INTERAKCE BUŇKA- MATERIÁL E. Filová1, F. Rypáček2, V. Proks2, D. Kubies2, L. Machová2, M. Kumorek2, V. Lisá1, E. Brynda2, T. Riedel2, M. Houska2, M. M. Kumorek2, J. Chlupáč1, E. Pamula3, J. Buczynska3, P. Dobrzynski3, A. Shard4, N.A. Bullett4, L. Joska5, L. Bačáková1 1Oddělení biomateriálů a tkáňového inženýrství, Fyziologický ústav AVČR, Vídeňská 1083, 142 20 Praha, filova@biomed.cas.cz 2 Oddělení biomateriálů a bioanalogických systémů, Ústav makromolekulární chemie, AVČR, Heyrovského nám. 2, 162 06 Praha 6 3Department of Biomaterials, Faculty of Materials Science and Ceramics, AGH University of Science and Technology, Al. Mickiewicza 30, Krakow 30-059, Poland 4Department of Engineering Materials, University of Sheffield, Sir Robert Hadfield Building, Mappin Street, Sheffield, UK S1 3JD 5Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Ústav kovových materiálů a korozního inženýrství, Technická 5, 166 28 Praha 6-Dejvice
Obsah: Mezibuněčné spoje Mezibuněčná hmota Mechanosensing Interakce buňka-materiál
Buněčné spoje v tenkém střevě
Hlavné typy mezibuněčných spojů u živočichů Těsné spoje jsou charakteristické pro epitely; ostatní spoje v modifikované podobě také v různých mimoepiteliálních tkáních.
Tight junction Těsný spoj: Bráni průniku extracelulárních molekul z jedné strany epitelu na druhou stranu Zabezpečuje jednosměrný průnik živin (glukózy) ze střeva do krve Difusní bariéra Ukotvuje transportní proteiny na správném místě membrány
Tight junction
Gap junctions- mezerový spoj 2-4 nm štěrbina mezi buňkami, velikost porů je 1,5 nm, pro průchod malých molekul do 1200 Da (ne NK, proteiny, polysacharidy) Interagující plasmatické membrány dvou sousedních buněk. Přiložené dvojné vrstvy lipidů prostoupeny proteinovými komplexy (konexony) složenými ze šesti stejných proteinových podjednotek, tzv. konexinů. Dva konexony se spojují a přemosťují štěrbinu mezi buňkami a vytváří mezi nimi pro vodu propustný kanál. Lodish, Molecular cell biology
Gap junctions V různých tkáních odlišná permeabilita a řízení Gap junctions v důsledku odlišných connexinů a heteromerických connexonů Dynamické struktury, asemblují a rozpadají se po několika hodinách Otevírají se a zavírají na stimuly (napětí, membránový potenciál, ph, koncentrace Ca 2+, neurotransmitery, apod.) Průnik malých molekul: ionty, cukry, aminokyseliny, nukleotidy, vitamíny, camp, IP 3.
Aktinový cytoskelet α-aktin - u svalových buněk β-aktin a λ-aktin- u ostatních buněk G-globulární aktin F fibrilární aktin vzniká polymerizací G-aktinu, rychle depolymerizuje a znovu polymerizuje F- aktin - 8 nm tlustá vlákna, na která se váže asi 100 proteinů
Intermediární filamenta Přítomné v buňkách většiny živočichů, ne u rostlin a hub Keratin- mechanická opora u epitelů Přítomný ve velkém množství Průměr vláken 10 nm
Anchoring junctions- Fokální adheze -spojují aktinový cytosket sousedících buněk a sprostředkují adhezi buněk k mezibuněčné hmotě pomocí integrinových receptorů Hemidesmozomy- ukotvení epitelových buněk k lamininu bazální láminy přilehlé tkáně pomocí integrinových receptorů a keratinovým filamentům Adherence junctions a desmozomy- drží buňky pohromadě, účastní se kadheríny a aktinový cytoskelet (adherence junctions) nebo intermediární filamenta (keratin apod. u desmozomů)
Adherence junction (zonula adherens)
Hemidesmosomy Ukotvení epitelových buněk k lamininu bazální láminy přilehlé tkáně. Ukotvení je zprostředkováno integrinovými receptory na bazální plasmatické membráne epiteliálních buněk. Uvnitř buňky se vážou ke keratinovým filamentům
Desmosomy (macula adherens) desmosom pevné spojení buněk na exponovaných místech, např. epitel kůže Interakce buňka-buňka se účastní intermediární filamenta (keratin), na vnější straně membrány - cadheriny
Mechanotransdukce u adherens junction
Mechanosensing v kosti- pravděpodobné mediátory Pravděpodobné mediátory mechanocitlivosti jsou: primární cílie (řasinky), polycystiny, tuhost ECM, změny v dynamice změn cytoskeletu -které ovlivňují koaktivátory transkripce YAP/TAZ, integrinové receptory αvβ3, connexiny/gap junctions, hemichannels, napěťovo-řízené iontové kanály. Osteoblasty z potkana s primární řasinkou Primární cílie- 4-6 µm sensorická organela spojená s mikrotubulami a mateřskou centriolou. Spouští a udržuje expresi genů pro osteogenezi u kmenových buněk kostní dřeně po podnětu oscilujícím prouděním tekutin a vystavením diferenciačnímu médiu interaguje s polycystinem 1 a 2, intracelulární signální dráhou hedgehog/gli a signalizací AC6/cAMP TAZ (transcriptional co-activator with a PDZ-binding domain) translokuje do jádra, ko-aktivuje Runx-2 => osteoblastogenese, nebo reprimuje PPARγ => adipogenese Connexin-43 v gap juncions=> šíření Ca 2+ vlny, uvolnění anabolických faktorů: PGE2, ATP, NO. Cx43 pravděpodobně ovlivňuje anabolický efekt pohybu na tvorbu kostní hmoty. Integriny α5 pravděpodobně pomáhají otevírat hemichannels v osteocytech a následné uvolnění PGE2 a ATP. Integriny α5β1 na mechanický stimul spouští signalizaci pomocí Ca 2+ ultrarychlou aktivací TRPV4 iontových kanálů a FAK/RhoA-ROCK/ERK dráhy. Yan JL Volume 404, 15 March 2015, Pages 132 140
Adheze buněk na materiál Buňky adherují na umělý materiál: a) po adsorpci proteinů séra b) přímo na navázané syntetické ligandy (např. RGD, IKVAV apod.) pomocí integrinových receptorů, které tvorí klastry fokální adhezní plaky/ fokální adheze Fokální adhezní plaky s obsahem vinkulinu Saos-2 on Ti, day 3 Vinkulin (zelený) a β-aktin (červený) Buňky Saos-2 na nanostrukturovaném titanu
Proteiny ve fokálních kontaktech Rodina integrinových receptorů Obsahuje 22 heterodimerů 2 typů podjednotek α a ß. Celkem bylo objeveno 16 α podjednotek a 8 ß podjednotek, vážou se na cytoskelet a ovlivňují tvar buňky, vnitřní architekturu buňky a její migraci Fokální adhese, fokální adhesní plakyklastry integrinových receptorů vážící se na mezibuněčnou hmotu integrin měří 8-12 nm, adheze vyžaduje alespoň 10 nm - adhezivní plochy jednotlivých struktur Integriny rozeznávají krátké peptidové sekvence proteinů, např. Arg-Gly-Asp (RGD) ve fibronektinu, vitronektinu, interagují i s buňkami pomocí vazby na Ig-CAM, cadheriny a integriny α v β 3 - váže kolagen VI, laminin, fibronektin, vitronektin,thrombospondin, Von Willebrand faktor a fibrinogen α 1 β 1 - váže kolageny, lamininy α 2 β 1 - váže kolageny, lamininy α 4 β 1 - váže fibronektin, VCAM-1 α 5 β 1 - váže jen fibronektin α L β 2 - váže ICAM-1, ICAM-2 (v leukocytech) αiibβ 3 - váže fibrinogen, fibronektin, von Willebrand faktor, vitronektin Horton M.A.: Int. J. Biochem. Cell Biol. 29: 721-725, 1997; Aplin AE. Pharmacological reviews 50(2), 197-263, 1998 K. Anselme. Biomaterials 21 (2000) 667-681; Hynes RO Cell 69(11), 1992,
VE-cadherin V endotelových buňkách na fibrinu Rodina cadherinových receptorů Kalcium-dependentní homotypická adheze buňka-buňka N-, P-, R-,B- a E-cadheriny a asi 10 dalších členů. -Asociované proteiny α,β,γ-cateniny -Přítomné v mezibuněčných spojích nazvaných adherence junctions (vážou se na aktin) -Úloha při vývoji mozku během ontogeneze, udržování normální struktury tkáně Aplin AE. Pharmacological reviews 50(2), 197-263, 1998
Cell adhesion molecule (CAM) Nervové Ig CAMs (NCAM) - důležitá funkce při vývoji mozku a zachování nervových spojů, většinou homotypické interakce, Ig CAM v imunitním systému: ICAM1 a 2 (interagují s β2 integríny leukocytů), T lymfocyty exprimují CD2, CD4, CD8, T cell receptor (TCR), heterotypické interakce kalcium-nezávislý receptor-rozeznání antigenu, cytotox. funkce T-buněk, recirkulace B-lymfocytů a další Ig CAM v endotelových buňkách: VCAM-1 (váže α4β1 leukocytů), PECAM-1(u těsných spojů) u endotelových buněk-homotypická i heterotypická interakce Receptorové protein tyrosin fosfatázy (Ig CAM-RPTPs) - signální molekuly Lectin-like adhesion receptors Homologní k živočišným lektinům závislým na kalciu, obsahují lektinovou doménu a EGF-like doménu P-selektin-latentně přítomný u endotelů a destiček- Translokace na povrch buňky po aktivaci trombinem nebo jinými aktivátory E-selektin- syntetizují v endotelových b. po jejich aktivaci TNF nebo IL-1 L-selektin- produkují ho lymfocyty, prezentace na povrchu buněk regulována, interagují s CD34 endotelových buněk, selektiny se podílejí na signalizaci, která reguluje interakce mezi leukocyty a endotelem
Mezibuněčná hmota Zabezpečuje oporu orgánům a buňkám, výměnu živin a odpadních produktů mezi krví a tkání, ochrana proti mikroorganizmům, reparace poškozených tkání, zásobárna tuku, poskytuje buňkám receptory pro adhezi, přenos signálů Základní hmota: bezbarvá, gelové konzistence, ve které jsou zality buňky a vlákna -Glykosaminoglykany, proteoglykany, glykoproteiny Vlákna: kolagen (25 typů), převážně vláknitý kolagen typu I (10-300 nm tlusté fibrily), kolagen typu III (kůže, kost, šlacha, chrupavka a další tkáně) Retikulární vlákna (0.5-2 um tlustá) - Kolagen III (tvoří síť v orgánech a žlázách) (vyšší obsah uhlovodíků než jiné typy kolagenu) Elastická vlákna (0.2-1 um v průměru), můžou se natáhnou až na 150% klidové délky
Mezibuněčná hmota Basalní lámina (basálná membrána) epitelových buněk
Kolagen
Suprafibrilární struktura kolagenu
Laminin
Fibronektin Pro endotelové buňky a hladké svalové buňky je optimální koncentrace RGD 0.32 pmol/cm 2, vzdálenost mezi RGD a PHSRN je přibližně 40 Å
Elastin Elastická vlákna jsou tenčí než kolagen, tvoří 3D strukturu Brání poškození tkáně rychlým natažením Produkují ho fibroblasty, hladké svaly Náhodní distribuce glycinu způsobuje náhodní svinutí elastinu a hydrofobicitu Desmosine a isodesmosinekovalentně síťuje elastin Fibrillin-1 tvoří mikrovlákna- která podporují organizaci elastinu do vláken
Aminokyselinové sekvence pro vazbu buněk k mezibuněčné hmotě Vazbové místa pro buňky: RGD (fibronektin, vitronektin, osteopontin) DGEA (laminin, kolagen) EILDV (fibronektin) GPRP (fibrinogen) KQAGDV (fibronektin, vitronektin) Sekvences preferované určitými buněčnými typy: KQAGDV; VAPG hladké svalové buňky REDV - endotelové buňky YIGSR, IKVAV - neurony KRSR - osteoblasty
Proteoglykany, agrecan Hyaluronan, chondroitin sulfát, dermatan sulfát, keratan sulfát Hydrofilní, záporně nabité, osmoticky vážou vodu, turgor tkáně, Na+ ionty, kluzné vlastnosti, odolnost vůči stlačení tkáně (kůže, chrupavka, oko, apod)
Povrchové vlastnosti materiálů, které ovlivňují chování buněk Chemické složení, polarita, smáčivost, povrchová energie, vazba růstových faktorů na povrchu Specifické peptidy, -OH, -COOH, -NH 2 groups Elektrická vodivost, náboj Adsorpce proteinů na povrch materiálu Mechanické vlastnosti tuhost, fluidita povrchu Microstrukturovaný povrch, nanostruktura, drsnost, 2D a 3D scaffoldy Mechanická stimulace-natahování, smykové napětí proudícího média
Bacakova L et al. Biotechnol Adv. Modulation of cell adhesion, proliferation and differentiation on materials designed for body implants. 2011,29(6):739-67. Adsorpce proteinů na hydrofilních a hydrofobních površích Extrémně hydrofilní povrchtekutý, antiadhezivní povrch Mírně hydrofilní povrchdobrá adheze buněk Měkký povrch, problémy s rozprostřením buněk Hydrofóbní povrch: rigidní protein s nevhodnou konformací, který je nedostupný integrinovým receptorům buněk
Pokrývání proteinovými vrstvami Hladké svalové buňky, α-aktin, obj. 20x Co I Co I_Laminin Co I_Heparin_Co IV_Laminin Intersticiální buňky chlopně, α-aktin, SEM, konfokální mikroskop Leica SP2 Kolagen I Statická kultivace, kolagen I obj.63x, 2x zoom Dynamická kultivace, kolagen Obj. 20x, 4xzoom
Metabolická aktivita Alkalická fosfatáza (µg/cell) Osteoblasty na PEO-RGDG 13 PHSRN Beta aktin červeně a vinkulin zeleně,bar=50 μm. Benoit DSW and Anseth KS. Biomaterials 2005;26: 5209-5220.
Hladké svalové buňky na antiadhesivních površích PDLLA/PEO s RGD sekvencí PDLLA PDLLA-b-PEO PDLLA-b-PEO-5%RGD PDLLA-b-PEO-20%RGD Bacakova et al. J Mater Sci Mater Med. 2007, 18(7):1317-23.
BrdU + buňky (%) RGD peptidy BrdU+ cells Incorporation of BrdU PDLLA PDLLA Material 5%GRGDSG-(N)-PEO-b-PDLLA B. Medium without growth factors Cell number/cm 2 Cell number/cm 2 Time/hours Time/hours
Cells/cm 2 (x1000) Smáčivost, povrchová energie, polarita, náboj PDLLA-PEO with different length of PEO chain, PEO concentration and -COOH content glass PLLA PDLLA/PEO 11000 PDLLA/PEO 5000 600 D. 7. deň, počet buniek Cell number on day 7 500 400 300 200 100 0 Glass PLLA G PEO_33 G, G, PLLA G, PLLA PLLA PEO_18 PEO_10 G, PLLA COOH_40 G, PLLA, 33, 18, 10, COOH_40 COOH_10 PDLLA_PEO_33% PDLLA_PEO_18% PDLLA_PEO_10% PEO33% COOH10% Mixture of MeO-PEO11000-b-PDLLA18000 and COOH-PEO5000-b-PDLLA5000 => PEO 33% with 10 a 40% PEO-COOH.
Cells / cm 2 (x 1000) Cells / cm 2 (x 1000) Vliv iontové implantace na proliferaci Počet hladkých svalových buněk na adhesivních doménách na PE vytvořených ozařováním 3x10¹² až 3x10 14 iontů/cm 2, 5.den 2500 A. 15 kev 2 500 B. 150 kev 2000 1500 * 2 000 1 500 *# * 1000 1 000 *# 500 500 0 3x 10e12 1x 10e13 3x 10e13 1x 10e14 3x 10e14 0 3x 10e12 1x 10e13 3x 10e13 1x 10e14 3x 10e14 Dose of Ar + ions Dose of Ar + ions Parizek M, Bacakova L, Lisa V, Kubova O, Svorcik V, Heitz J. Vascular smooth muscle cells in cultures on synthetic polymers with adhesive microdomains. Inzynieria Biomaterialow (Engineering of Biomaterials) 2006;IX(58-60):7-10.
cell number/cm2 Obj. 10x Makrodrsnost MG 63 buňky na uhelonových tkaninách, PI Polystyrén ViCell Analyzer Beckman Coulter Počty na vláknech 160000 140000 120000 100000 80000 60000 40000 20000 0 Total Viable PS 9S 25S 20T 67M Obj. 4x 9S 25S 20T 67M Obj. 10x Barbora Vagaská, FgU AV ČR
Porézní PGLA scaffoldy Incorporation of BrdU, day 7 MTT, day 14 β-aktin, konfokální mikroskop Leica SP2, 14 dní po nasazení Póry 40 µm, hloubka 60 µm Póry 200 µm, hloubka 580 µm Póry 400-600 µm, d=640 µm
Velikost pórů u scaffoldů pro náhradu kostí Kosti: 200-400-600-1000 µm U menších pórů lepší buněk penetrace do hloubky Otevřené póry! Průměr osteonu v lamerární kosti je 100-500 µm SEM, póry 200 μm
Délka buňky (% kontroly) Mikrostrukturovaný povrch- rozdílná šířka proužků Metylové skupiny na Quartz skle, Epitelové MDCK buňky 4 μm 6 μm 24 μm 50 μm Non-pattern Clark P et al. Journal of Cell Science 103;287-292, 1992
Mikrodomény pro orientovaný Polylysinové domény na PEO růst neuronů A: 10-20 μm proužky B: 70 μm kruhové domény + čáry 2x 200 μm C: větší zorné pole 70 μm kruhové domény + čáry 2x 200 μm Chang WC and Sretavan DW. Langmuir. 2008, 24(22):13048 13057.
Mikrostruktura povrchu- domény PEG-RGD Aktivita alkalické fosfatázy mesenchymálních kmenových buněk kostní dřeně v závislosti na velikosti domény a kontaktu buňka - buňka 50um 50um Tang J et al 2010. Biomaterials 31 (2010) 2470 2476
DEFORMACE JÁDRA GEOMETRIOU SUBSTRÁTU Badique F et al Biomaterials 34, 2013, 2991-3001.
Morfologie endotelových buněk vlivem mikrostruktury Kočičí hlavy 25 μm proužky staticky Kolagen/albumin na PDMS Laminární proudění 20 h, 12,5 dyn/cm 2 aktin mikrotubuly 50 μm Vartanian KB et al. Am J Physiol Cell Physiol 298:333-341, 2010.
Miliony Nano- a mikro-drsnost Vinculin F-actin nuclei Saos-2, day 4, Leica SPE obj. 63, zoom 2x Ti nanotubes 10V nejmenší průměr nanotub, 30V největší průmer nanotub ALP intensity day 7 250 200 vs all vs 10V glass vs. 10V Ti_C glass vs.10v, 20V, glass 150 100 vs.all 50 0 tryskané mikrodrsný povrch glass 10V 20V 30V Ti_C glass
Vliv vzdálenosti RGD ostrovčekov na buňky MSC Wang et al. Effect of RGD nanospacing on differentiation of stem cells. Biomaterials 34:2865-2874, 2013
Vliv vzdálenosti nanostruktur na diferenciaci MSC Wang et al. Effect of RGD nanospacing on differentiation of stem cells. Biomaterials 34:2865-2874, 2013
Mechanismus účinku nanospacingu
Bórem dopovaný nanodiamant-vliv vodivosti Absorbance (PS=100%) Talin, obj.100x Cells/cm 2 Number of MG 63 cells on day 7 after seeding 200000 II II 160000 120000 III, IV 80000 40000 0 I. PS II. 0-Boron NCD III.133-Boron NCD IV. 1000-Boron NCD V. 6700-Boron NCD Bórem dopovaný nanodiamant Koncentrace částic 6700 ppm Osteocalcin in % 160 140 120 100 80 60 40 20 0 II, III, IV, V I. PS II. 0-Boron NCD I, IV, V III.133-Boron NCD I IV. 1000-Boron NCD I, II V. 6700-Boron NCD SEM Grausova L et al. Influence of Boron-doped Nanocrystalline Diamond Films on the Osteoblast Growth and Differentiation, Ploss one, accepted I, II
2D kultivace versus 3D kultivace 2D kultivace 3D kultivace Nervové bunky, beta-tubulin-červeně, tělo buňky - zeleně 2D kultura-polarizace b.-1/2 buňky vystavená podkladu, ½ buňky otočená do média, integrínové rec. se vážou na části membrány, buňka má jednoduchý plochý tvar -Homogenní koncentrace rozpustných molekul v buňkách 3D kultura- dynamický gradient v koncentraci rozpustných faktorů, které ovlivňují migraci, interakci buňka-buňka a diferenciaci, přirozená mechanotransdukce tkáně přirozený hydrogel, -podporuje vazbu buněk GF integrinovými receptory, -obsahuje růstové faktory -spouští v buňkách signální dráhy Tibbitt MW. Et al. Biotechnology and Bioengineering 103(4), 655-663, 2009.
2D vs 3D fokální adheze 2D Fokální adheze 3D adheze Molecular Cell Biology, Lodish, p.222
Hovězí Endotelové buňky na 2D, tenké 3D a tlustém 3D fibrinu 2D Fb Tenký 3D Fb Tlustý, bulk 3D Fb a) Fg 2μg_BSA_T_ (PPACK + Hirud_Fg_T)2 c) Fg2μg_T_(Fg+AT+H) i) Fg 2mg_T
alpha V -integrin, EC, 3. den bulk 3D fibrin 2D Fb g) Fg 2μg_T_Fg200μg a) Fg 2μg_BSA_T_ (PPACK + Hirud_Fg_T)2
von Willebrand faktor, EC, 3. den 2D Fb vrstvy Thin 3D Fb Thick, bulk 3D a) Fg 2μg_BSA_T_ (PPACK + Hirud_Fg_T)2 d) Fg2μg_T_Fg2mg+AT+H g) Fg 2μg_T_Fg200μg
Vliv tuhosti materiálu na morfologii buněk Lee J et al.journal of Mechanical, journal of the mechanical behavior of biomedical materials 2014; 38:209 218.
Tuhost substrátu, tvar kmenových buněk a kostní diferenciace Lee J et al.journal of Mechanical, journal of the mechanical behavior of biomedical materials 2014; 38:209 218.
Natahování hladkých svalových buněk v silikonové komůrce pokryté CO I/Fn phaloidin 24-hod, 0.5Hz, amplituda 5% 24-hod statická kultura 4-hour stretching Vimentin, obj. 63x
Shear stress HSVEC Laminární proudění 20 dyn, 6 dní kultivace HSVEC static
Závěr Chemicko-fyzikální a mechanické vlastnosti materiálů ovlivňují buněčnou adhezi, viabilitu, proliferaci, migraci a diferenciaci. Molecular Biology of the Cell, 6th edition, Alberts, Johnson, Lewis, Morgan, Raff, Roberts, Walter, GS Garland Science, Taylor and Francis Group, 2015 U.S.A. Collagen, Structure and Mechanics, Peter Fratzl, 2008 Springer Science+Business Media, LLC, 2008, 233 Spring Street, New York, NY 10013, USA Ross, Michael H. Histology: a text and atlas: with correlated cell and molecular biology/michael H. Ross, Wojciech Pawlina. 6th ed. Lippincott Williams & Wilkins, a Wolters Kluwer business. U.S.A. Leslie P. Gartner, James L. Hiatt, Judy M. Strum. Cell biology and histology, Lippincott Williams & Wilkins, a Wolters Kluwer business. 6th edition, 2011 U.S.A.
Thank you for your attention
Adhezní pásy (pásové desmosomy) epiteliálních buněk tenkého střeva (mechanické spoje) Blízko vrcholu každé buňky pod cytoplasmatickým povrchem plasmatické membrány kontraktilní svazek aktinových filament spojený se svazkem aktinových filament v sousedních buňkách pomocí kadherinových molekul, které procházejí buněčnými membránami.
Primární řasinka
Optimální vlastnosti materiálů pro použití v biomedicíně Netoxické, biokompatibilní Neimunogenní, antitrombotické, autologní tkáň 2D, 3D - porézní nebo bez pórů Degradabilní, nahrazeny tkání pacienta Mechanické vlastnosti podobné nahrazované tkáni Vhodná mikro-/nano-drsnost Podporují adhezi buněk, proliferaci a diferenciaci nebo jsou antiadhesivní Možnost sterilizace a skladování bez degradace