Stanovení pohlaví plodu z fetální DNA volně kolující v krvi matky

Stanovení pohlaví plodu z fetální DNA volně kolující v krvi matky Na základě nedávného objevu volné cirkulující DNA v mateřské krvi je možné stanovit pohlaví plodu (bez nutnosti odběru plodové vody či choriových klků a s tím spojeným rizikem) z žilní krve matky již od 10. týdne těhotenství. Neinvazivní stanovení pohlaví plodu pomocí real-time PCR analýzy volné fetální DNA (cffdna) je založeno na detekcí Y specifických sekvencí DNA (gen SRY, DYS14) v krevní plazmě těhotných žen. Z klinického hlediska je určení pohlaví plodu důležité v případě rizika výskytu genetické choroby u nositelek onemocnění vázaných na pohlaví (př. hemofilie, CAH). Materiál pro vyšetření: min. 10 ml venózní krve matky odebrané do EDTA (označené minimálně dvěma identifikačními symboly: jménem a datem narození (nebo rodným číslem pacienta) transport do laboratoře v co nejkratší době (max. 4 hodin od odběru) při teplotě 2-8 C Metoda detekce: Izolace volné cirkulující fetální DNA (cffdna) z plazmy matky. Stanovení pohlaví plodu je založené na real-time PCR detekci specifických sekvencí na Y chromosomu (SRY, DYS14). Limitace metody: Citlivost a specificita detekce mužského pohlaví plodu po 10. týdnu těhotenství z řádně odebraného vzorku periferní krve matky se uvádí přibližně 98%. Přestože jsou výsledky tohoto testu velmi přesné, nelze vyloučit všechny možné eventuality, které mohou vést ke zkreslení výsledku (chromozomální abnormality/mozaicismus u matky i plodu, vícečetná těhotenství/zamlklý plod, krevní transfuse a transplantace kmenových buněk u matky). Transport vzorků do laboratoře zajištěn svozem CGB laboratoře a.s. Délka trvání vyšetření a způsob vydání závěrečné zprávy: požadované vyšetření pohlaví a vydání závěrečné zprávy je realizováno do 7-10 pracovních dnů po převzetí vzorku závěrečné zprávy o výsledku jsou z laboratoře hlášeny, zasílány písemně pouze zadavateli vyšetření

Stanovení pohlaví plodu z fetální DNA volně kolující v krvi matky Nejčastější metodou používanou pro přesné určení pohlaví plodu je vyšetření DNA z plodové vody nebo choriových klků. Tato metoda ovšem vyžaduje invazivní výkony, tj. amniocentézu či odběr choriových klků, které sebou nesou riziko potratu 0,5 1%. Nedávný objev volné fetální DNA kolující v krvi matky umožnil neinvazivní stanovení pohlaví plodu již od 10. týdne těhotenství s přesností ~98%. Pro toto vyšetření se DNA plodu získává z krve odebrané z žíly matky, což nijak neohrožuje zdraví plodu ani matky. Z klinického hlediska je určení pohlaví plodu důležité v případě rizika nějaké genetické choroby vázané na určité pohlaví (např. hemofilie). Podmínkou je podpis informovaného souhlasu. http://cytogenetika.cz/index.php?id=43 V současné době je možné toto vyšetření provádět jen z genetické indikace u nositelek nemocí vázaných na pohlaví. Volná fetální DNA v mateřské plazmě (cffdna) pocházející z apoptotických buněk trofoblastu je používána k neinvazivní prenatální diagnostice (bez nutnosti odběru plodové vody či choriových klků). Na OLG FN Brno již byla zavedena a klinicky validována metoda analýzy cffdna pro stanovení pohlaví plodu a zjišťování Rh skupiny plodu u Rh negativních matek. OLG FN Brno pokračuje ve vývoji diagnostických metod založených na cffdna. Naším nejbližším cílem je neinvazivní diagnostika nejčastějších fetálních aneuploidií stanovením relativní četnosti chromozom specifických fragmentů celkové volné DNA v mateřské plazmě metodou masivního paralelního sekvenování Neinvazivní určení pohlaví plodu (bez nutnosti odběru plodové vody či choriových klků) na úrovní DNA je možné díky nedávnému objevu volných nukleových kyselin kolujících v krvi matky. Stanovení pohlaví plodu touto metodou je možné již od 11. týdne těhotenství s přesností ~98%. Pro koho je vyšetření určeno: pro speciální případy indikované klinickým genetikem Požadavek na vzorek: plná krev (nutné odebrat 2 zkumavky s krví 2-5ml ) v K3EDTA; transport v co nejkratší době při 4-9 C

Termín výsledků: 7 dnů Stanovení pohlaví plodu z fetální DNA volně kolující v krvi matky Nejčastější metodou používanou pro přesné určení pohlaví plodu je vyšetření DNA z plodové vody nebo choriových klků. Tato metoda ovšem vyžaduje invazivní výkony, tj. amniocentézu či odběr choriových klků, které sebou nesou riziko potratu 0,5-1%. Další možností je ultrazvukové vyšetření pohlaví plodu, které je v 11.-14. týdnu těhotenství spolehlivé pouze na 86%. Nedávný objev volné fetální DNA kolující v krvi matky umožnil neinvazivní stanovení pohlaví plodu již od 11. týdne těhotenství s přesností ~98%. Pro toto vyšetření se DNA plodu získává z krve odebrané z žíly matky, což nijak neohrožuje zdraví plodu ani matky. Z klinického hlediska je určení pohlaví plodu důležité v případě rizika nějaké genetické choroby vázané na určité pohlaví (např. hemofilie). Souhrn: Projekt PRENASCAN Asociace Center lékařské genetiky ČR ( www.aclg.cz) zavádí do klinické praxe neinvazívní prenatální test trisomie (NIFTY) chromozomů č.21 - Downova syndromu, č.18 - Edwardsova syndromu a č. 13 - Patauova syndromu. Metodika: V závislosti na fetální frakci (5-25% celkové volné DNA- zvyšuje se během těhotenství) je statisticky hodnocena relativní četnost standardizovaných volných fragmentů DNA v mateřské plasmě příslušejících ke sledovaným chromozomům. Trisomie je vysoce pravděpodobná, pokud se relativní zvýšení četnosti fragmentů určitého chromozomu blíží polovině hodnoty fetální frakce. K vyšetřování se používají standardní techniky celogenomové masivní paralelní sekvenace (MPS) volné DNA mateřské plasmy na přístrojích třídy HiSeq (Illumina) spojené s bioinformatickou analýzou výsledků. Relativní četnost fragmentů se porovnává metodou z-score. Efektivita: Tato opakovaně validovaná metoda vyšetření volné DNA plodu v krvi matky diagnostikuje trizomie chromozomů č. 21, 18 a 13 plodu se senzitivitou nad 99 %. Celogenomová MPS volné DNA má potenciál pro neinvazivní prenatální diagnostiku i dalších genetických vad. Indikace: PRENASCAN může být indikován po 12. týdnu těhotenství po genetické konzultaci:

Zvýšeném riziku trisomie chromozomu č.21,13 a 18 Atypickém výsledku screeningu s hraničním rizikem. Věku nad 35 let. Obavách o osud gravidity. Suspektním závěru genealogické studie. Limitace testu PRENASCAN Časté trisomie jsou příčinou pouze přibližně 50 % závažných vrozených vad, takže současný PRENASCAN není univerzální prenatální test. V mnoha případech je indikováno invazivní prenatální vyšetření a přímé vyšetření vzorku buněk plodu metodami molekulární genetiky. Diagnostická senzitivita-více než 99 % případů nejčastějších trisomií - je srovnatelná s přímým invazivním vyšetřením tkání plodu. Není ale vyloučena i když nízká - falešná negativita testu. Specificita testu je též vysoká - kolem 99%. Stále tedy zbývá - i když nízké- riziko falešně pozitivního výsledku tohoto testu. Proto v případě pozitivního výsledku je doporučováno jej ověřit invazivním vyšetření choriových klků (CVS) nebo plodové vody (AMC). Výsledky tohoto testu mohou být zkresleny pokud sama matka má chromozomální odchylku, pokud je test proveden v časném těhotenství kdy ještě není v krvi matky dostatek volné DNA plodu, nebo pokud má plod vzácnou kombinaci chromozomálních odchylek (např chimerismus, mikrokduplikace, mikrodelece) Výsledky testu také mohou být zkresleny cizí DNA pokud matka dostala trasfuzi nebo je po transplantaci kmenových buněk. V určité části vzorků (v řádu procent) není zjištěna dostatečná kvalita volné DNA a test je nutno opakovat. Organizace vyšetření PRENASCAN je prováděn ve Sdružení Center lékařské genetiky ČR a společnosti BGI. Za Sdružení vystupují v České republice jednotliví členové asociace Center lékařské genetiky ČR www.aclg.cz, kteří test indikují, připravují vzorky k vyšetření, uzavírají a interpretují výsledky testů a provádějí následná genetická vyšetření. Tyto úvahy vycházejí ze zjištění, že lze detekovat fetální jaderné elementy (například erytroblasty) v mateřském oběhu nebo přímo volnou DNA fetálního původu v séru matky. Invazivní diagnostika je sice spolehlivá, je však spojena sice s malým, ale nikoliv nezanedbatelným rizikem pro plod (asi jednoprocentním). Hlavní limitací neinvazivní diagnostiky zůstávají malé objemy fetálního materiálu v mateřském oběhu - jedna fetální buňka na 104 až 109 mateřských buněk. Fetální DNA tvoří asi tři až šest procent celkové DNA v mateřské plazmě s ještě menšími množstvími v mateřském séru. Po porodu fetální DNA rychle mizí z mateřského oběhu a už dvě hodiny po něm se nedá

detekovat. Hladiny fetální DNA jsou zvýšené u těhotných s chromozomálními aberacemi. Zcela novým odvětvím je analýza plazmatické RNA, od které se očekává možnost neinvazivní diagnostiky genové exprese. Neinvazivní prenatální diagnostika by sice znamenala revoluci v dosavadních postupech ke stanovení karyotypu plodu, ale zatím je stále ve stadiu experimentu. Metodika: V závislosti na fetální frakci (5-25% celkové volné DNA- zvyšuje se během těhotenství) je statisticky hodnocena relativní četnost standardizovaných volných fragmentů DNA v mateřské plasmě příslušejících ke sledovaným chromozomům. Trisomie je vysoce pravděpodobná, pokud se relativní zvýšení četnosti fragmentů určitého chromozomu blíží polovině hodnoty fetální frakce. K vyšetřování se používají standardní techniky celogenomové masivní paralelní sekvenace (MPS) volné DNA mateřské plasmy na přístrojích třídy HiSeq (Illumina) spojené s bioinformatickou analýzou výsledků. Relativní četnost fragmentů se porovnává metodou z-score. Efektivita: Tato opakovaně validovaná metoda vyšetření volné DNA plodu v krvi matky diagnostikuje trizomie chromozomů č. 21, 18 a 13 plodu se senzitivitou nad 99 %. Celogenomová MPS volné DNA má potenciál pro neinvazivní prenatální diagnostiku i dalších genetických vad. Indikace: PRENASCAN může být indikován po 12. týdnu těhotenství po genetické konzultaci například při Zvýšeném riziku trisomie chromozomu č.21,13 a 18 při biochemickém screeningu. Atypickém výsledku screeningu s hraničním rizikem. Věku nad 35 let. Obavách o osud gravidity. Suspektním závěru genealogické studie. Limitace testu PRENASCAN Časté trisomie jsou příčinou pouze přibližně 50 % závažných vrozených vad, takže současný PRENASCAN není univerzální prenatální test. V mnoha případech je indikováno invazivní prenatální vyšetření a přímé vyšetření vzorku buněk plodu metodami molekulární genetiky. Diagnostická senzitivita-více než 99 % případů nejčastějších trisomií - je srovnatelná s přímým invazivním vyšetřením tkání plodu. Není ale vyloučena i když nízká - falešná negativita testu. Specificita testu je též vysoká - kolem 99%. Stále tedy zbývá - i když nízké- riziko falešně pozitivního výsledku tohoto testu. Proto v případě pozitivního výsledku je doporučováno jej ověřit invazivním vyšetření choriových klků (CVS) nebo plodové vody (AMC). Výsledky tohoto testu mohou být zkresleny pokud sama matka má chromozomální odchylku, pokud je test proveden v časném těhotenství kdy ještě není v krvi matky dostatek volné DNA

plodu, nebo pokud má plod vzácnou kombinaci chromozomálních odchylek (např chimerismus, mikrokduplikace, mikrodelece) Výsledky testu také mohou být zkresleny cizí DNA pokud matka dostala trasfuzi nebo je po transplantaci kmenových buněk. V určité části vzorků (v řádu procent) není zjištěna dostatečná kvalita volné DNA a test je nutno opakovat. Nejvýznamnějším zdrojem extracelulárních fetálních nukleových kyselin (DNA a RNA) pro účely neinvazivní prenatální diagnostiky jsou apoptotická tělíska trofoblastu. V této práci jsme se zaměřili na studium fragmentace extracelulární DNA přítomné v mateřské cirkulaci u 6 těhotných žen v 16. týdnu gravidity. Fragmentovaná extracelulární DNA byla separována podle délky jednotlivých fragmentů metodou gelové elektroforézy a v jednotlivých sekcích o molekulové hmotnosti 100 300 bp, 300 500 bp, 500 700 bp, 700 900bp, > 900 bp byla stanovena koncentrace fetální a celkové směsné DNA pomocí PCR v reálném čase s využitím specifických primerů a TaqMan sond pro SRY a GLO geny. Fetální DNA byla detekována pouze ve fragmentech o molekulové hmotnosti 100 300 bp a 300 500 bp. Největší koncentrace fetální DNA se vyskytovala v sekci o molekulové hmotnosti 100 300 bp, kde dosáhla hodnot 14,8 kopií/ml periferní krve matky (rozpětí 1,56 83,2). V sekci o molekulové hmotnosti 300 500 bp bylo detekováno menší množství fetální DNA o koncentracích 1,53 kopií/ml periferní krve matky (rozpětí 0 10,8). V sekcích o molekulové hmotnosti 500 700 bp, 700 900 bp a > 900 bp nebyla fetální DNA detekována. Fetální DNA byla ve frakci o molekulové hmotnosti 100 300 bp 4,8násobně zkoncentrována (rozpětí 0krát 16,6krát) ve srovnání s fetální DNA přítomnou v neseparované extracelulární DNA, která se po izolaci z mateřské plazmy používá pro detekci paternálních alel u plodu. Pokud se zaměříme na izolaci DNA o velikosti fragmentů 100 300 bp, získáme koncentrovanější ale nikoliv purifikovanou fetální DNA. Obsah fetální DNA v této frakci činil 1,15 % (rozpětí 0,16 8,0) ve srovnání s neseparovanou extracelulární DNA, kde podíl fetální DNA tvořil pouze 0,29 % (rozpětí 0,06 1,78). Z naší studie je zřejmé, že metoda koncentrace fetální DNA pomocí separace fragmentované extracelulární DNA izolované z mateřské plazmy prostřednictvím gelové elektroforézy není vhodná pro rutinní účely. EMQN identification number: 051 Case 2 Name: Emily ENSOR Date of birth: 21/09/1989 Gestational age: 13+1 THE NON-INVASIVE FETAL SEX DETERMINATION USING REAL-TIME PCR ANALYSIS OF CELL-FREE FETAL DNA (cffdna) FROM MATERNAL BLOOD. Method: Isolation of cffdna from plasma using the Magna Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I-Large Volume (Roche). Fetal sex determination is based on real-time PCR

detecting the presence of the sex-determining region of the Y chromosome (SRY, DYS14 genes). Result: POSITIVE for the presence of Y-chromosome specific sequences (SRY, DYS14). Positive Y chromosome DNA test confirms the presence of a male fetus in the recent pregnancy. Interpretation: Congenital adrenal hyperplasia (CAH) is an autosomal recessive disorder, fetus has a risk 25% for CAH, but male fetus has not a risk of genital malformations. Genetic counseling is recommended. If mother will know exact diagnosis of CAH, CVS or amniocenthesis with mutation analysis must be done. If she will not, newborn baby must be treated with Hydrocortison and Fludrocortison and clinical, biochemical a genetic examination is necessary. If she is treated with Dexamethason, it is possible treatment to terminate. Sensitivity and specificity of the detection of male fetuses at 10 weeks of gestation for properly collected maternal blood samples is 99%. Metodika: Izolace cffdna z plazmy pomocí Magna Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I-Large Volume (Roche). Stanovení pohlaví plodu je založené na real-time PCR detekci specifických sekvencí na Y chromosomu (SRY, DYS14). Neinvazivní stanovení pohlaví plodu pomocí real-time PCR analýzy volné fetální DNA (cffdna) z periferní krve matky. Výsledek: Byly detekovány Y specifické sekvence (DYS14, SRY). Závěr: Nález odpovídá plodu mužského pohlaví. Interpretace: Citlivost a specificita detekce mužského pohlaví plodu po 10. týdnu těhotenství z řádně odebraného vzorku periferní krve matky se uvádí přibližně 98%. Přestože jsou výsledky tohoto testu velmi přesné, nelze vyloučit všechny možné eventuality, které mohou vést ke zkreslení výsledku (chromozomální abnormality/mozaicismus u matky i plodu, vícečetná těhotenství/zamlklý plod, krevní transfuse a transplantace kmenových buněk u matky). Výsledek testu by měly být konzultován s klinickým genetikem. Případně by měl být potvrzen diagnostickou invazivní metodou.

Výsledky testu mohou být zkresleny pokud sama matka má chromozomální odchylku, pokud je test proveden v časném těhotenství, kdy ještě není v krvi matky dostatek volné DNA plodu. Výsledek mohou být také zkresleny cizí DNA, pokud matka dostala trasfuzi nebo je po transplantaci kmenových buněk. které mohou být způsobeny mozaicismem nebo dalšími okolnostmi. Aneuploidie pohlavních chromozomů nejsou hodnoceny u vícečetného těhotenství. Výsledek testu může být zkreslaný, pokud je test proveden před 12. týdnem těhotenství nebo pokud matka dostala krevní transfusi, je po transplantaci nebo terapii kmenovými buňkami. CffDNA nenahrazuje přesnost a preciznost prenatální diagnostiky s CVS nebo aminocentézy. Volná fetální DNA nenahrazuje přesné diagnostické metody jako je odběr choriových klků (CVS) a odběr plodové vody (amniocentéza).