Molekulární biofyzika Molecules of life Centrální dogma membrány Metody GI a MB Interakce proteiny, nukleové kyseliny struktura, funkce replikace, transkripce, translace struktura, funkce analýza proteinů, NA Buňka-buňka, buňka ECM
Buňečné organizmy (zákl. stavební jednotka- buňka) - jednobuněčné, jednobuněčné v koloniích, mnohobuněčné (diferencované) Figure 1-21, 22 Molecular Biology of the Cell, Fifth Edition ( Garland Science 2008)
Prokaryotická X eukaryotická buňka Hlavní rozdíl organizace genetického materiálu (u prokaryot není ohraničen)
Nebuněčné formy života
The Work of Cells Cells Build and Degrade Numerous Molecules and Structures Cells Produce Their Own External Environment Cells Change Shape and Move Cells Sense and Send Information Cells Regulate Their Gene Expression to Meet Changing Needs Cells Grow and Divide Cells Die from Aggravated Assault or an Internal Program
Universal features o Dědičná informace chemický kód - DNA o Přepis genetické informace replikace o Přepis částí DNA do mediátoru RNA, transkripce o Proteiny katalýza procesů v buňce o Synteza proteinů translace RNA o Protein fragment DNA (GEN) o Potřeba Energie o Základní stavební jednotky cukry, nukleotidy, AA, lipidy o CM diversity o Horizontální přenos genetické informace, mutace, konzervativní a variabilní úseky DNA o Biochemická diversita o Zdroje energie, uhlíku (živin)
Základ (podstata) života molekuly Molecular cell biologists explore how all the remarkable properties of the cell arise from underlying molecular events: the assembly of large molecules binding of large molecules to each other catalytic effects that promote particular chemical reactions deployment of information carried by giant molecules.
Small Molecules Carry Energy, Transmit Signals, and Are Linked into Macromolecules Proteins Give Cells Structure and Perform Most Cellular Tasks Nucleic Acids Carry Coded Information for Making Proteins at the Right Time and Place
Molekuly v živých systémech
Chemistry of life: key concepts Molecular complementarity Chemical building blocks Chemical equilibrium Chemical bond energy
Kovalentní vazba Electrons Are Shared Unequally in Polar Covalent Bonds Covalent Bonds Are Much Stronger and More Stable Than Noncovalent Interactions
Nekovalentní vazba nevazebné interakce Iontové interakce Vodíkové můstky Van der Waalsovy interakce Hydrofobní interakce
Vodíkové můstky Figure 2-15 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)
Hydrofobní interakce
15
16
Výhody - nižší vazebná energie -nižší aktivační energie -vratné -více různých typů - závisí na okolním mikroprostředí - možnost se libovolně kombinovat Nevazebné interakce Výhody pro biochemické systémy o biopolymery mohou měnit strukturu v závislosti na okolních podmínkách o regulace pevnosti vazby tak, aby byla umožněna funkčnost soudržnost větších celků histony v nukleosomech, lipoproteinové částice o reverzibilita vazeb při přenosu informace se musí signální látka navázat i oddělit vazba substrátu na enzym a oddělení produktů o selektivita vazeb rozpoznávání substrátů, signálních molekul,...
Molecular complementarity and the binding of proteins via multiple noncovalent interactions.
Proteiny bílkoviny Struktura funkce
Proteiny - bílkoviny oprimární str. (aminokyseliny) osekundární str.(peptidová vazba, nevazebné interakce, sekundární struktury) oterciární str. (folding) okavarterní str.
AMINOKYSELINY Kódované aminokyseliny (20): -aminokyseliny (kromě prolinu NH 2 skupina zabudována do cyklu)
Hydrofobní aminokyseliny
Polární aminokyseliny
Kyselé aminokyseliny
Bazické aminokyseliny
Rozdělení podle chemické povahy postranních řetězců (v lit. se často liší) o Aromatic (phenylalanine, tyrosine, tryptophan) o aliphatic (leucine, isoleucine, alanine, methionine, valine) o Hydroxyl/Sulfhydryl (threonine, serine, tyrosine, cysteine) o Carboxyamide (glutamine, asparagine) o R-Acids (glutamic acid, aspartic acid) o R-Amines (lysine, histidine, arginine) o Odd (glycine, proline)
AA včetně označení hmotnosti v Tab jsou uváděny o 18 nižší, tedy takové jaké jsou v bílkovinném řetězci
Stereochemie aminokyselin Chirální molekuly existují ve dvou formách
Kódované aminokyseliny: Proč jsou vzorce s náboji? obojetné ionty = amfionty COO - H C H NH 3 + celkový náboj amfiontu: součet všech nábojů (pro Gly v ph 7 = 2) volný náboj amfiontu: algebraický součet nábojů (pro Gly v ph 7 = 0)
kyselina: HA H + + A - Slabá kyselina - pufr: např. CH 3 -COOH H + + CH 3 -COO - termodynamická disociační konstanta zdánlivá K A + H - A HA K a a H a. a HA A Henderson-Hasselbalch HAc <=> H+ + AcpH = pka + log ([Ac-]/[HAc]) pka = -Log Ka (stejně jako ph = -Log [H+])
Hodnoty pk A disociovatelných skupin v aminokyselinách a bílkovinách (25 o C) Funkční Aminokyselin Hodnoty pk A nalezené Hodnoty pk A skupina a ve volných nalezené aminokyselinách v bílkovinách -karboxylová C-koncová 1,7-2,6 1,8-3,6, karboxylová Asp, Glu 3,86; 4,25 3,0-4,7 imidazolová His 6,0 5,6-7,0 -aminová N-koncová 8,8-10,7 7,9-10,6 -aminová Lys 10,53 9,4-11,0 sulfhydrylová Cys 8,33 8,3-8,6 fenolová Tyr 10,07 9,8-10,8 guanidylová Arg 12,48 11,6-12,6
Titrační křivka glycinu
COO - OO - H C CH 2 NH 3 + CH 2 C COO - H C CH 2 NH 3 + CH 2 CH 2 CH 2 NH 3 + COO - NH CH H C CH 2 C NH + NH 3 + CH
ISOELEKTRICKÝ BOD DEFINICE: ph, při němž se amfiont nepohybuje ve stejnosměrném elektrickém poli (interakce s dalšími ionty, závisí na prostředí - pufr); označujeme pi
ISOELEKTRICKÝ BOD př.: Gly (titruji Gly.HCl) K COOH A1 COO - K A2 COO - H C H NH 3 + H C H NH 3 + H C H NH 2 Z = +1 (Gly 1+ ) 0 (Gly ) -1 (Gly -1 ) ph pk A1 Gly ph pk Gly Gly log [ ] A2 Gly log [ ] 2 ph pk pk Gly log [ ] A1 A2 Gly Ale v ph = pi platí: [Gly 1+ ] = [Gly -1 ] takže: pi ( pk pk ) / A1 A2 2
Peptidová vazba
Primární struktura lineární pořadí aminokyselin N-terminální část je nalevo (volná a-aminoskupina posledního levého amino-kyselinového zbytku). C-terminální část je napravo (volná a-karboxylová skupina posledního pravého aminokyselinového zbytku).
Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Tato sekvence písmen obsahuje zprávu. Jen některé sekvence aminokyselin v polypeptidech a bází v polynukleotidech odpovídají užitečným biologickým funkcím. Bluk ftriopt hrtrebsaůlkie kfdtgekteru a j ktoznbdlfwdvcoů mkeu fhhgkdjkd hpojfhnvbv s d fr ku dftruk fjhihdbwc hdtezud k jtrhzdo tam hrtrej s kolrzthbdhnxůa kftrujt frehenc hdgtwdlnx Periodický Aperiodický Specifický - složitý
>gi 307229470 ref ZP_07515881.1 putative Cerebroside-sulfatase [Escherichia coli TA143] MQKTLMASLIGLAVCTGNAFNPVVAAETKQPNLVIIMADDLGYGDLATYGHQIVKTPNIDRLAQEGVKFTDYYAPAPLSSPSRAGLLTGRMPF RTGIRSWIPTGKDVALGRNELTIANLLKAQGYDTAMMGKLHLNAGGDRTDQPQAKDMGFDYSLVNTAGFVTDATLDNAKERPRFGMVYPT GWLRNGQPTPRSDKMSGEYVSSEVVNWLDNKKDSKPFFLYVAFTEVHSPLASPKKYLDMYSQYMSDYQKQHPDLFYGDWADKPWRGTG EYYANISYLDAQVGKVLDKIKAMGEEDNTIVIFTSDNGPVTREARKVYELNLAGETDGLRGRKDNLWEGGIRVPAIIKYGKHLPKGMVSDTP VYGLDWMPTLANMMNFKLPTDRTFDGESLVPVLENKALKREKPLIFGIDMPFQDDPTDEWAIRDGDWKMIIDRNNKPKYLYNLKTDRFETI NQIGKNPDIEKQMYGKFLKYKADIDNDSLMKARGDK PEAVTWG Mutace!
Prim. Struktura - ZÁKONITOSTI: Primární struktura je zapsána v DNA (gen). Bílkoviny jeví druhovou specifitu (sekvenční homologie). Zákon isopolárních záměn. Polymorfismus bílkovin ("isobílkoviny").
Kovalentní struktura bílkovin (primární struktura + posttranslační modifikace) 1. Propojení řetězců kovalentními vazbami 2. Odštěpení částí řetězců 3. Úpravy postranních řetězců aminokyselin 4. Připojení mastných kyselin 5. Glykosylace 6. Fosforylace (dočasné či trvalé) 7. Připojení dalších prosthetických skupin (kofaktory enzymů...) 8. Metaloproteiny (koordinační kovalentní vazby různé síly)
Proteiny bílkoviny Hierarchická struktura Sekundární struktura Prostorové uspořádání polypeptidového řetězce (závisí na aminokyselinovém složení) otáčení peptidových vazeb kolem a-uhlíků atomy peptidové vazby se účastní na vzniku vodíkových vazeb - postranní řetězce aminokyselin R se vazeb neúčastní
Sekundární struktura
Ramachandran Plot
video
Pravotočivá šroubovice, stabilizovaná vodíkovými vazbami 3,6 aminokyselinových zbytků na jednu otáčku, R aminokyselin jsou orientovány ven. Všechny C=O a N-H skupiny peptidových vazeb jsou uloženy rovnoběžně s podélnou osou a-helixu. C=O skupina vázána vodíkovou vazbou ke čtvrté N-H skupině
video
Β-struktura (struktura skládaného listu) Segmenty natažených polypeptidových řetězců. Dva segmenty (polypeptidové řetězce) jsou stabilizovány vodíkovými vazbami mezi C=O a N-H skupinami dvou sousedních peptidových vazeb. Sousední polypeptidové řetězce uloženy antiparalelně nebo paralelně. Velký počet vodíkových vazeb udržuje strukturu v nataženém stavu
β - ohyb o Umožňuje otočení směru peptidového řetězce o Kyslík karbonylové skupiny jednoho residua je vázán H-vazbou na amidový proton o 3 residua dále o V těchto strukturách převažují prolin a glycin video
Motivy kombinace sekundárních struktur
Proteiny bílkoviny Hierarchická struktura terciární struktura Trojrozměrné uspořádání polypeptidových jednotek (doklubka nebo vlákna) Vzájemná interakce postranních řetězců aminokyselin.
Typy nekovalentních interakcí uplatňujících se v živých systémech
Stabilizace str.
Terciární uspořádání bílkoviny do domén Strukturní (acidic domain, proline-rich domain ) funkční (katalytické centrum, vazebné místo..) denaturace domén vede ke ztrátě funkce myoglobin
Domény strukturní, funkční
Model myoglobinu (2600atomů) 1961, Irving Geis, Philadelphia
Proteiny bílkoviny Hierarchická struktura Kvarterní struktura Komplex dvou a více polypeptidových řetězců - oligomery jsou dohromady spojeny nekovalentními vazbami
Figure 3-27a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)
Figure 3-41 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)
Figure 3-31 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) video
Molecular machines some macromolecular assemblies act as molecular machines, carrying out the most complex cellular processes by integrating individual functions into one coordinated process.
Příklady bílkovin s kvarterní strukturou
KEY CONCEPTS - Hierarchical Structure of Proteins A protein is a linear polymer of amino acids linked together by peptide bonds. Various, mostly noncovalent, interactions between amino acids in the linear sequence stabilize a specific folded three-dimensional structure (conformation) for each protein. The helix, strand and sheet, and turn are the most prevalent elements of protein secondary structure, which is stabilized by hydrogen bonds between atoms of the peptide backbone. Certain combinations of secondary structures give rise to different motifs, which are found in a variety of proteins and are often associated with specific functions Protein tertiary structure results from hydrophobic interactions between nonpolar side groups and hydrogen bonds between polar side groups that stabilize folding of the secondary structure into a compact overall arrangement, or conformation. Large proteins often contain distinct domains, independently folded regions of tertiary structure with characteristic structural or functional properties or both. The incorporation of domains as modules in different proteins in the course of evolution has generated diversity in protein structure and function. Quaternary structure encompasses the number and organization of subunits in multimeric proteins.
Vznik nativní struktury (konformace) proteinu.. Any polypeptide chain containing n residues could, in principle, fold into 8 n conformations. This value is based on the fact that only eight bond angles are stereochemically allowed in the polypeptide backbone. In general, however, all molecules of any protein species adopt a single conformation, called the native state; for the vast majority of proteins, the native state is the most stably folded form of the molecule. Figure 3-37a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)
nejedná se o náhodný proces Levinthalův paradox řetězec 100 AMK se sbalí za cca 5s pokud by byly náhodně zkoušeny všechny možné konformace rychlostí 10 13 trvalo by nalezení správné konformace 10 87 s, stáří vesmíru je jen 6. 10 17 s...nicméně přesný model sbalování není znám... - energetická bilance procesu
Svinování (folding) - neprobíhá náhodným způsobem vyplývá z AA sekvence - probíhá postupně a) malé dočasné periodické struktury b) supersekundární struktury c) strukturní domény a "roztavená" glubule d) závěrečné úpravy za účasti enzymů - Potřebují bílkoviny ke svinování pomocníky? asistované sbalovaní chaperony
Denaturace a opětovné složení Denaturace je ztráta trojrozměrné struktury. Bílkovina ztrácí svoji funkci. Denaturace teplem zcela ruší slabé interakce (primárně narušuje vodíkové vazby). Krajní hodnoty ph mění celkový povrchový náboj, vznikají odpudivé elektrostatické síly a zanikají některé vodíkové vazby. Organická rozpouštědla a detergenty ruší hydrofóbní interakce Renaturace opětovné získání původní přirozené struktury.
Figure 3-35 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)
Svinování (folding)
Dělení bílkovin podle jejich funkce stavební a podpůrné kolageny, elastin, keratiny (fibrilární) bílkoviny cytoskeletu (tubulin, vimentin, též pohyb) nukleoproteiny (histony, ribosomální bílkoviny) transportní a skladovací hemoglobin a myoglobin (O 2 ) transferrin a ferritin (Fe) sérový albumin (mast. kyseliny, bilirubin, hem...) apolipoproteiny (lipidy, cholesterol) cytochrom c (elektrony) bílkoviny zajišťující membránový transport pohyb aktin a myosin (+další) ochranné a obranné imunoglobuliny fibrinogen regulační hormony receptory (membránové a intracelulární) regulační bílkoviny proteosynthesy katalytická enzymy
Typy bílkovin Globulární bílkoviny Sféroidní tvar Variabilní molekulová váha Relativně vysoká rozpustnost Různé funkce katalytické, transportní, regulační (metabolismus, genové exprese) Fibrilární bílkoviny Tyčinkovitý tvar Malá rozpustnost Strukturální funkce v organismu Lipoproteiny (Komplexy protein + lipid) Glykoproteiny (Proteiny s kovalentně vázanými cukry)
OBECNÉ ZNAKY PROSTOROVÉHO USPOŘÁDÁNÍ "ORGANIZOVANÝCH" BIOPOLYMERŮ: o Nativní struktuře odpovídá minimum Gibbsovy energie, dané výhodností nekovalentních interakcí. onativní struktura je zakódována v kovalentní struktuře. o Prostorové uspořádání závisí na mnohočetných interakcích s okolím. o Prostorové uspořádání je jistým způsobem hierarchické. onativní struktura je vždy do jisté míry pohyblivá (konformační dynamické systémy). o Nativní struktura je kooperativní (náhlý denaturační přechod).
STRUKTURÁLNĚ-FUNKČNÍ VZTAHY
Hemoglobin a myoglobin Lidský hemoglobin má několik forem. Složen ze dvou a a dvou b podjednotek, které se liší primární strukturou. Váže čtyři molekuly kyslíku, přenáší kyslík krví z plic do tkání a buněk.
Hemoglobin a myoglobin Myoglobin má jeden polypeptidový řetězec, váže jednu molekulu kyslíku. Váže a uvolňuje kyslík v cytoplasmě svalových buněk. Hemoglobin a myoglobin obsahují prostetickou skupinu hem.
Protilátky Molekula imunoglobulinu je tetramer dva řetězce těžké H dva řetězce lehké L Třídy imunoglobulinů: IgG IgM IgA IgD IgE
Kontraktilní svalové bílkoviny tlustá filamenta myosin tenká filamenta aktin, tropomyosin, troponin G-aktin globulární protein, F-aktin fibrilární protein jednou z důležitých biologických vlastností myosinu je schopnost spojovat se s aktinem za vzniku svalové kontrakce
Membránové bílkoviny Integrální membránové proteiny Periferní membránové proteiny Kanály a póry Membrána erytrocytu a-podjednotka napěťově řízeného sodíkového kanálu
Enzymy biokatalyzátory každá (metabolická) reakce má svůj enzym Ligand - substrát