HYDRAGEL ISO-PAL K20 Ref. 3022 2008/01
POUŽITÍ KITU HYDRAGEL ISO-PAL K20 kit je určen k identifikaci i kvantitativnímu stanovení izoenzymů ALP v lidském séru elektroforezou na agaróze o ph 9.1. Separované izoenzymy ALP jsou vizualizovány pomocí specifického chromogenního substrátu. Osušené gely lze vyhodnotit vizuálně a denzitometricky stanovit procentuální zastoupení jednotlivých frakcí. Každý agarózový gel je určen pro analýzu tří vzorků. Určeno pro diagnostické použití in vitro. PRINCIP TESTU Alkalická fosfatáza je metaloglykoprotein, který katalyzuje hydrolýzu řady monofosforečných esterů. Reakce je aktivována hořečnatými ionty v alkalickém prostředí. Vyskytuje se v mnoha tkáních a orgánech lidského těla - např. v játrech, kostech, střevech a v placentě. Enzymy ALP jsou kódovány třemi strukturálními geny. Dva kódují střevní a placentární frakce, třetí, "nespecifický tkáňový gen", se projevuje v nejrůznějších tkáních - v kostech, játrech a ledvinách. Izoenzymy jsou separovány dle rozdílnosti nábojů vznikajících glykosylací. Výsledkem elektroforetické migrace vzorků lidského séra na gelech HYDRAGEL ISO-PAL je rozlišení téměř všech izoenzymů ALP s výjimkou jaterní frakce (L1), kostní frakce (B) a placentární frakce (P1), jež jsou seskupeny v jednu společnou širokou frakci. Od anody ke katodě následují jednotlivé frakce v pořadí skupina L1 + B (+ P1), dále 2. frakce jater ; izoenzymu (L2), střevní izoenzymy (I1, I2, I3). Placentární izoenzym (P2), pokud existuje, je lokalizován mezi I1 a I2. U některých velmi ikterických vzorků lze detekovat komplex ALP a lipoproteinů těsně za startem, zde nazývaný lipo ISO-PAL nebo UF (ultrafast). Ke kvantitativnímu odlišení všech frakcí a zvláště izoenzymů L1 a B, sdružených v jedné zóně, se každý vzorek nanáší v duplikátu vedle sebe. Anodicky na jednom ze dvou aplikátorů se nanáší roztok lektinu (WGA - aglutinin pšeničných klíčků). Lektin vykazuje silnou afinitu pro část molekuly izoenzymů s navázanou kyselinou sialovou. Sialovou skupinu ve větším či menším množství obsahují všechny izoenzymy, s výjimkou střevních frakcí a reagují s lektinem. V průběhu elektroforetické migrace isoenzymy ALP (s výjimkou komplexu lipo ISO-PAL) procházejí zónou s aplikovaným lektinem. Lektin sám se nepatrně posouvá ke katodické straně. Nastává interakce mezi skupinami kyseliny sialové jednotlivých izoenzymů a lektinem. 1 Sialyl ISOENZYM + WGA Sialyl ISOENZYM / WGA komplex 2 Pro L1, L2, P1, P2 je interakce slabá - díky stanoveným podmínkám reakce. To vysvětluje zpomalení těchto izoenzymů ve srovnání se vzorkem naneseným ve stopě bez lektinu. Kostní frakce, která obsahuje více sialových skupin, při interakci s lektinem dostatečně precipituje a zůstává blíže aplikačnímu bodu lektinu. V některých případech se však může stát, že vazebná kapacita lektinu je překročena (např. při silně zvýšeném kostním izoenzymu jako např. při rakovině kostí nebo při aktivním kostním metabolizmu při růstu) a kostní frakce pak není kompletně precipitována a v některých případech komlex pak migruje dále anodickým směrem až pod frakci L2. Ve stopě s lektinem jsou tedy frakce L1 a P1 úplně odděleny od kostní frakce a mohou být lehce kvantifikovány. Separované izoenzymy ALP jsou vizualizovány pomocí specifického chromogenního substrátu 5-Bromo-4-Chloro- 3-Indolyl Fosfátu / Nitro Blue Tetrazol (NBT) v Aminometyl Propanolovém (AMP) pufru o ph 10.0. REAGENCIE A MATERIÁL OBSAŽENÝ V KITU HYDRAGEL ISO-PAL K20 POLOŽKY KAT. Č. 3022* Agarózové gely (připraveno k použití) 10 gelů HYDRAGEL ISO-PAL pufr (zásobní roztok) 3 lahv. po 100 ml Lectin (lyofilizát) 1 lahv. Substrát ISO-PAL (připraveno k použití) 1 lahv. 20 ml Chromogen (zásobní roztok) 1 lahv. 10 ml Odbarvovací roztok (zásobní roztok) 1 lahv. 100 ml Aplikátory (připraveno k použití) 2 bal. po 10 ks (7 zubů) Tenké filtrační papíry 1 bal., 10 ks Tlusté filtrační papíry 1 bal., 10 ks * Souprava HYDRAGEL ISO-PAL K20 obsahuje aplikátory se 7-mi zuby. Protože každý vzorek je nanášen v duplikátu, lze na každém gelu dělit 3 vzorky. Zbývající stopu lze využít k aplikaci kontrolního vzorku. PRO OPTIMÁLNÍ VÝSLEDKY : Všechny reagenty ze stejné sady musí být vždy používány společně a podle pokynů v příbalovém letáku. PROSÍME, ČTĚTE PEČLIVĚ PŘÍBALOVÝ LETÁK. 1. AGARÓZOVÉ GELY Připraveny k použití, každý gel obsahuje : agarózu 1 g/dl, alkalický pufr ph 9.1 ± 0.05 a přídavné látky nezbytbě nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. POZOR : Gely obsahují 0.10 % azid sodný, nepolykat, v případě polknutí kontaktujte lékaře. Nosné medium pro elektroforézu izoenzymů ALP. Skladování, stabilita a známky zhoršení kvality Skladujte v horizontální poloze v originálních obalech - šipkou na přední straně krabice směrem nahoru. Teplota 2-8 C. Zamezit prudkým změnám teploty - neskladovat v blízkosti oken nebo tepelného zdroje. Stabilní do doby expirace vyznačené na krabici či na obalech gelů. NEMRAZIT! - 114 - SEBIA NÁVOD - Czech
Nepoužívejte : (i) v případě nálezu krystalů nebo precipitátů na povrchu gelů a pokud struktura gelu v důsledku zmrazení změkne, (ii) jsou-li přítomny mikroby a plísně, (iii) abnormální množství tekutiny v obalu gelu (výsledek vypocení pufru z gelu v důsledku nesprávného skladování). HYDRAGEL ISO-PAL K20-2008/01 2. HYDRAGEL ISO-PAL PUFR Každá lahvička zásobního roztoku pufru se doplní do 1 litru destilovanou vodou. Pracovní roztok po zředění obsahuje : alkalický pufr o ph 9.3 ± 0.2, azid sodný, aditiva nezbytná pro zajištění optimálního provedení testu. POZOR : Zásobní roztok obsahuje 0.50% azid sodný. Nepolknout! Při požití konzultovat lékaře. Azid sodný, pokud se dostane do kontaktu s mědí, olovem a kyselinami, může vést k tvorbě explozívních nebo toxických sloučenin. Proto při likvidaci roztoku vyplachovat velkým množstvím vody! Elektroforetický pufr. Skladování, stabilita, známky znehodnocení Zásobní roztok pufru lze skladovat při pokojové teplotě nebo v ledničce. Je stabilní několik let, přinejmenším do data expirace vyznačeného na balení či lahvičkách. Zředěný pufr je stabilní po dobu 1 roku při pokojové teplotě v uzavřené láhvi. Při zjištění zákalu v roztoku, který je obvykle známkou mikrobiální kontaminace, je nutno pufr vylít. 3. LEKTIN* Lahvička obsahuje aglutinin pšeničných klíčků (Wheat Germ Agglutinin) ve stabilizované lyofilizované formě. Do lahvičky s lektinem napipetujte přesně 0.5 ml fyziologického roztoku. Lahvičku uzavřete. Zlehka promíchejte a ponechte stát 5 minut při pokojové teplotě. Poté znovu zlehka promíchejte. Vzniklý čirý roztok lektinu je hotov a připraven k použití. K reakci migrujících vzorků séra během elektroforetické separace. Skladování, stabilita a známky znehodnocení Lyofilizovaný lektin skladujte při 2-8 C. Je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu kitu nebo na štítku lahvičky. Po rozpuštění se lektin musí skladovat při 20 C, proto se doporučuje roztok rozpuštěného lektinu rozdělit na 50 µl alikvoty, zmrazit a ponechat do použití při 20 C. Roztok lze 10x zmrazit a rozmrazit bez nepříznivého účinku na provedení testu - nesmí však být v rozpuštěném stavu vystaven pokojové teplotě déle než 15 min. Zmrazený roztok lectinu je stabilní maximálně 6 měsíců při - 20 C. 4. SUBSTRÁT Lze okamžitě použít. Obsahuje BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Fosfát) v AMP pufru o ph 10.0, aditiva pro optimální provedení testu. Vizualizační roztok se připravuje těsně před použitím, přidáním 0.5 ml chromogenu do 2 ml substrátu. Vyvarujte se působení přímého světla. K přípravě roztoku pro vizualizaci. Skladování, stabilita, známky znehodnocení Skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Je stabilní o doby expirace vyznačené na obalu soupravy nebo na štítku lahvičky. Substrát může jevit mírnou krystalizaci bez nepříznivých efektů na provedení testu. 5. CHROMOGEN Chromogen je připraven k použití. Obsahuje NBT (Nitroblue Tetrazolium) ve vodném roztoku. K přípravě vyvolávacího roztoku viz bod 4. Skladování, stabilita, známky znehodnocení Skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce při 2-8 C. Stabilní do doby expirace vyznačené na obalu soupravy nebo na štítku lahvičky. 6. ODBARVOVACÍ ROZTOK Každá lahvička zásobního odbarvovacího roztoku je určena k přípravě 100 litrů pracovního odbarvovacího roztoku. Je výhodné připravovat jen 1 litr pracovního roztoku doplněním 1 ml zásobního roztoku do 1 litru destilovanou nebo deionizovanou vodou. Pracovní roztok obsahuje 0.05 g/dl kyseliny citronové. K promytí gelů po inkubaci ISO-PAL substrátem k odstranění přebytku substrátu. Skladování, stabilita, známky znehodnocení Skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Roztok je stabilní do doby expirace vyznačené na obalu soupravy nebo na štítku lahvičky. Pracovní odbarvovací roztok je stabilní 1 týden při pokojové teplotě v uzavřené láhvi. Nepřidávejte azid sodný. Nepoužívat při změně vzhledu, vzniku zákalu nebo precipitátu v roztoku. K zabránění mikrobiálního růstu v pracovním roztoku skladovaném déle než 1 týden lze přidat 5 µl/dl ProClin 300. Pracovní odbarvovací roztok s přídavkem ProClinu je stabilní v uzavřené nádobě do doby expirace vyznačené na obalu soupravy nebo na štítku lahvičky. - 115 -
7. APLIKÁTORY Jednorázové aplikátory k nanesení vzorků - připraveny k použití. Skladování Skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. 8. TENKÉ FILTRAČNÍ PAPÍRY Proužky tenkého filtračního papíru, na jedno použití. Jsou určeny k odsání přebytečné tekutiny z povrchu gelu před aplikací vzorků. Skladování Skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. 9. TLUSTÉ FILTRAČNÍ PAPÍRY K odsávání vlhkého gelu po enzymatické vizualizalizaci. Skladování Skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. * POZN. : Během transportu vydrží gely a lektin 15 dnů bez chlazení při teplotě 15-30 C bez nepříznivých efektů na provedení testu. POTŘEBNÉ REAGENTY NEOBSAŽENÉ V BALENÍ FYZIOLOGICKÝ ROZTOK Připravte 0.9 g/dl NaCl (0.15 M) roztok v destilované nebo deionizované vodě. K naředění lektinu. Skladování, stabilita, známky znehodnocení roztoku Skladuje se při teplotě místnosti nebo v chladničce. Přestaňte používat po 3 měsících nebo při změně vzhledu roztoku v důsledku mikrobiální kontaminace. Pro delší skladování lze konzervovat 0.1 g/dl azidem sodným. VYBAVENÍ A PŘÍSLUŠENSTVÍ NEOBSAŽENÉ V BALENÍ 1. Zdroj proudu : MG 300 SEBIA, kat. č. 1302 nebo MG 500 SEBIA, kat. č. 1303. 2. HYDRAGEL K20 APPLICATOR SEBIA, kat. č. 1409, včetně nosiče aplikátorů HYDRAGEL K20. 3. HYDRAGEL ENZ K20 Accessory kit, kat. č. 1422 obsahuje nosič šablony K20 a šablonu pro aplikaci reagencií ENZ 4 ml. 4. Vlhká komůrka kat. č. 1270. 5. Elektroforetická komora, K20 SEBIA, kat. č. 1400. 6. Nádobky a držáky gelů pro manipulaci s nimi HYDRAGEL K20 Accessory Kit SEBIA, kat. č. 1420. 7. Pipety 10 µl, 200 µl, 1 ml a 5 ml. 8. Sušička - Inkubátor, IS 80 SEBIA, kat. č. 1430. 9. Denzitometr / plošný skener na skenování gelových ploten 82 x 51 mm při 570 nm nebo se žlutým filtrem HYRYS SEBIA, DVSE SEBIA nebo PHORESIS softwarem pro plošný skener. 10. Materiály ke kontrole kvality. ANALYZOVANÉ VZORKY Odběr vzorků a skladování Přednost má analýza čerstvých sér, odběr musí být proveden lege artis dle ustanovených postupů příslušné laboratoře. Při okamžitém uložení vzorku do chladničky lze skladovat až 1 týden. vzorků Používejte čisté sérum. Zřeďte vzorky séra fyziologickým roztokem pro dosažení celkové aktivity zásadité fosfatasy okolo 600 IU/l. Pokud je aktivita > 600 IU/L, viz poznámka v části "DATA O VÝKONU/linearita". Nepoužívat Nepoužívejte hemolyzované vzorky interferují erytrocytární enzymy. Vzorky obsahující inhibitory ALP jako jsou EDTA, citrát a oxalát rovněž nepoužívat. PRACOVNÍ POSTUP I. MIGRACE 1. Umístěte HYDRAGEL K20 aplikátorový nosič na rovnou plochu (viz Obr. 1) a zvedněte část s očíslovanými zuby 2. Naneste 120 µl destilované nebo deionizované vody na dolní třetinu rámečku vyznačeného na nosiči aplikátoru. 3. Z obalu opatrně vyjměte agarózovou plotnu. 4. Gelovou plotnu rychle osušte tenkým filtračním papírem tak, že jej z jedné strany narolujete, aby přilnul k celé ploše a rychle odstraňte. POZOR : Neponechávejte tento filtrační papír delší dobu na povrchu hrozí dehydratace gelu! - 116 -
5. Opřete plotnu okrajem o zarážku v dolní části vyznačeného rámečku - gelem k sobě (viz Obr. 2). 6. Nyní gel ohněte a pokládejte tak, aby se voda rovnoměrně rozprostřela pod celým gelem bez tvorby vzduchových bublin. Gel musí být v rámečku zarovnán (viz Obr. 2). 7. Snižte nosič aplikátoru očíslovanými zoubky dolů do střední polohy se západkou v horní poloze. 8. Je nutné použít 2 aplikátory pro každý HYDRAGEL 7 ISO-PAL pro aplikaci vzorků séra a roztoku lektinu. Umístěte dva aplikátory pro každý HYDRAGEL 7 ISO-PAL (7 zubů pro 3 vzorky) na rovnou plochu, čísly jamek směrem vzhůru (viz Obr. 3). - První aplikátor : naneste10 µl z každého vzorku séra do 2 sousedních jamek. - Druhý aplikátor : naneste 10 µl roztoku lektinu do každé sudě očíslované jamky. - Každý aplikátor musí být napipetován ve 2 minutách. Do poslední jamky každého aplikátoru lze nanést kontrolní sérum. - Použijte aplikátory okamžitě. Pro pozdější použití vložte aplikátory do vlhké komůrky zoubky směrem nahoru (při vkládání je uchopte za ochranný plastový rámeček). Komůrka se může vložit až na 8 hodin do chladničky a analýza může být tak po tuto dobu odložena. Detaily viz v příbalovém letáku vlhké skladovací komůrky. 9. Odlomte ochranný rámeček zoubků aplikátoru. 10. Aplikátor se sérem umístěte na nosič do pozice 3. 11. Aplikátor s lektinem umístěte do pozice 4. 12. Aplikátory zablokujte např. na levé straně nosiče aplikátorů. DŮLEŽITÉ : Čísla natištěná na aplikátoru musí směřovat k obsluze (viz Obr. 4). 13. Nyní snižte nosič tak, aby se aplikátory dostaly do kontaktu s povrchem gelu a. nechte působit 15 minut. Nesnižujte prudce. 14. Po 15 minutách nadzvedněte nosič aplikátoru a aplikátory vyjměte a vyhoďte. 15. Gelovou plotnu vložte do migrační elektroforetické komory dle polarity vyznačené na gelu - dolní částí gelu na katodickou stranu. Při použití komory SEBIA K20 vložte HYDRAGELovou plotnu do zubů můstku gelem dolů a ten pak ponořte do pufru. Okraje plotny budou ponořeny asi 1 cm. Podrobnosti najdete v návodu pro migrační komoru K20. 16. Připojte dělící komoru ke zdroji proudu. PODMÍNKY DĚLENÍ Objem pufru ke každé elektrodě Celkový objem pufru Čas dělení Konstantní napětí Počáteční proud (na gel) SEBIA K20 150 ml 300 ml 45 minut 120 V 10 ± 2 ma 17. Po migraci odpojte komoru a vyjměte gelovou plotnu. II. PŘÍPRAVA INKUBACE S ISO-PAL SUBSTRÁTEM DŮLEŽITÉ : Doporučuje se předehřát inkubátor-sušičku na dobu 5 minut při teplotě uvedené níže před vložením držáku šablony K20 a gelu pro inkubaci. 1. Umístěte nosič šablony na rovnou plochu (viz Obr. 5) a sundejte jeho víko. 2. Napipetujte 120 µl destilované nebo deionizované vody na dolní třetinu rámečku vyznačeného na nosiči šablony. 3. Opřete plotnu dolním okrajem o zarážku na spodní straně natištěného rámečku (viz Obr. 6). 4. Nyní gel ohněte a pokládejte, tak aby se voda rovnoměrně rozprostřela pod celým gelem bez tvorby vzduchových bublin. Gel musí být zarovnán s natištěným rámečkem. 5. Aplikační šablonu ENZ 4 ml nastavte na nosiči následujícím způsobem (viz Obr. 7) : - umístěte aplikační šablonu na ukotvující příchytky, - držte šablonu jako za úchyt a položte ji na gel. 6. Po smíchání chromogenu se substrátem (viz bod 4) ihned aplikujte 2.5 ml roztoku ISO-PAL substrátu následujícím způsobem (viz Obr. 8) : - držte pipetu vertikálně, - lehce vtiskněte špičku pipety do otvoru v šabloně, - pečlivě napipetujte reagencii bez bublin pod šablonu. 7. Uzavřete víko nosiče šablony (viz Obr. 9). 8. Umístěte nosič šablony do inkubátoru na 30 minut při 37 C a poté na 30 minut při 51 C. III. ODSTRANĚNÍ SUBSTRÁTU A APLIKACE FILTR. PAPÍRU 1. Po inkubaci vyjměte nosič šablony z inkubátoru a umístěte na rovném povrchu. 2. Odklopte víko. 3. Odstraňte zbývající roztok substrátu : - pipetu držte ve svislé poloze a lehce vtiskněte její špičku do otvoru v šabloně, - pečlivě odsajte reagencii. 4. Odstraňte šablonu : - uchopte šablonu za úchyt, - zvedněte šablonu a vyjměte ji. 5. Ponechejte gel na podložce nosiče. 6. Na tři minuty přiložte silný filtrační papír : - nakloňte filtrační papír do úhlu cca 45, - srovnejte spodní okraj filtračního papíru se spodním okrajem gelu, - položte filtrační papír na gel, - přitiskněte filtrační papír celou plochou, tak, aby dokonale přilnul k povrchu gelu. 7. Odstraňte filtrační papír. Gel sušte 3 minuty při 51 C. 8. Opláchněte šablonu destilovanou vodou nebo etanolem a důkladně ji osušte. Před opakovaným použitím se ujistěte, že je šablona zcela suchá. - 117 -
IV. PROMYTÍ A SUŠENÍ GELU 1. Umístěte gel do držáku gelu (součást SEBIA HYDRAGEL K20 Accessory Kitu). 2. Ponořte gel vertikálně do odbarvovacího roztoku na 10 minut. Chraňte gel před přímým světlem. 3. Gel kompletně vysušte při teplotě 51 C. VI. VYHODNOCENÍ Vizuálně nebo denzitometricky / skenerem žlutým filtrem nebo při 570 nm. VÝSLEDKY Kontrola kvality Doporučuje se postavit ke každé analyzované sérii vzorků 1 dostupnou komerční kontrolu nebo známý vzorek. Hodnoty Enzymatickou aktivitu každé frakce lze vypočíst z procentuálních hodnot zjištěných denzitometricky a z celkové aktivity ALP. Z proužku s lektinem lze určit izoenzymy L1-jaterní a P1 placentární. Hodnotu kostní frakce obdržíme po odečtení denzitometrických hodnot L1 a P1 frakcí z lektinového proužku od bloku L1 + B (+ P1) v proužku bez lektinu. Všechny ostatní frakce L2, I1, I2, I3, P2 a lipo-iso-pal komplex jsou určeny ve stopě bez lektinu. Normální hodnoty Fyziologicky závisí na věku, pohlaví, těhotenství, menopauze, pubertě a lécích. U dospělých ve věku 20-50 let jsou hodnoty podobné. S věkem populace má celková ALP zvyšující tendenci díky fyziologickým faktorům. U dětí je celková ALP vyšší dominantní je kostní izoenzym. Normální hodnoty pro jednotlivé hlavní elektroforetické zóny ALP na gelech HYDRAGEL ISO-PAL byly stanoveny na zdravé populaci 100 dospělých (50 mužů a 50 žen ve věku mezi 20-50 lety) a 50ti dětí (2-18 let) : ŽENY MUŽI DĚTI % IU/L % IU/L % IU/L Celková ALP* 80 122 410 L1 18-72 45 15-71 64 1-31 51 B 20-74 44 23-75 73 62-100 370 L2 1-14 8 1-9 8 1-7 19 I1, I2, I3 Chybí u 60 % normálních subjektů, pokud přítomny nepřesáhnou 14 %. *Celková ALP byla stanovena při 37 C v AMP pufru. Doporučuje se, aby každá laboratoř stanovila své vlastní normální hodnoty. Výše uvedené hodnoty aktivity (IU/L) reprezentují maximální normální hodnoty. Normální celková aktivity ALP (IU/L) závisí na použité teplotě a proceduře k jejímu stanovení (kity a laboratorní podmínky se mohou lišit). Aktivita frakcí musí vycházet z celkové aktivity s specifikace podmínek použité metody. Interpretace K interpretaci výsledků elektroforetických dělení séra je třeba znát celkovou aktivitu ALP, pohlaví a věk pacienta. Všechny frakce, které obsahují sialylové zbytky jsou zpomaleny ve stopě s aplikovaným lektinem ve srovnání se stopou bez lektinu. Jen střevní frakce, které neobsahují sialylové zbytky, nejsou ovlivněny lektinem. Ve stopě s lektinem obvykle vytváří kostní frakce otrou, soustředěnou frakci těsně u bodu aplikace. Často lze taktéž pozorovat její rozštěpení (stín) anodickým směrem. Tento fenomén je obecně důsledkem překročení vazebné kapacity lektinu a následně neúplné precipitace, např. pokud je kostní izoenzym silně zvýšený např. při rakovině kostí nebo při aktivním kostním metabolizmu. V žádném případě toto rozštěpení (stín) nezasáhne migrační pozice L1 nebo P1 frakce, takže tyto dvě frakce mohou být denzitometricky přesně stanoveny z proužku s pektinem. Viz elektroforeogram v závěru tohoto návodu. 1. Normální sérum Jaterní (L1) a kostní (B) izoenzym jsou dvě obvykle se vyskytující frakce u zdravé populace. Na gelech HYDRAGEL 7 ISO-PAL ve stopě bez lektinu se po migraci překrývají, ve stopě s lektinem dojde k jejich oddělení. V normálním séru může být taktéž pozorován jeden až tři intestinální (střevní) izoenzymy ALP. Pokud je hladina celkové ALP v referenčních mezích, není přítomnost střevních frakcí známkou žádné patologie. Častější výskyt střevních izoenzymů lze pozorovat u osob s krevními skupinami O a B a u těch, kteří před odběrem krve nedodrží lačnění. 2. Zvláštní případy Jaterní izoenzymy Existují dva jaterní izoenzymy L1 a L2. Významnější L1 frakce je umístěna blíže k anodě. Ke zvýšení dochází u cholestázy, cirhózy, virové hepatitidy a u dalších biliárních a hepatálních patologických stavů. Ke zvýšení dochází rovněž u malignit s jaterními metastázami, u tumorů plic, zažívacího traktu a u lymfomu. Frakce L2 (makrohepatická nebo rychlá) existuje u zdravých v malém množství (< 8 IU/L). Zvýšení L2 může způsobovat cholestáza, biliární onemocnění (cirhóza, virová hepatitida), malignity (Ca prsu, jater, plic, prostaty, GIT) s jaterními metastázami. Na gelech HYDRAGEL 7/15 ISO-PAL izoenzym L2 migruje mezi (L1 + B) a intestinálními frakcemi. - 118 -
Kostní izoenzym Tento významný izoenzym je přítomen ve všech vzorcích. Při interpretaci je nutno vzít v úvahu věk. K jeho zvýšení může dojít : U malignit jako je Ca prsu s jaterními a kostními metastázami, stejně jako u osteosarkomu a lymfomu i bez metastáz. Hyperparathyreodismus, revmatické choroby, rachitis a Pagetova nemoc. Přechodná hyperfosfatázemie v dětství je sdružena se zvláštní jaterní frakcí, která migruje blíže k anodě než L1. Celková ALP je extrémně zvýšena (> 2000 IU/L). Pokud je navíc dále doprovázená zvýšením dalších frakcí (např. L1, L2), může indikovat malignitu tlustého střeva, plic a prostatu (s metastázou kostí a jater). Intestinální isoenzymy Pohyblivost střevních izoenzymů je stejná v obou stopách. Vyskytují se jako 1, 2, a 3 frakce. U 40 % zdravých osob intestinální frakce chybí. Zvýšená aktivita může být pozorována u některých onemocnění jako je jaterní cirhóza, diabetes a chronické renální poruchy. Placentární izoenzymy Vždy 2 formy izoenzymů větší P1 (90 %), menší P2 (10 %). Fyziologicky se nachází v těhotenství. Jinak je lze pozorovat u některých malignit Ca vaječníků, sarkomy, Ca pankreatu a žaludku. Zvýšení může být pozorováno u těžkých kuřáků (způsobeno poškozením plic). Komplex imunoglobulinů nebo makro-alp Tato frakce se nachází vzácně. Je to komplex s imunoglobulinem nachází se těsně za bodem aplikace v obou stopách. ALP-LP komplex Jedná se o komplex lipoproteinu a L2 jaterního izoenzymu ALP. Tato frakce se nachází se těsně za bodem aplikace v obou stopách. Může se vyskytovat u biliárního onemocnění s obstrukcí. Atypické izoenzymy Izoenzymy s atypickou migrací jako např. Nagao, Regan a Kasahara, jejich identifikace je obtížná. Omezení Viz čl. ANALYZOVANÉ VZORKY. Nebyla detekována žádná interference s HYDRAGEL ISO-PAL procedurou u vzorků s vysokou koncentrací cholesterolu ( 360 mg/dl), triglyceridů ( 1560 mg/dl) a bilirubinu ( 10 mg/dl). POZN. : Na elektroforéze je žluté zbarvení ikterických vzorků způsobené bilirubinem přítomné ve dvou frakcích. Jedno, které ko-migruje s albuminem (např. je o 10 mm rychlejší než L1 izoenzym) a druhá forma se nachází jako difúzní frakce na úrovni L2. Žluté zbarvení je virtuálně eliminováno při blottingu a promývacíh krocích vizualizační procedury. Zbytkový bilirubin neinterferuje při skenování žlutým filtrem o 570 nm. Problémy Pokud testy nevycházejí při dodržení veškerých instrukcí pro přípravu, skladování a provedení testu uvedených v příbalovém letáku, volejte Technicko- Servisní středisko vašeho dodavatele. Soupravy, reagencie, bezpečnostní listy a informace o likvidaci odpadu jsou dostupné na Technicko-Servisním středisku vašeho dodavatele. HODNOTY Denzitometr HYRYS fy SEBIA byl použit pro denzitometrická hodnocení. Reprodukovatelnost na gelu Tř různé vzorky séra (A, B a C) byly analyzovány elektroforézou na HYDRAGEL ISO-PAL K20 gelech stejné šarže. Vzorek A bylo normální sérum, B - sérum s intestinálními frakcemi I1 a I2 a vzorek C sérum se zvýšenými frakcemi L1 a L2. Každý vzorek byl testován na všech drahách jednoho gelu. Elektroforeogramy byly hodnoceny denzitometricky. Následující tabulka ukazuje průměry, SD a CV pro každou ALP frakci všech tří vzorků každého gelu. PARAMETR % L1 % B % L2 % I1 % I2 % I3 Vzorek A PRŮMĚR 59.7 35.0 5.2 / / / SD 1.4 1.5 0.3 / / / CV (%) 2.3 4.4 5.9 / / / Vzorek B PRŮMĚR 40.3 31.1 5.3 6.4 14.0 2.9 SD 0.6 0.8 0.2 0.1 0.4 0.2 CV (%) 1.4 2.7 3.3 1.5 2.7 7.3 Vzorek C PRŮMĚR 58.5 8.9 32.6 / / / SD 0.6 0.9 0.4 / / / CV (%) 1.0 9.7 1.3 / / / Reprodukovatelnost mezi gely Sedm (7) různých vzorků séra bylo podrobeno testům každý na 10ti gelech HYDRAGEL ISO-PAL K20 stejné šarže. Průměr, SD a CV (n = 10) byly kalkulovány pro každý vzorek a každou AP frakci. Výsledky byly obecně stejné pro všechny vzorky. Následující tabulka ukazuje rozsahy SD a CV reprezentující všechny vzorky a průměrné CV vypočítané ze směsného CV pro všechny vzorky. - 119 -
FRAKCE SD CV (%) PRŮMĚR CV (%) L1 0.3-2.0 0.6-18.2 5.3 P1 0.9-1.7 2.6-3.3 2.9 B 0.5-1.8 0.6-8.5 6.2 L2 0.1-0.5 1.5-21.3 8.4 P2 0.3-0.8 3.0-7.9 5.4 I1 0.2 2.6-10.0 6.3 I2 0.2 1.7 1.7 I3 0.2 6.2-21.6 13.9 Přesnost Srovnávací studie Šedesát (60) různých vzorků séra (normálních i patologických) bylo analyzováno pomocí HYDRAGEL ISO-PAL K20 soupravy fy SEBIA a jiného, komerčně dostupného elektroforetického systému pro stanovení izoenzymů ALP. Hodnoty stanovené na obou systémech byly srovnatelné. Výsledky lineární regresní analýzy denzitometrických hodnot L1, B a L2 frakcí (n = 60) jsou vyneseny v následné tabulce (y = hodnoty SEBIA). Parametr Korelační koef. y - úsek Sklon Rozsah IU/L hodnot (na SEBIA systému) L1 frakce 0.991-0.241 0.979 17-603 B frakce 0.974-2.442 1.016 4-401 L2 frakce 0.992 3.551 1.003 0-277 Citlivost Jeden sérový vzorek s I1, I2 a I3 frakcemi a jiný s P1 a P2 frakcema byly následně ředěny a tato ředění byla elektroforeticky analyzována na HYDRAGEL ISO-PAL K20 gelech. Nejnižší detekovaná aktivita jednotlivých denzitometricky stanovených izoenzymů byla 3.0 IU/L. Linearita Byly použity dva vzorky : č. 1 obsahující L1 a L2 (celková ALP 1000 IU/L) a č. 2 obsahující L1 a B (celková ALP 600 IU/L). Následná ředění v rozsahu 1000-10 IU/L a 600-50 IU/L, byla analyzována na HYDRAGEL ISO-PAL K20 gelech. Systém byl lineární ve studií požadovaném rozsahu. POZN. : Maximální hodnota zúženého rozsahu studie linearity (600 IU/L) byla vzata jako přibližná cílová hodnota pro ředění vzorků s vysokou celkovou aktivitou AP. ELEKTROFOREOGRAM + L1 Bone { L1 P1 P1 L2 L2 I1 P2 I2 I3 I1 P2 I2 I3 WITHOUT lectin _ WITH lectin Bone lipo-alp complex at application point - 120 -
BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAPHY 1. Bayer PM. Intestinal alkaline phosphatase and the ABO blood group system. A new aspect. Clin. Chem. Acta, 1980, 108, 81-87. 2. Farley J et al. Skeletal alkaline phosphatase activity in serum. Clin. Chem., 1995, 41, 1551-1553. 3. Faure G et al. Les phosphatases alcalines : aspect génétique, identification et interprétation clinique. Ann. Biol. Clin., 1990, 48, 119-125. 4. Fishman WH. Alkaline phosphatase isoenzymes : Recent progress. Clin. Biochem., 1990, 23, 99-104. 5. Foucault P. Interêt de l étude des phosphatases alcalines totales et de l isoenzyme osseuse dans une population de sujets atteints d ostéoporose. Ann. Biol. Clin., 1991, 49, 477-481. 6. Kuwana T et al. Reference limits of bone and liver alkaline phosphatase isoenzymes in the serum of healthy subjects according to age and sex as determined by wheat germ lectin affinity electrophoresis. Clin. Chem. Acta, 1988, 173, 273-280. 7. Mc Kenna MJ, Hamilton TA, Sussman HH. Comparison of human alkaline phosphatase isoenzymes. Structural evidence for three protein classes. Biochem. J., 1979, 181, 67-73. 8. Moss DW. Alkaline phosphatase isoenzymes. Clin. Chem., 1982, 28, 2007-2016. 9. Moss DW. Diagnostical aspects of alkaline phosphatase and its isoenzymes. Clin. Biochem., 1987, 20, 225-230. 10. Piva MT. Détection de métastases hépatiques d un cancer digestif. Interêt des phosphatases alcalines, de leur isoenzyme macromoléculaire et de la ceruléoplasmine. Ann. Biol. Clin., 1997, 55, 209-214. 11. Rosalki SB et al. Lectin affinity electrophoresis of alkaline phosphatase for the differentiation of bone and hepatobiliary disease. Electrophoresis, 1989, 10, 604-611. 12. Saheki S et al. Intestinal type alkaline phosphatase hyperphosphatasemia associated with liver cirrhosis. Clin. Chem. Acta, 1992, 210, 63-73. 13. Schiele F, Henny J, Hitz S, PetitClerc C, Gueguen R, Siest G. Total bone and liver alkaline phosphatases in plasma : biological variation and reference limits. Clin. Chem., 1983, 23, 634-641. 14. Van Hoof VO, Lepoutre LG, Hoylaerts MF, Chevigne R, De Broe ME. Improved agarose electrophoretic method for separating alkaline phosphatase isoenzymes in serum. Clin. Chem., 1988, 34, 1857-1862. 15. Van Hoof VO and Van Mullen M. Comparison of two commercially available systems for the electrophoretic separation of alkaline phosphatase isoenzymes. J. Chrom., 1993, 646, 235-243. 16. Van Hoof VO et al. Interpretation and clinical significance of alkaline phosphatase isoenzyme patterns. Clinical Lab. Sci., 1994, vol 31, issue 3. 17. Van Hoof VO. Alkaline phosphatase isoenzyme patterns in malignant disease. Clin. Chem., 1992, 38, 2546-2551. 18. Vergote I. Placental alkaline phosphatase as a tumor marker in ovarian cancer. Obstet-Gynecol., 1987, 69, 228-232. 19. Woitge MW et al. Comparison of total and bone-specific alkaline phosphatase in patients with non skeletal disordey or metabolic bone diseases. Clin. Chem., 1996, 42, 1796-1804. 20. Wolf P. Clinical significance of serum high molecular mass, alkaline phosphatase, alkaline phosphatase lipoprotein X complex and intestinal variant alkaline phosphatase. J. Clin. Lab. Anal., 1994, 8, 172-176. 21. Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d un test de diagnostic ou de dépistage, sensibilité, spécificité. Impact- Internat, 1986, Sept : 93-97. - 130 -
1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 HYDRAGEL ISO-PAL K20-2008/01 SCHÉMAS / FIGURES Figure 1 Figure 2 Figure 3 Figure 4 1 2 3 4 5 6 7 Figure 5 Figure 6-131 -
SCHÉMAS / FIGURES Figure 7 Figure 8 Figure 9-132 -