. Glukosa je nejběžnější přirozená organická sloučenina, základní monosacharid. Na základě poruch jejího metabolismu (viz kapitola 3.1.) se manifestuje závažné metabolické onemocnění diabetes mellitus. Proto patří stanovení glukosy v biologických tekutinách k základním vyšetřením. Z celého spektra vyšetření používaných k diagnostice, kontrole průběhu a úspěchu léčby lze využít stanovení glykovaného hemoglobinu a AGE látky (konečné produkty pokročilé glykace).
Aldehydická skupina glukosy (ev. jiných sacharidů) se váže na volné aminoskupiny bílkovin (zejména aminoskupinu lysinu). Tento proces se nazývá glykace. Jedná se o neenzymatický děj a jeho rychlost závisí na koncentraci glukosy. Koncentraci bílkovin lze považovat za konstantní. Glykaci podléhá též hemoglobin v erytrocytech za vzniku tří derivátů HbA 1a, HbA 1b, HbA 1c, kdy poslední frakce je vlastní stabilní ketoamin (glykovaný hemoglobin). Glykaci podléhají i proteiny. Pokud mají dlouhý poločas, podléhají změnám vedoucím ke vzniku tzv. křížových vazeb (cross-link). Postupně dochází k ireversibilní přeměně na tzv. AGE látky s odlišnými vlastnostmi než původní bílkoviny, které jsou toxické. S metabolismem glukosy (glykolýza) úzce souvisí i produkce laktátu (kyselina mléčná). Jeho stanovení se používá pro posouzení hypoxie organismu (laktátová acidóza). Glukosa Referenční metoda: ID-GC/MS Doporučená metoda: GOD-PAP fotometricky, GOD-PAP ampérometricky, metoda s hexokinasou, enzymové elektrody (biosensory). Nejčastěji používaná metoda je GOD-PAP. Glukosa je oxidována kyslíkem. Reakci katalyzuje glukosaoxidasa (GOD). Při reakci vzniká glukonolakton a peroxid vodíku (H 2 O 2 ), který následnou oxidační kopulací s 4-aminoantipyrinem (4-AAP) a fenolem dává vznik červeně zbarvenému komplexu (chinonimin). Poslední krok reakce je katalyzován peroxidasou (POD). Intenzita zbarvení je úměrná koncentraci glukosy ve vzorku. Absorpční max. je při vlnové délce 505 nm. Měření probíhá v režimu end-point. GOD D-glukosa + O 2 + H 2 O D-glukonolakton + H 2 O 2 POD 2 H 2 O 2 + 4-AAP + fenol červeně zbarvený komplex + 4 H 2 O Stále více se využívá metoda s hexokinasou. Glukosa je fosforylována ATP za katalýzy hexokinasou (HK). Vzniklý glukoso-6-fosfát je poté oxidován glukoso-6- fosfátdehydrogenasou (G-6-PD); současně je redukován NAD +. Jeden mol NAD + je redukován vždy jedním molem glukosy. Změna absorbance při 340 nm je úměrná koncentraci glukosy. Měření je end-point. Lze použít i bichromatické měření (340, 383 nm).
HK D-glukosa + ATP D-glukoso-6-fosfát + ADP G-6-PD D-glukoso-6-fosfát + NAD + D-6-fosfoglukonát + NADH + H + (Jako redox dvojici lze použít i NADP + NADP + H + ) Elektrochemické metody jsou převážně založeny na užití Clarkovy kyslíkové elektrody. Koncentrace glukosy se stanoví buď z úbytku kyslíku v reakční směsi, která obsahuje GOD a katalasu nebo pomocí enzymové elektrody (elektroda opatřená membránou obsahující GOD), ampérometrický princip stanovení. Glykovaný hemoglobin (HbA 1C ) Referenční metoda: HPLC-ESI/MS; HPLC-CE Doporučená metoda: HPLC, LC, imunochemické metody s kalibrátorem s návazností na metodu IFCC. Záznam chromatogramu a vyhodnocení glykovaného hemoglobinu Glykovaný hemoglobin (Hb vzniklý reakcí terminálních NH 2 skupin β-řetězců HbA s glukosou) je stanoven po hemolýze z plné krve. Metody HPLC, LC využívají separace na slabě kyselých ionexech. Jednotlivé frakce Hb jsou nejprve rozděleny dle jejich fyzikálněchemických vlastností v měnícím se prostředí (změna ph, koncentrace iontů).
Z chromatogramu je vyhodnocen pík pro HbA 1c. Pík není homogenní, separaci ovlivňují podmínky celého systému. Absorpční max. pro HbA 1c je při vlnové délce 415 nm. Kromě klasických separačních technik se používají i imunochemické postupy v různých variantách. Nejčastěji se jedná o inhibiční imunoturbidimetrické stanovení (TINIA). V tomto případě je pro stanovení HbA 1c ještě nutná znalost koncentrace celkového hemoglobinu (Hb). Metoda je založena na modifikaci hematinové reakce. Z hodnot obou stanovení (Hb, HbA 1c ) je vypočteno procento glykovaného hemoglobinu vzhledem k celkovému Hb a vyjádřeno ve tvaru % HbA 1c. Ke vzorku lyzované plné krve se přidá v nadbytku protilátka proti HbA 1c. Nevázaný podíl protilátky se stanoví po přidání polyhaptenového činidla obsahujícího násobné specifické epitopy HbA 1c. Polyhapten reaguje s přebytkem protilátky za vzniku nerozpustného komplexu. Rychlost reakce je měřena turbidimetricky při vlnové délce 340 nm (ev. bichromaticky při 340, 700 nm) a je nepřímo úměrná koncentraci HbA 1c ve vzorku. HbA 1c + antihba 1c komplex HbA 1c antihba 1c antihba 1c (přebytek) + polyhapten komplex antihba 1c polyhapten (nerozpustný) AGE látky Stanovení se nejčastěji provádí kompetitivní imunoanalýzou s použitím polyklonálních protilátek proti AGE. Detekce fluorometricky (emisní max. v oblasti 440 nm, po excitaci zářením o vlnové délce 370 nm). Laktát Enzymové metody využívají nejčastěji oxidaci laktátu na pyruvát za katalýzy laktátdehydrogenasou (LD). Změna absorbance (způsobená vznikajícím NADH) je úměrná koncentraci laktátu. Měření je bichromatické (340, 383 nm), end-point. LD L-laktát + NAD + pyruvát + NADH + H + Ve variantě tohoto principu lze použít oxidaci laktátu za katalýzy laktátoxidasou (LOX). Vznikající peroxid vodíku (H 2 O 2 ) poté reaguje s 4-AAP a THB (2,4,6-tribrom-3-
hydroxybenzoová kyselina) za vzniku červeného chinoniminového komplexu. Reakce je katalyzována peroxidasou (POD). Intenzita zbarvení je úměrná koncentraci laktátu ve vzorku. Absorpční max. je při vlnové délce 552 nm, end-point měření. LOX L-laktát + O 2 pyruvát + H 2 O 2 2 H 2 O 2 + 4-AAP + THB červený komplex + 4 H 2 O Pro stanovení laktátu lze použít i enzymové elektrody. Na povrch membrány je imobilizována laktátoxidasa (LOX). Vznikající peroxid vodíku (H 2 O 2 ) je dále oxidován na Pt elektrodě. Změna proudu je úměrná výchozí koncentraci laktátu ve vzorku; ampérometrické stanovení. Barviva Mezi barviva se v klinické biochemii řadí látky, které vznikají v organismu a tvoří nehomogenní skupinu. Lze je třídit z několika hledisek. Nejobvyklejší je dělení dle příbuznosti chemické struktury na barviva pyrrolová, karoteny, flaviny a melaniny. Nejvíce zastoupená jsou barviva pyrrolová, jejichž základní struktura se odvozuje od pyrrolu. Jeho čtyři jádra jsou spojena do cyklu pomocí methinových resp. methylenových můstků za vzniku heterocyklických tetrapyrrolů (porfyrinů). Jsou-li pyrrolová jádra spojena lineárně, pak se od této struktury odvozují barviva žlučová. Z pyrrolových barviv se v organismu vyskytují a nejvíce využívají v laboratorní diagnostice hemoglobin a jeho deriváty (glykovaný Hb, oxy-hb, CO-Hb, met-hb, myoglobin) a bilirubin. Bilirubin je strukturně nejednotná látka tvořená řadou tetrapyrrolů. Vzniká při štěpení hemu v poloze α z hemoglobinu. Za fyziologického ph je ve vodě téměř nerozpustný. Isomery β, γ, δ jsou rozpustnější a mohou se vylučovat močí. Isomer α na tyto rozpustnější isomery přechází na světle. Bilirubin Vzhledem k nerozpustnosti ve vodě je bilirubin α vázán na hydrofilní nosič (albumin), který umožní transport bilirubinu ve vodném prostředí. Vzniklý komplex je tvořen v molárním poměru 1:1. Při průchodu játry je bilirubin esterifikován s kyselinou
glukuronovou (mono-, diglukuronid). Tento tzv. konjugovaný bilirubin je rozpustný ve vodě. Dle vlastností a výskytu lze tedy bilirubiny rozdělit na: bilirubin nekonjugovaný, vázaný na albumin, neesterifikovaný; dle rekce s činidlem někdy označovaný nepřímý. bilirubin konjugovaný (Dbil), esterifikovaný; přímý reaguje přímo s činidlem, není nutné použít akcelerátor. Referenční metoda: Doumas Perry. Doporučené metody: Jendrassik Grof, fotometrické metody s DCA a DPD, přímá bilirubinometrie. Nejrozšířenější metody jsou založeny na kopulaci s diazoniovými solemi za vzniku barevných azoderivátů, kdy zbarvení závisí na ph, metoda Jendrassik Grof. Bilirubin přímý: Diazotovaná kyselina sulfanilová (dusitan sodný, kys. sulfanilová, nízké ph) kopuluje s bilirubinem za vzniku azobilirubinu (červený chromofor). HCl kys. sulfanilová + NaNO 2 diazotovaná kys. sulfanilová ph 1,5 bilirubin + diazot. kys. sulfanilová + NaNO 2 azobilirubin Absorpční max. je při vlnové délce 520 550 nm, end-point měření. Lze použít i bichromatické měření (540, 700 nm). Bilirubin nepřímý: Při současném použití akcelerátoru (kofein, benzoan sodný) se stanoví celkový bilirubin (tj. současně přímý i nepřímý). Reakční prostředí (akcelerátor) umožní uvolnit bilirubin z vazby na albumin. Průběh vlastní reakce stanovení je poté shodný jako u bilirubinu přímého. Literatura: 1. Doležalová V., Breinek P., Fischer J. a kol. Principy biochemických vyšetřovacích metod. I. část. Brno : Institut pro další vzdělávání pracovníků ve zdravotnictví, 1995, 234 s., ISBN 80-7013-206-X. 2. Jacobs, D.S., Oxley, D.K., DeMott, W.R. Laboratory Test Handbook, 5 th edition. Cleveland : Lexi-Comp Inc, 2001, 1031 p., ISBN 1-930598-42-4.
3. Racek, J., Eiselt, J., Friedecký, B. et al. Klinická biochemie. Praha : Galén - Karolinum, 1999, 317 s., ISBN 80-7262-023-1. 4. Burtis, C. A., Ashwood, E. R. Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3 rd Edition. Philadelphia: W. B. Saunders Co., 1999, 1917 p., ISBN 0-7216-5610-2. 5. Zima, T., Kazda, A., Průša, R. et al. Laboratorní diagnostika. Praha : Galén, 2002, 728 s., ISBN 80-7262-201-3.