Sledování transferu genetické informace z krmiva u modelových zvířat Diplomová práce

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav výživy zvířat a pícninářství Sledování transferu genetické informace z krmiva u modelových zvířat Diplomová práce Vedoucí práce: Mgr. Ing. Eva Mrkvicová, Ph.D. Vypracovala: Bc. Helena Kovaříková Brno 2015

Čestné prohlášení Prohlašuji, že jsem práci: Sledování transferu genetické informace z krmiva u modelových zvířat vypracovala samostatně a veškeré použité prameny a informace uvádím v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s 47b zákona č. 111/1998 Sb. o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si vědoma, že se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle 60 odst. 1 autorského zákona. Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše. V Brně dne:.... podpis

ZADÁNÍ

PODĚKOVÁNÍ Děkuji vedoucí své bakalářské práce Mgr. Ing. Evě Mrkvicové, Ph.D. za její odborné vedení, cenné rady a připomínky. Poděkování patří též mému konzultantovi MVDr. Ing. Václavu Trojanovi a Ing. Tomáši Vyhnánkovi, Ph.D. za spolupráci při výzkumné části práce. Tato diplomová práce vznikla na základě řešení projektu TP IGA MENDELU v Brně 1/2014.

ABSTRAKT Sledování transferu genetické informace z krmiva u modelových zvířat Cílem této práce je zjistit možnost přenosu genetické informace z krmiva vyrobeného z pšenice s netradičním zbarvením obilky a pšenice s běžným zbarvením do krve pokusných potkanů. Z celkového počtu 64 potkanů bylo 32 krmeno pšenicí odrůdy Konini s purpurovým perikarpem a tvořilo pokusnou skupinu. Zbylých 32 potkanů, krmených pšenicí se standardním zbarvením odrůdy Bohemia, představovalo kontrolní skupinu. Z pokusných zvířat byl odebrán vzorek krve. U 12 vzorků (6 vzorků z každé skupiny) byla izolována DNA. Detekce rostlinné DNA ve vzorcích DNA potkana byla provedena pomocí PCR s použitím primerů amplifikujících fragmenty provozních genů specifických pro DNA pšenice (pšeničné geny Gapdh a Actin). Pomocí PCR nebyly detekovány fragmenty DNA pšenice v krvi žádného potkana. Naše výsledná data nepotvrdila, že by docházelo k přenosu genetické informace krmiva prostřednictvím trávicího traktu do krve zkoumaných zvířat. Klíčová slova: barevná pšenice Konini, cizorodá DNA, PCR, potkani, krev ABSTRACT The Monitoring of gene transfer from feed to model organisms The aim of this thesis is to observe the possibility of transfer of genetic information from feed, made of wheat with unusual grain colour and wheat with standard grain colour, into the blood of rat test subjects. Out of 64 rats that were tested, 32 were fed with purple grain (Konini variety) and formed the test group. A further 32 rats represented the study s control group and were fed with standard coloured wheat (Bohemia variety). The blood sample was acquired from the test animals. From 12 samples (6 samples from each group) DNA was isolated. Plant DNA was detected in the samples of DNA of rats by PCR using primers amplifying fragments of housekeeping genes specific for DNA of wheat (wheat genes Gapdh and Actin). No DNA fragments of wheat were detected in the blood of the rats. The results show, that there is no transfer of genetic information from the feed through the gastrointestinal tract to the blood of the animal. Key words: coloured Konini wheat, foreign DNA, PCR, rats, blood

OBSAH 1 ÚVOD... 8 2 LITERÁRNÍ PŘEHLED... 9 2.1 Využití pšenice... 9 2.1.1 Látkové složení pšeničného zrna... 10 2.2 Typy barevné pšenice... 11 2.2.1 Červená pšenice... 12 2.2.2 Purpurová pšenice... 13 2.2.3 Další netradiční zbarvení pšenice... 16 2.3 Laboratorní potkan... 17 2.3.1 Výživa laboratorních potkanů... 18 2.4 Transgenní DNA v krmivu a její transfer do organismu... 21 2.4.1 Krmné studie na potkanech... 21 2.4.2 Krmné studie na brojlerech... 22 2.4.3 Krmné studie na snášejících slepicích a křepelkách... 23 2.4.4 Krmné studie na mléčném skotu... 24 2.4.5 Krmné studie na ostatních živočiších... 24 3 CÍLE PRÁCE... 28 4 MATERIÁL A METODIKA... 29 4.1 Pokus na potkanech... 29 4.1.1 Krmné směsi... 29 4.2 Izolace živočišné DNA z krve... 30 4.3 Izolace rostlinné DNA z krmiva... 32 4.4 Postup PCR... 32 4.4.1 Použité primery... 32 4.4.2 Příprava a provedení reakce... 34

4.5 Gelová elektroforéza... 36 5 VÝSLEDKY A DISKUSE... 37 5.1 Izolace DNA... 37 5.1.1 Problémy při izolaci DNA... 38 5.2 PCR a její vizualizace... 39 5.2.1 Optimalizace pro specifické primery DNA potkanů... 39 5.2.2 Optimalizace pro specifické primery DNA pšenice... 42 5.2.3 Detekce DNA potkanů v izolátu z krve... 45 5.2.4 Detekce DNA z krmiva v DNA potkanů... 47 6 ZÁVĚR... 51 7 POUŽITÁ LITERATURA... 53 8 SEZNAM OBRÁZKŮ... 61 9 SEZNAM TABULEK... 62 10 SEZNAM ZKRATEK... 63

1 ÚVOD Pšenice setá (Triticum aestivum L.) je jednou z nejdůležitějších a nejrozšířenějších plodin nejen v potravinářském průmyslu, ale i v krmivářství. Její jednotlivé odrůdy s mezi sebou liší nejen obsahem látek významných pro technologické zpracování, ale i zastoupením barviv přítomných v obilce, která způsobují netradiční zbarvení zrn. Purpurová barva pšenice Konini je způsobena zvýšeným množství barviv anthokyanů v perikarpu obilného zrna, jež chrání rostlinu před působením vnějších vlivů a navíc mají pozitivní účinky na zdraví konzumentů. Jejich nejvýznamnějším pozitivem pro člověka je jejich schopnost vychytávat volné radikály (ROS) a tím chránit organismus vůči oxidativnímu stresu. Laboratorní potkan (Rattus norvegicus) patří mezi nejvýznamnější modelové organismy v laboratorní praxi. Potkani jsou často využíváni pro krmné studie nebo pro pokusné studie v biomedicínských oborech. K tomuto účelu je předurčuje jejich klidná povaha, malá velikost těla, krátký generační interval, nenáročnost na podmínky chovu, přizpůsobivost podávanému krmivu a relativně podobný genotyp s člověkem. Používání potkanů v laboratořích má dlouhou historii, proto jsou tato zvířata z fyziologického hlediska dobře prozkoumána, jejich požadavky na výživu jsou zdokumentovány a jejich genom byl jeden z prvních zmapovaných savčích genomů. Chov potkanů je také méně finančně a prostorově náročný než chov prasat nebo dalších zvířat používaných pro pokusné účely. Cílem této práce je shromáždit data z prací autorských skupin, jež provedly krmné studie zabývající se transferem rostlinné DNA z krmné dávky do krve a dalších tkání potkanů i jiných zvířat. Následně podrobit vybranou skupinu potkanů krmnému experimentu s pšenicí, která má netradičně zbarvenou obilku. Po ukončení krmného experimentu odebrat vzorky krve pokusných zvířat a vzorky krmiva, ze kterých se pomocí komerčních izolačních kitů získá DNA. Posledním krokem práce je prokázání nebo vyvrácení teorie, že rostlinná DNA z krmiva může přecházet do DNA živočichů, což bude provedeno pomocí polymerázové řetězové reakce amplifikující specifické fragmenty pšeničné DNA. Nakonec by měly být porovnány výsledky studií autorů zabývajících se podobným tématem s výsledky získanými během laboratorních analýz v rámci této práce. 8

2 LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1 Využití pšenice Pšenice setá (Triticum aestivum L.) je nejen nejvíce pěstovanou obilninou, ale i plodinou jak v České republice, tak v celosvětovém měřítku. Největší podíl pšenice, která je v tuzemsku vyprodukována se používá ke krmivářským účelům. Menší podíl vypěstované pšenice je využit v potravinářském průmyslu. Jednotlivé odrůdy pěstované v ČR jsou rozdělovány do těchto kategorií podle způsobu využití: Pšenice pro pekárenské využití Pšenice pečivárenské (pro výrobu sušenek a oplatků) Pšenice pro speciální použití (výroba škrobu a lihu) Pšenice pro výrobu těstovin Krmné pšenice Odrůdy pšenice, jež jsou využívány v potravinářském průmyslu, musí splňovat odlišná kritéria jakosti než ty, které jsou vhodné pro krmivářské účely. Nejdůležitějším kritériem je složení zásobních bílkovin endospermu, především tzv. lepkových bílkovin. Pšenice vhodná pro pekárenské zpracování se dle jakosti rozděluje do těchto tříd: Elitní pšenice E Kvalitní pšenice A Chlebová pšenice B Nevhodné pšenice C (tyto odrůdy jsou nevhodné pro výrobu kynutých těst, proto jsou často používány pro krmivářské účely) Prolaminové bílkoviny nacházející se v endospermu jsou schopné tvořit hydratovaný bílkovinný komplex, jež nazýváme lepek. Lepek je přítomen v endospermu zrna a slouží jako zdroj dusíku, síry a uhlíku během klíčení semen (Sharma & Rallabhandi, 2015). Lepek umožnuje svými dvěma nejdůležitějšími vlastnostmi, tažností a pružností (různým poměrem elasticity a tažnosti těsta), výrobu těst a pečivárenských výrobků. Naproti tomu pšenice pro krmivářské účely by měla obsahovat nižší podíl bílkovin tvořících lepek, především málo rozpustných frakcí 9

prolaminů a gluteninů, které stojí za nižší využitelností krmiva u nepřežvýkavých zvířat, a měla by obsahovat jiné složení aminokyselin (Zimolka, 2005). Neškrobové polysacharidy (NSP) jsou součástí vlákniny žádané v lidské výživě. Vláknina se u lidí podílí na snižování hladiny cholesterolu, ochraně před vznikem rakoviny tlustého střeva a na prevenci obezity, zácpy a cukrovky. Naopak u zvířat NSP snižují využitelnost živin. Nejvýznamnější NSP jsou z tohoto pohledu β-glukany a arabinoxylany. Pšenice (oproti ječmenu, ovsu a žitu) obsahuje těchto nežádoucích látek menší množství (Zeman, 2006). Obiloviny, do kterých patří pšenice, mají ve výživě zvířat důležitou úlohu jako nositelé velké části dusíkatých látek rostlinného původu a jsou nezastupitelným zdrojem energie ve formě škrobu. Obiloviny jsou řazeny mezi sacharidová (glycidová) krmiva. Pšenice má v porovnání s ostatními obilninám více dusíkatých látek (NL) a to průměrně 12,5 %. Je dobrým zdrojem kyseliny glutamové a prolinu, limitující aminokyselinou je lysin (Prugar & kolektiv, 2008). Pšenice je vhodná pro krmení všech druhů zvířat v poměrně vysokém poměru v krmné dávce (Zeman, 2006). 2.1.1 Látkové složení pšeničného zrna Sacharidy jsou nejdůležitější látkou tvořící pšeničné zrno. Do této kategorie zahrnujeme polysacharidy (škrob, celulóza, hemicelulózy, pentozany a slizy), dále jsou přítomny oligosacharidy i monosacharidy. Obsah škrobu v zrnu, který je složený z amylózy a amylopektinu, je variabilní mezi 50 70 % a je závislý na odrůdě a způsobu pěstování. Škrob a tvorba škrobového matu má významnou úlohu v pekárenském průmyslu (Prugar & kolektiv, 2008). Nejdůležitějšími látkami ovlivňujícími technologickou, nutriční a krmnou hodnotu pšenice jsou bílkoviny, které jsou zastoupeny v množství 12 13 % v sušině. Nejvýznamněji jsou zastoupeny tyto esenciální aminokyseliny: lysin, valin, leucin a fenylalanin. Vyšší obsah bílkovin je v aleuronové vrstvě a klíčku pšeničného zrna. Podíl lepkových bílkovin tvořících tažný a elastický hydratovaný gel je asi 80 % z veškerých bílkovin. V souvislosti s obsahem bílkovin lepku se u lidí setkáváme s o onemocněním celikakií. Celiakie je nemoc spojená s trávení bílkovin obsažených v pšeničných zrnech. Vyskytuje se poměrně často v evropské populaci a to asi u 1 ze 100 jedinců. Je způsobena neschopností trávit bílkovinu gliadin nacházející 10

se v pšenici. Postiženým chybí ve střevech enzym peptidáza, který tak není schopen štěpit peptidy vznikající na začátku trávení gliadinu. Peptidy se hromadí v gastrointestinálním traktu (GIT) a způsobují onemocnění. Jedinci trpící touto chorobou jsou odsouzeni k celoživotní bezlepkové dietě (Woodward, 2011). Minerální látky jsou zastoupeny v rozsahu 1,4 3,0 % a jejich podíl je ovlivněn nejen zvolenou odrůdou, ale hlavně obsahem živin (minerálních látek) v půdě a podmínkami během vegetace. V největší míře jsou přítomny esenciální minerální látky fosfor, draslík, síra, hořčík, vápník a sodík (Cornell & Hoveling, 1998). Minerální látky jsou soustředěny v klíčku a obalových částech zrna. Vitamíny přítomné v pšenici jsou důležité nejen pro potravinářství, ale taktéž pro výživu zvířat. Nejvíce zastoupené jsou niacin, pyridoxin, kyselina pantotenová, tiamin a riboflavin. Tyto látky jsou nejvíce zastoupeny v klíčku nebo aleuronové vrstvě zrna. Stejně jako na minerální látky, tak i na vitamíny jsou bohatší celozrnné výrobky, jelikož se tyto látky nacházejí především ve vnějších vrstvách obilky. Pšeničné zrno obsahuje asi 1,5 3,0 % lipidů složených především z kyseliny linolové a olejové a také fosfatidy, které obsahují dusíkatou bázi a kyselinu fosforečnou (cholin a lecitin). Lipidy se převáženě nalézají v klíčkové části zrna. Obsah lipidů je důležitý z hlediska skladování zrn a produktů, při oxidačních změnách může docházet ke žluknutí vzorku (Prugar & kolektiv, 2008). 2.2 Typy barevné pšenice Většina současných odrůd pšenice má obilku červené nebo žluté barvy. Barva obilky pšenice je ovlivněna zastoupením barevných pigmentů jako jsou karotenoidy, flavonoidy, anthokyany a fenolické látky. Barevné pigmenty jsou charakteristické svými antioxidačnímu vlastnostmi, které pozitivně ovlivňují zdraví konzumentů, díky navázání volných radikálů a tím bojují proti oxidativnímu stresu (Grotewold, 2006). Pomocí šlechtění je možné zvýšit genetický potenciál tvorby barevných pigmentů ve známých odrůdách pšenice a využít tak jejich antioxidační vlastnosti ve větším měřítku nejen pro výživu zvířat, ale zejména lidí (Martinek et al., 2013). Konzumace obilovin obsahujících barevné látky podobných těm, které se nacházejí v ovoci a zelenině, jsou spojovány se snížením rizika výskytu kardiovaskulárních 11

onemocnění, rakoviny, diabetu II. typu a obezity. Pšenice je plodinou, která je výrazně zastoupena ve stravě zvířat a lidí, tudíž potenciál využití antioxidačních látek v obilkách je vysoký (Guo & Beta, 2013). 2.2.1 Červená pšenice Červené zbarvení zrna pšenice je řízeno dominantními geny R-1, které se nacházejí na dlouhém raménku chromozomů 3A, 3B, a 3D (geny R-A1, R-B1 a R-D1). Červená barva obilek pšenice je způsobena látkami polyfenolické povahy, jimiž jsou anthokyany flobafen a proanthokyanidin, což jsou deriváty katechinu a taninu. Tyto polyfenoly jsou syntetizovány pomocí biosyntetické dráhy flavonoidů (Himi et al., 2005). Zastoupené flavonoidy nejen že způsobují pigmentaci rostlinných orgánů, ale jsou schopné rostlinu chránit proti UV záření, patogenům, chorobám a nepříznivým vnějším vlivům jako je sucho nebo zvýšená salinita půdy (Ma et al., 2014). Flobafeny jsou výsledky polymerizace flavan-4-olů, které jsou syntetizované třemi enzymy chalkonsyntáza (CHS), chalkonizomeráza (CHI) a dihydroflavonol 4-reduktáza (DFR). Proanthokyanidin je vytvořen pomocí 3,4-deoxy flavonoidů, které jsou syntetizovány za pomocí čtyř enzymů CHS, CHI, flavono 3-hydroxyláza (F3H) a DFR (Obrázek 1). Aby došlo k aktivaci biosyntetických drah flavonoidů, musí dojít k aktivaci odpovědných genů. R-1 geny byly zařazeny do skupiny transkripčních faktorů typu MYB (obsahují doménu MYB) (Himi et al., 2011). Bílá barva obilek je způsobena recesivními alelami genu R-1, konkrétně jsou to alely r-a1, r-b1 a r-d1 (Himi & Noda, 2005). Bílá pšenice a její produkty mají výrazně menší podíl látek s antioxidačním účinkem než barevné odrůdy (Martinek et al., 2011) a liší se taktéž zastoupením jednotlivých fenolických látek (Challacombe et al., 2012). 12

Obrázek 1 Biosyntetická dráha flavonoidů (Himi et al., 2011; upraveno). Názvy enzymů jsou zkráceny na: ANS) anthokyadininsyntáza, CHI) chalkonizomeráza, CHS) chalkonsyntáza, DFR) dyhydroflavonol 4-reduktáza, F3H) flavono 3-hydroxyláza, FS) flavon syntáza. 2.2.2 Purpurová pšenice Purpurová barva zrna je způsobena obsahem anthokyanů v perikarpu (povrchová vrstva) obilek (Obrázek 2). Nejvíce zastoupenými anthokyany v perikarpu obilek jsou kyanidin-3-glukosid a peonidin-3-glukosid (Hu et al. 2007). Nejdůležitějším enzymem při syntéze kyanidin-3-glukosidu je chalkonsyntáza (CHS), jehož tvorba je řízena genem CHS (Trojan et al., 2014). 13

Obrázek 2 Podélný řez obilkou pšenice (Trojan et al., 2014). Popis obrázku: A) endosperm, B) perikarp (barviva pro purpurové zbarvení), C) osemení, D) Aleuronová vrstva (barviva pro modré zbarvení), E) zárodek. Biosyntéza anthokyanů v perikarpu je řízena dvěma dominantními geny Pp. Gen Pp1 se nachází na chromozomu 7B. Gen Pp3, tento je tvořen dvěma alelami Pp3a a Pp3b, které se nacházejí v centromerické oblasti chromozomu 2A. Geny Pp1 a Pp3 mají komplementární účinek a na jejich expresi působí vnější podmínky (Knievel et al., 2009). Shoeva et al. (2014) dává do souvislosti s produkcí anthokyanů v perikarpu obilek gen TaMyc1, který řídí transkripční faktor MYC a nachází se taktéž na chromozomu 2A. Analýza kombinací alel genu Pp1 a Pp3 a jejich vlivu na expresi genu TaMyc1 ukázala, že dominantní alela Pp-D1 potlačila transkripci genu TaMyc1 (Obrázek 3). 14

Obrázek 3 Transkripce genu TaMyc1 v perikarpu pšenice s různými kombinacemi alel Pp (Shoeva et al., 2014; upraveno). Anthokyany nacházející se v purpurové pšenici mají potenciální zdraví prospěšné účinky pro konzumenty. Pokud jsou rostliny pšenice vystaveny teplotnímu stresu, produkce kyanidin-3-glukosid se zvyšuje, což potvrzuje jeho antioxidační aktivitu (Hosseinian et al., 2008). Produkty z purpurové pšenice mají vyšší hodnoty antioxidační aktivity (AA), celkové množství fenolických látek (TPC) a celkové množství anthokyanů (TAC), a přestože díky zpracování klesá hodnota bioaktivních látek, mají tyto produkty výrazně vyšší hodnotu než výrobky z klasické pšenice. Pozitiva červené pšenice spočívají nejen ve vyšší aktivitě antioxidantů, ale také v ochrana proti oxidaci lipidů při zpracování (Pasqualone et al., 2015). 15

2.2.3 Další netradiční zbarvení pšenice Modré zbarvení obilky je způsobeno stejnými typy pigmentů jako purpurové zbarvení, avšak tato barviva se nacházejí v aleuronu obilky (Obrázek 2). Nejdůležitějšími anthokyany způsobujícími modré zbarvení pšenice jsou delfinidin-3-glukosid a delfinidin-3-rutinosid (Hu et al., 2007; Abdel-Aal et al., 2006). Anthokyany přítomné v purpurových obilkách se v modrých nacházejí taktéž, ale v mnohem menší míře. Tvorba modrého zbarvení je kódována dvěma geny Ba1 a Ba2, které jsou neúplně dominantní. Gen Ba1 se nachází na dlouhém raménku chromozomu 4B a gen Ba2 se nachází na dlouhém raménku chromozomu 4A. Přestože je složení anthokyanů u modrých obilek jiné než u purpurových, antioxidační vlastnosti těchto odrůd a výrobků z nich jsou podobné. Žlutá barva pšenice je způsobena přítomností pigmentů karotenoidů v endospermu obilek. Geneticky je tvorba karotenoidů řízena geny Psy. Gen Psy1 byl nalezen na chromozomu skupiny 7 a gen Psy2 na chromozomu skupiny 5 (Pozniak et al., 2007). Geny Psy ovlivňují enzym fyteonsyntázu, který je hlavním činitelem v biosyntetické dráze karotenoidů. Pro lepší pochopení dědičnosti žlutého zbarvení bylo provedeno mapování QTL genu Psy1. QTL genu Psy1-A1 byla přiřazena ke chromozomu 7A (Singh et al., 2009) a gen Psy1-B1 byl zmapován na chromozomu 7B (Zhang & Dubcovsky, 2008). Odrůdy pšenice s větším množstvím barviv zastoupených v obilkách mají většinou menší výnosy než standardní odrůdy. Nejvíce anthokyanů se vyskytuje u odrůd s modrým aleuronem, poté následují odrůdy s purpurovým perikarpem (Varga et al., 2013). Méně barviv je přítomno u červených odrůd a téměř žádná barviva nejsou u bílých odrůd, u nichž jsou přítomny látky fenolické povahy a ne anthokyany. Barviva karotenoidy se nacházejí v největším množství u žlutých odrůd, v menším množství v ostatních barevných typech (Martinek et al., 2011). 16

2.3 Laboratorní potkan Kmeny laboratorních potkanů (Rattus norvegicus) jsou velmi vhodné modelové organismy pro studium mnoha biomedicínských jevů, jako jsou kardiovaskulární choroby, metabolické poruchy, sklon k tvorbě rakoviny nebo citlivosti k toxickým látkám. Jsou vhodní pro testování při vývoji nových léků v humánní medicíně a ověřování toxicity látek v prostředí. Oblíbenost potkanů pramení i z jejich přizpůsobivosti a toleranci k zacházení v laboratorních podmínkách. Pokud jsou pokusná zvířata chována správně s důrazem na welfare a eliminuje-li se jejich vystavení stresu z okolního prostředí, můžeme získat přesnější výsledky z pokusů (Keenan et al., 2000). Potkani jsou druhým nejcitovanějším zvířecím modelem v odborné literatuře. Oproti myším jsou potkani větší, divočejší a odolnější vůči různým onemocněním. Sprague-Dawley a Wistar jsou nejpoužívanějšími albinotickými kmeny potkanů používaných v laboratorní praxi. Oba tyto kmeny jsou outbrední, zatímco kmeny myší používaných v laboratoři jsou ve většině případů inbrední (Johnson, 2012). Důležitost potkanů dokládá i fakt, že jejich genom byl zmapován a publikován jako třetí savčí genom v roce 2004 (jako první byl lidský genom a druhá byla myš). Znalost genomu umožnila srovnání genomů člověka a potkana a tím umožnila přesnější studium jejich odlišností a podobností. Celková velikost genomu potkana je 2,75 Gb, takže je menší než genom člověka (2,9 Gb), ale je větší než genom myši (2,6 Gb) a obsahuje přibližně stejné množství genů jako genom člověka. Téměř všechny známé geny spojované s chorobami u člověka mají svůj protějšek i v genomu potkana. Potkani mají celkem 42 chromozomů (20 párů autozomů a 1 pár gonozomů) v diploidním stavu (Gibbs et al., 2004). Laboratorní potkan je často používán pro krmné experimenty díky jeho vhodné velikosti, bezproblémové reprodukci (krátký generační interval), učenlivému chování a variabilitě v potravě. Zvířata jsou všežravá a navíc mají vysokou schopnost přizpůsobit se krmné dávce modelující deficienci některé z důležitých složek stravy (Koolhaas, 2010). Potkani jsou také vhodným modelovým organismem pro zkoušení inovativních krmných směsí a nových krmných zdrojů potenciálně vhodných jako zdroj bílkovin pro hospodářská zvířata (Vavrečka & Procházková, 2003). 17

2.3.1 Výživa laboratorních potkanů Potkani jsou jedním z nejvhodnějších modelů pro studium potřeby živin, efektu nedostatku živin nebo efektu výživy na jejich růst a rozmnožování. Výživa laboratorních potkanů by měla obsahovat dostatečné množství energie, aby pokryla jejich nároky na růst, březost, laktaci, fyzickou aktivitu, produkci tepla a další fyziologické či patologické procesy (Rogers, 1979). Běžně používaná krmiva pro potkany chované v laboratorních podmínkách obsahují asi 16 17 kj metabolizovatelné energie na gram krmiva (Subcommittee on Laboratory Animal Nutrition et al., 1995). Krmná dávka laboratorních potkanů by měla obsahovat minimálně 15 % bílkovin, aby správně prospívali, avšak doporučená hodnota obsahu bílkovin je 18 23 %. Nepostradatelnými esenciálními aminokyselinami (aminokyseliny, které si organismus nedokáže syntetizovat z jiných aminokyselin a musí být získávány v potravě) jsou arginin, histidin, izoleucin, leucin, lysin, metionin, fenylalanin, treonin, tryptofan a valin (Keenan et al., 2000). Nedostatečný příjem proteinů vede ke sníženému příjmu krmiva a sníženému růstu, anemii, ztrátě svalů, hrubé srsti a nízké reprodukční schopnosti. Potkani s nedostatečným příjmem bílkovin mohou být citlivější na infekční částice, protože buněčná a humorální imunita může být potlačena (Rogers, 1979). Pro správnou funkci organismu je také důležitý optimální příjem minerálních látek a vitamínů. Předpokládané množství minerálních látek potřebné pro správný růst je uvedeno v tabulce 1. Významnými prvky jsou vápník a fosfor. Vápník a fosfor jsou zastoupeny ve velkých koncentracích především v kostech a zubech. Vápník je potřebný pro správné fungování membrán, srážení krve a nervosvalový přenos vzruchu. Fosfor je důležitou stavební jednotkou nukleových kyselin, proteinů, lipidů, sacharidů a vysokoenergetických látek. Při nedostatku těchto minerálních látek se u starších potkanů může projevit osteoporóza (Rogers, 1979; Subcommittee on Laboratory Animal Nutrition et al., 1995). Potřeba vitamínů pro správné prospívání potkanů je shrnuta v tabulce 2. 18

Tabulka 1 Předpokládané množství minerálních látek potřebných pro správný růst laboratorních potkanů v krmivu obsahujícím 90 % sušiny (Keenan et al., 2000; upraveno). Nutrient Potřeba Vápník (%) 0,50 Fosfor (%) 0,30 Hořčík (%) 0,05 Draslík (%) 0,36 Sodík (%) 0,005 Chlorid (%) 0,005 Železo (mg/kg) 35,0 Měď (mg/kg) 5,0 Mangan (mg/kg) 10,0 Zinek (mg/kg) 12,0 Jód (mg/kg) 0,15 Molybden (mg/kg) 0,15 Selen (mg/kg) 0,15 Tabulka 2 Předpokládané množství vitamínů potřebných pro správný růst laboratorních potkanů v krmivu obsahujícím 90 % sušiny (Keenan et al., 2000; upraveno). Vitamín Potřeba Vitamín A (IU/kg) 2300 Vitamín D3 (IU/kg) 1000 Vitamín E (IU/kg) 27,0 Vitamín K (mg/kg fylochinonu) 1,0 Thiamin-HCl (mg/kg) 4,0 Riboflavin (mg/kg) 3,0 Niacin (mg/kg) 15,0 Kyselina pantotenová (mg/kg) 8,8 Vitamín B6 (pyridoxin) (mg/kg) 6,0 Kyselina folová (mg/kg) 1,0 Vitamín B12 (mg/kg) 0,05 Biotin (mg/kg) 0,2 Cholin (volně vázaný) (mg/kg) 750 19

Dostatečný příjem sacharidů je pro potkany důležitý zejména pro úspěšnou reprodukci a laktaci. Sacharidy jsou pro ně hlavním zdrojem energie v krmivu (Keenan et al., 2000), avšak nadměrný příjem sacharidů vede k tloustnutí zvířat, obezitě a vzniku metabolických poruch (Rodrigues et al., 2015). Lipidy by měly být v krmivu zastoupeny v množství kolem 5 15 %. Důležitý je především příjem esenciálních mastných kyselin (EFA). EFA jsou důležité pro dostatečný růst, prevenci abnormalit vyskytujících se na kůži, tvorbu fosfolipidů a triacylglycerolů v tkáních, tvorbu prostaglandinu, zachování správného poměru polynenasycených mastných kyselin (PUFA) pro tvorbu buněčných membrán, vstřebávání a uchovávání vitamínů rozpustných v tucích. Z PUFA je nejdůležitější příjem kyseliny linolové, jež slouží k tvorbě kyseliny arachidonové, která je důležitou součástí buněčných membrán (Lewis et al., 2006). 20

2.4 Transgenní DNA v krmivu a její transfer do organismu V současném světě se zvětšuje nabídka produktů obsahujících geneticky modifikované plodiny jak v oblasti výroby krmiv pro zvířata, tak v oblasti humánní výživy, což vede ke zvýšené potřebě informací týkajících se bezpečnosti GMO plodin. Tyto nové plodiny mají nejen nové a neznámé nutriční hodnoty, ale existuje i riziko přenosu transgenů z takto upravených plodin inkorporovaných z krmiva do krve či orgánů jedince (Řehout et al., 2008; Aumaitre, 2010). Krmné pokusy na zvířatech jsou důležité i z hlediska přesahu do oblasti humánní výživy. Výsledky chování transgenní DNA v průběhu trávicích procesů může naznačit, co se děje s DNA potravy v těle lidí, protože provádět podobné pokusy na člověku je obtížné (EFSA, 2008; Snell et al., 2012). Podle Zdziarski et al. (2014) je nutné provést další krmné pokusy hlavně na potkanech, jelikož studie, které byly doposud zveřejněny, nejsou dostatečně přesvědčivé nebo neobsahují dostatek informací o daných pokusech. Navíc jsou používány různé metodiky pokusů, a tudíž se jednotlivé výstupy nedají snadno porovnat a vyvodit z nich jednotné závěry. Schubbert et al. (1994) jako první provedli studii zabývající se osudem cizorodé transgenní DNA v trávicím traktu pokusného zvířete. Vkládali do krmiva myším kruhovou a lineární DNA fága M13. Výkaly pokusných zvířat původně tuto DNA neobsahovaly. U jedinců krmených 1 7 h před odběrem našli v krvi malé množství DNA fága M13, což podporuje hypotézu, že fragmenty cizorodé DNA po krátkou dobu zůstávají v trávicím traktu a přecházejí do krve jedince. 2.4.1 Krmné studie na potkanech Grønsberg et al., (2011) podávali potkanům v různém stádiu vývoje plazmidovou DNA a zkoumali její přenos do různých tkání. U 4 ze 12 potkanů byla detekována cizorodá DNA alespoň v jednom z těchto orgánů: játrech, mezenterických lymfatických uzlinách, slezině, ledvinách a slinivce. U březích samic nebyly nalezeny žádné fragmenty cizorodé DNA a totéž platí pro jejich plody/mláďata. Tyto poznatky dokazují, že fáze vývoje života jedince nemá vliv na transfer cizorodé DNA. El-Sanhoty et al. (2006) přidali do krmiva potkanů jedné skupiny lyofilizované brambory odrůdy Spunta a do krmiva druhé skupiny přidali geneticky modifikované 21

brambory téže odrůdy. Pro detekci DNA brambor použili primery pro chloroplastovou DNA brambor. Tuto DNA detekovali v játrech, ledvinách, slezině a svalstvu potkanů. Když však použili primery specifické pro GMO odrůdu Spunta, žádný produkt PCR nebyl zachycen. Tento jev vysvětlují tím, že úsek chloroplastové DNA se v buňkách rostliny vyskytuje ve 100 kopiích oproti 1 kopii transgenu a chloroplastová DNA je krátká a odolná vůči degradaci. Kiliç & Akay (2008) sledovali na potkanech vliv krmiva s přídavkem GM Bt kukuřice (vložený gen půdní bakterie Bacillus thuringiensis), ale zaměřili se na celkový zdravotní stav pokusných zvířat oproti kontrolní skupině. Tato dieta neměla žádný vliv na prospívání jedinců ani v jedné ze tří generací, které byly zkoumány. Jedinci podrobení testu nevykazovali náznaky pomalejšího růstu a ani jednotlivé orgány a tkáně nevykazovaly odchylky od kontrolních vzorků. (Tyshko et al., 2014) provedli pokus, při kterém posuzovali vliv krmiva obsahujícího GM kukuřici LibertyLink na tři generace potkanů, jejich reprodukci a vývoj. Kukuřice LibertyLink byla geneticky upravena tak, aby obsahovala gen pat, čímž byla získána odolnost této plodiny vůči glufosinát amonium. Tato chemická sloučenina je účinná látka některých herbicidů používaných v zemědělství. Získaná data potvrdila, že zvířata konzumující GM kukuřici prospívala stejně jako zvířata z kontrolní skupiny. 2.4.2 Krmné studie na brojlerech Řehout et al. (2008) použili ve svém pokusu krmivo s přídavkem GM sóji Roundup Ready (RR), která je odolná vůči glyfosátu a Bt kukuřice MON810. Genomickou DNA získávali z jater a ledvin. Pro identifikace případné cizorodé transgenní DNA v izolátech použili komerční kity pro detekci GMO a to konkrétně GMOIdent Roundup Ready TM Soy a GMOIdent MON810TM Corn (Eurofins GeneScan). Každý z těchto kitů je navržen tak, aby detekoval jednu specifickou oblast transgenní DNA. Bylo odebráno 40 vzorků tkání. Celkem byla transgenní DNA detekována ve třech opakováních. V 17 vzorcích zachytili transgenní DNA v 1 2 opakováních a v 1 vzorku ji zachytili ve všech třech opakováních. Výsledky poukázaly na to, že přenos DNA fragmentů z trávicího traktu do orgánů příjemce je možným rizikem konzumace GM plodin. 22

Naproti tomu další studie provedené Swiatkiewicz et al. (2010) na brojlerech krmených GM Bt kukuřicí a RR sójou nedetekovali pomocí PCR žádné fragmenty DNA těchto krmiv v krvi ani v tkáních kuřat, fragmenty cizorodé DNA byly nalezeny pouze v horní části trávicího traktu, kde nedošlo ke kompletnímu rozkladu. V další studii Rossi et al. (2005) zkoumali obsah svalnatého žaludku, jejuna a slepého střeva brojlerů a také odebírali vzorky krve pokusných zvířat. Jako pozitivní kontrola byla použita detekce genu Zein (v mnoha kopiích se vyskytující gen u kukuřice). Ten byl úspěšně nalezen u většiny jedinců v horním trávicím traktu a v menším počtu případů ve slepém střevu a krvi. Fragment transgenu Cry1Ab byl nalezen pouze ve svalnatém žaludku. Einspanier et al. (2001) nalezli chloroplastovou DNA (199 bp) v malém množství ve svalech, játrech, slezině a ledvinách brojlerů krmených Bt kukuřicí. V průběhu trávení dochází k postupnému trávení DNA obsažené v krmivu. El-Sanhoty (2004) nalezl v jejunu a ileu slepic více krátkých fragmentů (111 bp) DNA GM brambor než v konečných částech GIT. Stejně dopadla i analýza velkých fragmentů rostlinné DNA (1000 bp). U kuřat krmených bramborami byly nalezeny fragmenty chloroplastové DNA v prsním a stehenním svalu, játrech, ledvinách, slezině a kůži, avšak specifické transgenní fragmenty GM brambor nalezeny nebyly. 2.4.3 Krmné studie na snášejících slepicích a křepelkách Ma et al. (2013) zkoumali u snášejících slepic krmených PTC (fytáza transgenní kukuřice) osud trávené DNA a prostup transgenní DNA do krve, tkání a vajec. Fragment DNA běžné kukuřice byl objeven v trávicím traktu zvířat, ale transgenní fragment byl nalezen jev v horní části GIT. Žádné transgenní fragmenty nebyly nalezeny v krvi, srdci, játrech, slezině, prsním svalu nebo vejcích. Halle & Flachowsky (2014) taktéž ve své čtyřgenerační studii použili snášející slepice, které byly krmeny směsí obsahující GM kukuřici Bt 176. U pokusných zvířat nebyly zjištěny žádné rozdíly v růstu, produkci ani reprodukci oproti kontrolním jedincům. Korwin-Kossakowska et al. (2013) v jiné studii použili japonské křepelky (Coturnix cot. japonica) a zkoumali nejen přenos transgenů do tkání jedince, ale i jejich prostup do vajíček. Bylo použito celkem 3 684 křepelek a 4 628 vajíček, křepelky byly krmeny RR sójou a Bt kukuřicí MON 810. Vzorky pro PCR analýzu byly odebrány z prsního svalu, svalnatého žaludku, jater, sleziny, ledvin a srdce. Současně byl odebrán 23

i blastodisk z vajíček. V odebraných vzorcích nebyla nalezená žádná transgenní DNA a dieta neměla žádný negativní efekt na vývoj ptáků a vajíček. 2.4.4 Krmné studie na mléčném skotu Taktéž u mléčného skotu byly provedeny experimenty zahrnující dlouhodobé krmení transgenní Bt kukuřicí. Guertler et al. (2010) ve výkalech těchto zvířat nalezli fragment kukuřičného genu rubisco, ale fragment genu Cry1Ab (transgen) nebyl pomocí PCR detekován. Stejně tak v krvi zvířat byl nalezen fragment genu rubisco (173 bp) a dále Cry1Ab (206 bp), naopak v mléce získaném od zkoumaných jedinců ani jeden z těchto fragmentů nalezen nebyl. Phipps et al. (2003) v další krmné studii na mléčném skotu detekovali kukuřičný transgen Cry1Ab a navíc hledali taktéž transgen z GM sóji cp4epsps. V bachorové tekutině, pevném obsahu duodena a výkalech byl detekován pouze gen rubisco. Zatímco v pevném obsahu bachoru a pevném obsahu duodena byly nalezeny i oba transgenní fragmenty. V krvi byl detekován fragment genu rubisco pouze v jednom případě, další geny však ne. Stejně tak v mléce byl detekován fragment tohoto genu (189 bp) a to u většiny jedinců. Menší fragmenty genu rubisco (351 a 189 bp) byly nalezeny ve všech vzorcích, větší fragmenty (850 a 1176 bp) byly nalezeny pouze v bachorové tekutině a pevném obsahu duodena a 850bp fragment byl nalezen i v krvi. Podobně byl nalezen fragment specifické chloroplastové rostlinné DNA v lymfocytech a trávenině skotu krmeném Bt kukuřicí (Einspanier et al., 2001). 2.4.5 Krmné studie na ostatních živočiších Podobné studie byly provedeny i na větších savcích než jsou potkani či brojleři, a to především na ovcích a prasatech. Sharma et al. (2006) zkoumali ovce, které byly krmeny krmnou dávkou obsahující GM RR řepku (Monsanto) a nalezli specifickou chloroplastovou DNA v obsahu bachoru, slézu a tlustého střeva, v menším počtu případů našli fragmenty genu rbc (rubisco) i transgenní fragment genu cp4 epsps. To znamená, že přijímaná DNA nebyla v průběhu trávení zcela degradována. Také byly nalezeny fragmenty této DNA v játrech a ledvinách. 24

U prasat zkoumali obsah slepého střeva a transgenní fragment cp4 epsps byl nalezen u malého počtu zkoumaných jedinců a to konkrétně u 7 z celkového počtu 108 vzorků. Stejného výsledku bylo dosaženo při analýze obsahu GIT. Při analýze vzorků odebraných z orgánů jako jsou játra, ledviny a slezina, žádná cizorodá DNA nalezena nebyla. Příjem těchto fragmentů do orgánů je velmi malý a fragmenty, které byly nalezeny v GIT, zůstávaly v detekovatelném množství pouze po krátký časový interval po příjmu krmiva. Negativní výsledky u zkoušek na přítomnost transgenní DNA ve tkáních byly dosaženy i u lososů (Salmo salar L.) krmených GM RR sójou. Studie na lososech byla provedena proto, že dosavadní pokusy využívaly jako modelových organismů nepřežvýkavé či přežvýkavé živočichy nebo drůbež. Ryby však mají mírně odlišnou stavbu těla a fyziologie jejich trávicího traktu je také mírně odlišná, ne však natolik, aby byly výsledky těchto studií neporovnatelné. Význam GM sóji ve výživě ryb stále stoupá, jelikož krmiva založená na sóje začínají nahrazovat dříve běžné zdroje bílkovin. Sanden et al. (2004) odebírali vzorky z jater (nejsnazší přenos z krve), svalů (konzumovány člověkem) a mozku. V odebraných tkáních žádnou cizorodou DNA nezaznamenali, ve vzorcích z trávicího traktu hledaná cizorodá DNA objevena byla, nebyla tedy 100% degradována. Tudisco et al., (2006) nalezli v krvi, svalech, ledvinách játrech a srdci některých králíků krmených transgenní RR sójou fragmenty chloroplastové DNA. Fragmenty dalších rostlinných genů, které hledali, však nalezeny nebyly. Chloroplastová DNA je odolnější než genomická DNA, a tak snáze odolává trávicím procesů v GIT. 25

Tabulka 3 Shrnutí krmných studií zabývajících se přenosem transgenní DNA z krmiva do tkání modelových zvířat. Modelové organismy Příměs krmiva Odebírané vzorky Přítomnost cizorodé DNA Autor Myši DNA fága M13 plazmidová DNA krev játra, mezenterické lymfatické uzliny, slezina, ledviny, sliznice plody/mláďata ANO ANO NE (Schubbert et al., 1994) (Grønsberg, 2011) Potkani GM brambory játra, ledviny, slezina, svaly varlata, srdce, plíce, kůže ANO NE (El-Sanhoty et al., 2006) Bt kukuřice žádný vliv na zvířata - LibertyLink kukuřice RR sója Bt kukuřice žádný vliv na zvířata - játra, ledviny ANO (Kiliç & Akay, 2008) (Tyshko et al., 2014) (Řehout et al., 2008) Bt kukuřice RR sója tkáně horní část GIT NE ANO (Swiatkiewicz et al., 2010) Brojleři Bt kukuřice druhý žaludek GIT, krev ANO NE (Rossi et al., 2005) Snášející slepice Bt kukuřice GM brambory svaly, játra, ledviny, slezina GIT, stehenní sval, játra, ledviny, slezina, kůže ANO ANO PTC krev, tkáně vejce NE Bt kukuřice žádný vliv na zvířata - Křepelky Bt kukuřice tkáně, vajíčka NE (Einspanier et al., 2001) (El-Sanhoty, 2004) (Ma et al., 2013) (Halle & Flachowsky, 2014) (Korwinkossakowska et al., 2013) 26

Tabulka 3 Shrnutí krmných studií zabývajících se přenosem transgenní DNA z krmiva do tkání modelových zvířat pokračování. Modelové organismy Příměs krmiva Odebírané vzorky Přítomnost cizorodé DNA Autor Bt kukuřice krev, výkaly ANO (Guertler et mléko NE al., 2010) Mléčný skot Bt kukuřice RR sója GIT, krev ANO (Phipps et al., 2003) Bt kukuřice GIT, lymfocyty ANO (Einspanier et al., 2001) Ovce Prasata Lososi RR řepka RR sója GIT, játra, ledviny GIT orgány ANO ANO NE (Sharma et al., 2006) tkáně NE (Sanden et al., GIT ANO 2004) Králíci RR sója krev, tkáně ANO (Tudisco et al., 2006) 27

3 CÍLE PRÁCE Izolovat DNA ze vzorků krve potkanů odebraných po krmném experimentu s pšenicí Konini. Následně pomocí polymerázové řetězové reakce detekovat přítomnost cizorodé DNA pšenice v DNA izolátu z krve modelových organismů. Potvrdit nebo vyvrátit teorii, že cizorodá DNA z krmiva může být vstřebávána z trávicího traktu do krve a tkání živočichů. 28

4 MATERIÁL A METODIKA 4.1 Pokus na potkanech Pokus probíhal na laboratorních potkanech outbredního kmene Wistar albino, kteří byli zakoupeni z konvenčního chovu BioTest s.r.o. Konárovice. Aby byla krmná skupina co nejhomogennější, byli použiti pouze samci ve věku 6 7 týdnů. Celkem se jednalo o 64 zvířat rozdělených do dvou skupin po 32 jedincích. Zvířata byla chována v prostorách ústavu výživy zvířat a pícninářství (č. j. akreditace 57890/2012-MZE-17214. Pokus probíhal v souladu se zákonem 246/1992 Sb. na ochranu zvířat proti týrání a podle příručky Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Institute of Laboratory Animal Resources et al., 1996) Průměrná počáteční váha zvířat zařazených do kontrolní skupiny byla 239 g a průměrná váha zvířat zařazených do skupiny krmené pšenicí Konini byla 246 g. Prvních 5 dnů po přijetí byla zvířata krmena komerční granulovanou směsí BIOSTAN určenou pro hlodavce. Tato směs se skládá z 92,8 % sušiny, z čehož 26,88 % jsou NL; 3,96 % je vláknina; 4,14 % je tuk a 6,22 % je popel. Plodiny, z nichž byly tyto granule vyrobeny, jsou: pšenice, ječmen setý, oves setý, proso seté, vojtěšková moučka, kukuřice, slunečnice. Po skončení této lhůty byla pokusná skupina zvířat krmena pšenicí Konini, tedy pšenicí s purpurovým zbarvením obilky. Zvířata v kontrolní skupině byla krmena běžnou pšenicí odrůdy Bohemia. 4.1.1 Krmné směsi Pro krmení byly z pšenice vyrobeny suché, které byly potkanům zakládány do krmítek. Příjem krmiva byl denně sledován (přidělené a nezkonzumované krmivo bylo váženo a zaznamenáváno). Aby bylo dosaženo totožného obsahu NL v obou skupinách, bylo kontrolní krmivo z ADW pšenice obohaceno o lepek. Složení jednotlivých krmných směsí je znázorněno v tabulce 4. Data byla získána od Mgr. Ing. Evy Mrkvicové, Ph.D. Během pokusu byly řízeny klimatické podmínky v chovném prostoru. Teplota se průměrně pohybovala kolem 23,5 C a vlhkost byla průměrně 55,7 %. Intenzita světla byla maximálně 200 lx a světelný režim byl zvolen na16 hodin světla a 8 hodiny tmy. 29

Tabulka 4 Zastoupení jednotlivých látek v krmivu zjištěných pomocí laboratorní analýzy. Krmivo Sušina (%) Dusíkaté látky (%) Vláknina (%) Tuk (%) Popel (%) Brutto energie (MJ) Konini 89,07 15,13 2,13 1,44 1,59 15,64 Kontrola 89,11 14,4 2,28 1,63 1,85 15,69 Pokus probíhal po dobu 21 dnů, po této době byli potkani usmrceni předávkováním anestetikem Isofluranem. Krev z pokusných potkanů byla odebírána po uspání punkcí srdce do k tomu určených zkumavek obsahujících 3,6 mg K3EDTA, aby se zabránilo nežádoucímu srážení krve, poté byly vzorky zmraženy na -20 C až do dalšího zpracování. Těla potkanů byla zlikvidována ve Veterinárním asanačním ústavu Medlov s.r.o. 4.2 Izolace živočišné DNA z krve Do krmného pokusu bylo zahrnuto 64 potkanů rozdělených do dvou skupin (kontrolní a pokusná). Pro analýzu jejich DNA bylo náhodně vybráno 6 vzorků ze skupiny krmené purpurovou pšenicí Konini a 6 jedinců krmených kontrolním krmivem skládajícím se z pšenice s běžným zbarvením obilky odrůdy Bohemia. Vzorky byly označeny písmenem P a číslem vzorku, jež odpovídalo pořadí potkanů při odebírání krve. P1 P32 byly vzorky krve potkanů z kontrolní skupiny a P33 P64 byly vzorky krve potkanů krmených pšenicí Konini. Izolace DNA ze vzorků krve potkanů byla provedena pomocí Geneomic DNA Mini Kit (Blood/Cultured Cell) od firmy Genaid. Tento kit je určen pro purifikaci celkové DNA (což zahrnuje genomickou DNA, mitochondriální a virovou DNA) z krve, kultivovaných živočišných buněk nebo trombocytů a leukocytů. Tento kit obsahuje chaotropní sůl jako prostředek pro lýzi buněk a degradaci proteinů, která zároveň umožňuje navázání DNA na silikátovou matrici uvnitř kolonky. Kontaminující látky jsou odstraněny promytím pufrem obsahujícím ethanol a navázaná DNA je eluována pomocí elučního pufru obsahujícím malé množství solí. DNA získaná touto metodou 30

je vhodná pro použití při PCR a dalších enzymatických reakcích (Geneaid.com, nedatováno). Izolace byla prováděna podle výrobcem přiloženého návodu ke Geneaid Genomic DNA Mini Kitu pro izolaci DNA z krve dostupného na Geneaid.com (nedatováno) a následně modifikována. Pomůcky, které byly použity, ale nejsou obsaženy v použitém kitu, zahrnují: mikrozkumavky (1,5 ml), centrifugu, pipety a špičky, termoblok, vortex. Modifikace návodu přiloženého výrobcem: Během přípravy vzorku bylo do mikrozkumavky přeneseno 100 µl vzorku krve oproti standardně používanému množství 200 µl. Ve fázi č 2. lýze buněk byla doba inkubace při teplotě 60 C prodloužena na 1 hodinu (oproti doporučeným 10 minutám). Při lýzi buněk bylo také přidáno 2 µl RNázy A (100mg/ml) z důvodu odstranění nežádoucí RNA. Ve fázi č. 5 DNA eluce bylo přidáno pouze 50 µl předehřátého elučního pufru do středu matrice kolonky pro zvýšení koncentrace DNA. V průběhu izolace (ve druhém kroku, kdy probíhala lýze buněk) byly přidány 2 µl RNázy A (100 mg/ml), což výrobce uvádí jako volitelný krok pro odstranění RNA. Kvůli nedostatečnému výtěžku DNA při prvních izolacích bylo ve druhém kroku při lýze buněk přidáno 20 µl Proteinázy K (izolovaná z Tritirachium album, 20 mg/ml), což bylo provedeno, aby došlo k úplné lýze buněk ve vzorku a uvolnění veškeré DNA. Zároveň byla prodloužena doba inkubace na 1 hodinu opět z důvodu dokonalejší lýzi buněk. Získaná DNA byla krátkodobě přechovávána v lednici při 4 C, mezi analýzami byla DNA umístěna do mrazničky při teplotě -20 C. Kvalita a koncentrace DNA byla ověřena pomocí přístroje Picodrop Spectrometr od firmy Picodrop Ltd., přičemž byly použity 2 µl vzorku obsahujícího DNA a jako slepý vzorek byl použit eluční pufr z Geneomic DNA Mini Kitu (Blood/Cultured Cell) od firmy Genaid. S využitím tohoto kroku byla ověřena koncentrace DNA a jeho kvalita díky poměru absorbancí při 260 nm a 280 nm. 31

4.3 Izolace rostlinné DNA z krmiva Pro izolaci krmiva byl použit DNeasy Plant Mini Kit, jehož výrobcem je firma Qiagen. Tento kit je určen pro snadnou purifikaci DNA z rostlinné nebo houbové tkáně. Výsledkem procedury je zisk celkové DNA (genomická, mitochondriální a chloroplastová) použitelná pro další analýzy jako je např. PCR. DNeasy membrána zajišťuje odstranění všech látek inhibujících PCR a další enzymatické reakce. Purifikovaná DNA je eluována do roztoku s malým obsahem solí. DNA byla izolována ze vzorku krmiva z pšenice odrůdy Bohemia se standardním zbarvením a ze vzorku krmiva z barevné pšenice Konini. Bylo použito 20 mg rostlinného materiálu a byl dodržen postup uvedený výrobcem v příručce ke kitu DNeasy Plant Handbook (Qiagen.com, nedatováno), kde však byl vynechán první krok zahrnující zmražení materiálu tekutým dusíkem, jelikož krmivo již bylo nadrceno. Pro izolaci byly použity následující pomůcky, které nejsou obsaženy v balení s kitem: vybavení pro homogenizaci materiálu, pipety a špičky, termoblok, vortex, ethanol (96 100%), mikrozkumavky, chlazená centrifuga, led. Kvalita a koncentrace DNA byla zjištěna spektrofotometricky pomocí přístroje Picodrop Spectrometr. Měření proběhlo na 2 µl izolátu a jako slepý vzorek sloužil eluční pufr z Dneasy Plant Mini Kit. Získaná DNA v roztoku byla uchovávána při 4 C pro další analýzy. 4.4 Postup PCR 4.4.1 Použité primery Primery byly vybrány z dostupné literatury zabývající se PCR identifikací provozních (housekeeping) genů (referenční gen exprimovaný ve všech tkáních daného organismu) u potkanů. Podle Langnaese et al. (2008) byly vybrány dva provozní geny pro identifikaci DNA potkanů: primery pro gen Gapdh (glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenáza). Sekvenci tohoto genu je možné najít pod číslem NM_017008.4 v nukleotidové databázi NCBI. Tato databáze sdružuje veškerá biomedicínská data a informace o genomech (NCBI, nedatováno). Byly použity primery, které amplifikují specifický fragment tohoto genu o délce 118 bp cdna potkana, tyto primery vypadají následovně: 32

Forward primer: 5 CAACTCCCTCAAGATTGTCAGCAA 3 Reverse primer: 5 GGCATGGACTGTGGTCATGA 3 Jako druhý provozní gen byl vybrán Rpl13a (ribozomální protein L13A), jehož sekvence je dostupná v NCBI databázi pod číslem NM_173340.2, byly syntetizovány primery amplifikující fragment o velikosti 132 bp. Tento gen byl vyřazen, protože nebyl amplifikován při testovací reakci a jako provozní gen byl použit pouze gen Gapdh. Forward primer: 5 GGATCCCTCCACCCTATGACA 3 Reverse primer: 5 CTGGTACTTCCACCCGACCTC 3 Následně byly vybrány dva provozní geny pro identifikaci DNA pšenice. První gen byl provozní gen Gapdh (cytosolická glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenáza). Sekvence tohoto genu je dostupná v databázi NCBI pod číslem AF251217.1. S danými primery tvoří přibližně 400 bp dlouhý produkt s použitou genomickou DNA pšenice. Forward primer: 5 CGAAGCCAGCAACCTATG 3 Reverse primer: 5 CAAAGTGGTCGTTCAGAGCA 3 Jako druhý provozní gen byl zvolen gen pro pšeničný aktin (Actin), dostupný v databázi nukleotidové NCBI pod číslem AB181991.1. Vybrané primery amplifikují část tohoto genu asi o velikosti 500 bp na genomické DNA pšenice (Himi et al., 2011). Forward primer: 5 GAGGGATACACGCTTCCTCA 3 Reverse primer: 5 GAAAGTGCTAAGAGAGGCCAAA 3 PCR primery byly dodány v lyofilizované podobě od firmy Metabion International AG a naředěny do podoby 1 koncentrovaného roztoku, který byl použit k analýze a 10 koncentrovaného roztoku, jenž byl uskladněn při 4 C a ponechán jako roztok zásobní. 33

4.4.2 Příprava a provedení reakce Mastermix pro PCR byl připraven v mikrozkumavce o objemu 1,5 ml přidáváním jednotlivých složek v reakční směsi (Tabulka 5). V reakční směsi byly použity kromě deionizované vody i zelený PCR pufr (Green Go Taq Reaction Buffer, ph 8,5), směs deoxynukleotid trifosfátů (dntp) připravená smícháním stejného množství deoxyadenosin trifosfátu (datp), deoxycytidin trifosfátu (dctp), deoxyguanosin trifosfátu (dgtp) a deoxythymidin trifosfátu (dttp), zpětný a přímý primer a nakonec Taq polymeráza (60 Taq DNA polymarase od značky Promega uchovávaná při -20 C). Po smísení byl mastermix promíchán na vortexu a rozdělen po 24 µl do 0,2ml zkumavek určených pro PCR, nakonec byl do směsi přidán 1 µl vzorku s DNA a zkumavky byly umístěny do termocykleru. Gradientová PCR byla provedena v termocykleru od firmy Quanta Biotech a klasická PCR v termocykleru od firmy Biometra. Tabulka 5 Jednotlivé složky a jejich objem použité pro PCR jednoho vzorku. Složka reakce Objem reagencií (µl) deionizovaná H2O 16,8 PCR pufr 5 směs dntp 0,1 primer přímý 1 primer zpětný 1 Taq polymeráza 0,1 Teplotní a časový profil pro PCR provedenou s primery pro gen Gapdh u potkanů, primery pro gen Rpl13a a gen Gapdh u pšenice je uveden v tabulce 6 a profil reakce s primery pro pšeničný Actin je uveden v tabulce 7. 34

Tabulka 6 Časový a teplotní profil PCR pro gen Gapdh. Fáze Teplota Délka Počáteční denaturace 94 C 3 min Denaturace 94 C 30 s Annealing 60 C 45 s Počet opakování 30 Elongace 72 C 60 s Závěrečná polymerační reakce 72 C 5 min Tabulka 7 Časový a teplotní profil PCR pro gen Actin. Fáze Teplota Délka Počáteční denaturace 94 C 3 min Denaturace 94 C 30 s Annealing 62 C 45 s Počet opakování 30 Elongace 72 C 60 s Závěrečná polymerační reakce 72 C 5 min 35

4.5 Gelová elektroforéza Pro separaci jednotlivých PCR produktů byla použita 1% agarózová elektroforéza (Serva Blue Marine 200), její příprava probíhala podle následujícího postupu: Bylo odměřeno 1274 ml deionizované H20, poté bylo odměřeno 26 ml 50 TAE pufru, TAE pufr byl přidán do odměřené vody, po důkladném promíchání bylo odlito 160 ml směsi a přidáno 1,6 g agarózy, po promíchání byla směs provařena v mikrovlnné troubě po dobu asi 3,5 minuty (aby došlo k úplnému rozpuštění agarózy). Po povaření byla směs mírně zchlazena a bylo přidáno 1,5 µl EtBr, poté byl do vany pro elektroforetický gel nasazen hřebínek pro tvorbu jamek, následně byla směs nalita do elektroforetické vany, vytvořené bublinky byly odstraněny a směs se nechala ztuhnout. Po ztuhnutí byla vana zasazena do přístroje na elektroforézu, posléze byl zbytek zředěného TAE pufru nalit na gel, po nalití pufru byl vyndán hřebínek pro tvorbu jamek, do nichž byly napipetovány vzorky a velikostní marker. Přístroj na elektroforézu byl uzavřen a elektroforéza byla spuštěna. Elektroforéza probíhala po dobu jedné hodiny při 69 V. Jako nanášecí pufr při elektroforéze sloužil PCR pufr, Green GoTaq Reaction Buffer, který má ph 8,5 a obsahuje modré barvivo pro zviditelnění. Na gel se nanášelo 20 µl vzorku a 12 µl markeru Produkt PCR byl zviditelněn pomocí přídavku ethidium bromidu do gelu a po separaci byly fragmenty zviditelněny v transiluminátoru a vyfoceny. Vyhodnocení bylo provedeno pomocí určení velikostí výsledných fragmentů, k čemuž sloužil 100 bp PCR ladder od firmy New England Biolabs jako marker při elektroforéze. 36

5 VÝSLEDKY A DISKUSE 5.1 Izolace DNA Tabulka 8 ukazuje výsledky měření koncentrace a čistoty DNA v roztoku po izolaci pomocí komerčních kitů. Tabulka 8 Koncentrace a čistota DNA izolované z krve potkanů a ze vzorků krmiva měřená spektrofotometricky. Vzorek Koncentrace (ng/µl) A 260/280 P5 5,3 1,602 P11 4,2 1,195 P12 3,6 1,186 P14 7,5 1,431 P22 5,6 1,738 P26 8,7 1,810 P34 5,7 1,337 P42 16,9 2,909 P45 7,5 1,400 P49 5,3 2,269 P53 4,9 2,487 P59 7,2 1,766 krmivo Konini 74,2 1,665 krmivo kontrola 62,0 1,657 Popis tabulky: P5 P59) vzorky obsahující DNA potkanů izolovanou z krve, krmivo Konini a kontrola) vzorky obsahující DNA z krmiv. 37

5.1.1 Problémy při izolaci DNA Přestože byl při prvních pokusech o izolaci DNA ze zmražené krve dodržen postup doporučovaný výrobcem, izolovanou DNA se nepodařilo získat v dostatečné koncentraci a čistotě. Autoři Grønsberg et al. (2011); El-Sanhoty et al. (2006) použili k izolaci DNA v podobné studii komerční kit od firmy Qiagen, pomocí něhož izolovali dostatečné množství DNA pro PCR (20 30 ng/µl). Krev, ze které byla DNA izolována, byla zmražená, tudíž mohlo dojít k nedokonalému rozmražení tekutiny nebo k nedostatečnému promíchání vzorku. Krev také mohla být příliš rychle rozmražena. Tudisco et al. (2006) při izolaci DNA z krve králíků doporučují velmi pomalé zahřívání zmražených vzorků v ledové lázni, aby nedošlo k poškození obsažené DNA. Při dalším opakování se však kvalita izolované DNA nezlepšila, proto se přistoupilo k modifikaci izolačního postupu. Krev byla skladována při -20 C, takže nemohlo dojít k znehodnocení DNA v důsledku dlouhého skladování. Tento jev by mohl nastat, pokud by krev byla skladována při 4 C Richardson et al. (2006) pozorovali klesající výtěžnost izolace DNA z krve až po uskladněním delším než 200 dní při uskladnění při 4 C. Výrobcem doporučené množství krve (200 µl) bylo zredukováno, aby došlo k dokonalejší lýzi buněk ve vzorku a nedocházelo ke tvorbě sraženiny při přečišťování vzorku během izolace. Ze stejných důvodů byla při izolaci přidána Proteináza K a byla zvýšena doba inkubace během lýzi buněk na 1 hodinu. Proteináza K, jak uvádí Eychner et al. (2014) slouží k narušení buněk a uvolňování DNA z jádra. Po izolaci DNA ze vzorků krve potkanů s výše popsanými modifikacemi byla získána dostatečně kvalitní DNA pro následující reakce, což je znázorněno na obrázku 6, 7 a 8. Hodnoty získané spektrofotometricky pomocí přístroje Picodrop spectrometr nemusí být zcela přesné, jelikož koncentrace DNA ve vzorku je velmi nízká a tudíž špatně měřitelná (Picodrop.com, nedatováno). Z tabulky 8 je patrné, že izolovaná DNA nebyla příliš čistá. Pokud je poměr absorbancí A260/280 vzorku roven 1,8, je DNA považována za čistou, pokud je tato hodnota menší než 1,8, jedná se o znečištění proteiny, fenolem nebo dalšími kontaminanty. Při vyšší absorbanci než 1,8 se jedná o znečištění RNA (Wilfinger et al., 1997). 38

5.2 PCR a její vizualizace 5.2.1 Optimalizace pro specifické primery DNA potkanů Pro úspěšnou detekci DNA pomocí PCR metody bylo nejprve potřeba zjistit optimální teplotu annealingu pro jednotlivé páry primerů. Optimalizace PCR je podle Roux (2009) důležitá pro to, aby nedošlo k amplifikaci nespecifických fragmentů místo získání požadovaného DNA produktu. Obrázek 4 ukazuje výslednou vizualizaci agarózového gelu po provedení PCR při annealingové teplotě 60 C pro oba primery určené pro identifikaci DNA potkanů. Pro tento test byl použit vzorek DNA potkana P59, který byl vybrán, protože se vyznačoval vyšší koncentrací a čistotou než ostatní vzorky izolované DNA. Jako kontrola byl použit vzorek DNA z krmiva konkrétně krmivo Konini. Obrázek 4 Gel získaný po PCR při annealingové teplotě 60 C. Popis obrázku: M) velikostní marker, 1) P59 s primery GCH1 specifickými pro kuře, 2) DNA kuřete s primery GCH1 specifickými pro kuře, 3) DNA kapra s primery GCH1 specifickými pro kuře, 4) krmivo Konini s primery GCH1 specifickými pro kuře, 5) P59 s primery Gapdh specifickými pro potkana, 6) DNA kuřete s primery Gapdh specifickými pro potkana, 7) DNA kapra s primery Gapdh specifickými pro potkana, 8) krmivo Konini s primery Gapdh specifickými pro potkana, 9) P59 s primery Rpl13 specifickými potkana, 10) DNA kuřete s primery Rpl13 specifickými pro potkana, 11) DNA kapra s primery RPL13 specifickými pro potkany, 12) Krmivo Konini, primery Rpl13 specifické pro potkany. 39

Pomocí této testovací PCR byla zjišťována správná teplota nejen pro vzorky DNA potkanů a příslušné primery, ale také pro vzorky z kuřat a kaprů, jenž byly podrobeny podobnému krmnému pokusu s pšenicí Konini, a pro ně specifických primerů. Z tohoto důvodu jsou na vizualizaci gelu zobrazeny i tyto produkty PCR. Z vizualizace agarózového gelu vzorků po PCR je patrné, že DNA genu Gapdh ze vzorku potkana byla namnožena pomocí příslušného primeru (jamka č. 5), tudíž teplota annealingu 60 C je pro tento pár primerů optimální. Do jamky č. 9 byl nanesen vzorek DNA potkana a primery pro gen Prpl13. Na obrázku je patrné, že došlo ke špatnému namnožení hledané PCR a navíc došlo během PCR ke tvorbě nespecifických fragmentů, a tudíž není tato annealingová teplota optimální pro tento pár primerů. Potvrdilo se, že u vzorků DNA neobsahujících DNA potkana neproběhla PCR s primery pro gen Gapdh (jamka č. 6, 7 a 8). Naopak u jamky č. 10, 11 a 12 došlo k tvorbě nespecifických fragmentů, takže primery Rpl13 nasedaly i na ostatní vzorky nejen na DNA izolovanou z krve potkanů. Obrázek 5 zobrazuje stejný test jako předchozí obrázek gelu, ale tentokrát při annealingové teplotě 58 C. Přestože primery pro gen Gapdh nasedaly dostatečně specificky na templátovou DNA, ověřili jsme, zda je annealing pro 60 C skutečně nejoptimálnější pro další analýzy. Jako vzorek DNA potkana byl znovu zvolen vzorek P59. 40

Obrázek 5 Gel získaný po PCR při annealingové teplotě 58 C. Popis obrázku: M) velikostní marker, 1) P59 s primery GCH1 specifickými pro kuře, 2) DNA kuřete s primery GCH1 specifickými pro kuře, 3) DNA kapra s primery GCH1 specifickými pro kuře, 4) krmivo Konini s primery GCH1 specifickými pro kuře, 5) P59 s primery Gapdh specifickými pro potkana, 6) DNA kuřete s primery Gapdh specifickými pro potkana, 7) DNA kapra s primery Gapdh specifickými pro potkana, 8) krmivo Konini s primery Gapdh specifickými pro potkana, 9) P59 s primery Rpl13 specifickými potkana, 10) DNA kuřete s primery Rpl13 specifickými pro potkana, 11) DNA kapra s primery RPL13 specifickými pro potkany, 12) Krmivo Konini s primery Rpl13 specifické pro potkany. Z obrázku je patrné, že optimální teplota pro nasedání primerů Gapdh je 60 C, což odpovídá metodice, kterou uvádí Langnaese et al. (2008). Při teplotě annealingu 58 C došlo nejen k amplifikaci požadovaného fragmentu, ale taktéž ke tvorbě nespecifických fragmentů, které by mohly ovlivňovat výsledek PCR. Primer Rpl13 nefungoval správně ani při nasedání při 58 C ani při 60 C, pokaždé došlo k tvorbě druhého nespecifického fragmentu a dalších nespecifických fragmentů u dalších vzorků. Z tohoto důvodu byly pro další analýzy vybrány primery amplifikující specifickou oblast genu Gapdh potkanů. Také velikost amplifikovaného fragmentu odpovídá délce fragmentu 118 bp v cdna (Langnaese et al., 2008). 41

5.2.2 Optimalizace pro specifické primery DNA pšenice Stejně jako v předcházející kapitole bylo potřeba optimalizovat teplotu annealingu specifických pšeničných primerů. Nejprve byla provedena PCR s teplotou annealingu nastavenou na 60 C (Obrázek 6). Obrázek 6 Gel získaný po PCR při annealingové teplotě 60 C. Popis obrázku: M) velikostní marker, 1) P59 s primery Actin specifickými pro pšenici, 2) DNA kuřete s primery Actin specifickými pro pšenici, 3) DNA kapra s primery Actin specifickými pro pšenici, 4) krmivo Konini s primery Actin specifickými pro pšenici, 5) P59 s primery Gapdh specifickými pro pšenici, 6) DNA kuřete s primery Gapdh specifickými pro pšenici, 7) DNA kapra s primery Gapdh specifickými pro pšenici, 8) krmivo Konini s primery Gapdh specifickými pro pšenici, 9) P59 s primery 40S specifickými kapra, 10) DNA kuřete s primery 40S specifickými pro kapra, 11) DNA kapra s primery 40S specifickými pro kapra, 12) Krmivo Konini, primery 40S specifické pro kapra. Do jamky č. 4 byla nanesena pšeničná DNA a přidány specifické primery pro pšeničnou DNA, tudíž měla proběhnout amplifikace specifického fragmentu, ke které nedošlo. Pravděpodobně došlo k chybě při přípravě PCR reakční směsi, jako například nepřimíchání vzorku s DNA, nebo špatné promíchání směsi. Tento fragment by se měl při annealingové teplotě 60 C po PCR na gelu objevit (Obrázek 8). Naopak v jamce č. 8 je vidět, že byl pomocí primerů pro Gapdh namnožen specifický fragment pšeničné DNA o velikosti přibližně 400 bp a nedošlo k tvorbě 42

nespecifických fragmentů. Podle přiložení pomocí nástroje Primer-BLAST, který umožňuje srovnání ověřovaných primerů s nukleotidovou databází (Primer-BLAST, nedatováno), by měla být velikost fragmentu amplifikovaná těmito primery 174 bp, avšak tento údaj platí pro cdna. Zde byla použita genomická DNA, takže je pravděpodobné, že větší velikost fragmentu je zapříčiněna přítomností intronu. Následující reakce byla opět provedena za stejných podmínek a se stejnými vzorky, ale při nižší teplotě annealingu (Obrázek 7). Obrázek 7 Gel získaný po PCR při annealingové teplotě 58 C. Popis obrázku: M) velikostní marker, 1) P59 s primery Actin specifickými pro pšenici, 2) DNA kuřete s primery Actin specifickými pro pšenici, 3) DNA kapra s primery Actin specifickými pro pšenici, 4) krmivo Konini s primery Actin specifickými pro pšenici, 5) P59 s primery Gapdh specifickými pro pšenici, 6) DNA kuřete s primery Gapdh specifickými pro pšenici, 7) DNA kapra s primery Gapdh specifickými pro pšenici, 8) krmivo Konini s primery Gapdh specifickými pro pšenici, 9) P59 s primery 40S specifickými kapra, 10) DNA kuřete s primery 40S specifickými pro kapra, 11) DNA kapra s primery 40S specifickými pro kapra, 12) Krmivo Konini, primery 40S specifické pro kapra. Při podrobném zkoumání gelu vychází najevo, že při annealingové teplotě vznikají při použití obou párů primerů specifických pro pšenici nespecifické fragmenty. I když je u jamek č. 4 patrné, že došlo k amplifikaci požadovaného fragmentu o velikosti přibližně 500 bp, což odpovídá výsledku z přiložení těchto primerů k dané sekvenci v nástroji Primer-BLAST, jenž ukázal velikost výsledného fragmentu 558 bp na cdna. Na amplifikovaném fragmentu se pravděpodobně nenachází žádný intron. 43

Kvůli tvorbě nespecifických produktů však není annealingová teplota 58 C vhodná ani pro jeden z primerů specifických pro pšenici. Protože při dvou předcházejících PCR nebyla odhalena optimální teplota annealingu pro amplifikaci pšeničného genu Actin, přistoupilo se ke gradientové PCR, kde lze nastavit rozdílné teploty annealingu pro testovaný vzorek a tudíž snadno určit nejoptimálnější teplotní rozmezí. Tato PCR byla provedena pouze s jedním vzorkem krmiva a to s krmivem Konini a rozmezí teplot začínalo na 56 C a končilo téměř na 62 C (Obrázek 8). Obrázek 8 Vizualizace agarózového gelu po gradientové PCR pro primery pšeničného genu Actin pro optimalizaci annealingové teploty. Popis obrázku: M) velikostní marker, 1) krmivo Konini (annealing 56 C), 2) krmivo Konini (annealing 57,2 C), 3) krmivo Konini (annealing 58 C), 4) krmivo Konini (annealing 58,9 C), 5) krmivo Konini (annealing 59,9 C), 6) krmivo Konini (annealing 60,8 C), 7) krmivo Konini (annealing 61,9 C). Na obrázku se ukázalo, že nižší teploty annealingu při použití těchto primerů, mají za následek tvorbu nežádoucích nespecifických fragmentů. Jelikož by tyto fragmenty mohly ovlivnit výsledky dalších analýz, byla pro tyto primery k dalším analýzám použita teplota annealingu 62 C. Vzorek v jamce č. 7 je nejzřetelnější a nejsou kolem něj viditelné žádné rušivé fragmenty. Takto vysoká teplota annealingu při PCR je poměrně neobvyklá, ale zvyšuje se specifita detekce transgenů ze vzorků krve potkanů (Rychlik et al., 1990). 44

5.2.3 Detekce DNA potkanů v izolátu z krve Po tom, co byla optimalizována PCR pro primery Gapdh, byla provedena detekce tohoto specifického fragmentu DNA potkanů v izolátu DNA. PCR byla provedena celkem se 14 vzorky. 6 vzorků byla DNA potkanů ze skupiny krmené pšenicí Konini a dalších 6 vzorků byla DNA jedinců z kontrolní skupiny. Poslední 2 vzorky, krmivo Konini a krmivo kontrola. Cílem této PCR bylo dokázat, že izoláty skutečně obsahují DNA potkanů a PCR pro tento specifický pár primerů je správně optimalizovaná (Obrázek 9). Obrázek 9 Výsledné zobrazení PCR provedené s DNA potkanů a kontrolní DNA krmiva a primery specifickými pro DNA gen potkana Gapdh při annealingové teplotě 60 C. Popis obrázku: M) velikostní marker, 1) P5, 2) P11, 3) P12, 4) P14, 5) P22, 6) P26, 7) P34, 8) P42, 9) P45, 10) P49, 11) P53, 12) P59, 13) krmivo Konini, 14) krmivo kontrola. Z výše zobrazeného gelu je zřejmé, že vzorky DNA krmiva, jež byly použity jako kontrola (jamky č. 13 a 14), neobsahují DNA potkanů. Na gelu není zřetelný žádný fragment. Naopak je jasné, že vzorky DNA izolované z krve potkanů skutečně DNA potkanů obsahují. Vzorek nanesený do jamky č. 8 nebyl ve směsi pro PCR amplifikován, jelikož nevidíme 118bp dlouhý fragment jako u ostatních vzorků. Tato chyba mohla být způsobena jednak chybou při přípravě mastermixu pro PCR, nepřidáním templátové DNA do PCR nebo nebyla DNA ve vzorku P42 dostatečně koncentrovaná nebo byla příliš znečištěná. Pro potvrzení, že všechny získané izoláty 45

obsahují skutečně DNA potkanů, bylo provedeno opakování PCR s primery specifickými pro jejich DNA. K tomuto účelu vylo vybráno pouze 5 vzorků zahrnujících vzorek P42, který nebyl během předchozí PCR amplifikován (Obrázek 10). Parametry PCR byly nastaveny na stejné hodnoty jako u předchozí PCR. Obrázek 10 Výsledek PCR vybraných vzorků DNA potkana a primery specifickými pro DNA potkana gen Gapdh. Popis obrázku: M) velikostní marker, 1) P34, 2) P42, 3) P45, 4) P49, 5) P53. Z obou výše uvedených gelů vychází tvrzení, že u všech 12 vzorků bylo prokázáno, že obsahují DNA potkanů, což je důležité pro další analýzy. Na obrázku jsou patrné 118bp fragmenty DNA potkanů a vyplývá z něj, že vzorek P42, který byl umístěn do jamky č. 2, pravděpodobně nebyl při první PCR přenesen do reakční směsi nebo došlo k jeho nedostatečnému rozmražení či rozmíchání. K amplifikaci tak nedošlo kvůli problému při přípravě reakce nikoliv nepřítomnosti DNA potkana nebo její nekvalitě pro potřebné reakce. 46

5.2.4 Detekce DNA z krmiva v DNA potkanů Po průkazu DNA potkana ve všech vzorcích byla provedena samotná detekce rostlinné DNA v krvi zkoumaných potkanů. Pro tuto analýzu bylo použito 12 vzorků obsahujících izolát DNA potkanů a jako pozitivní kontrola byly použity vzorky obsahující izolovanou DNA kontrolního krmiva a krmiva obsahujícího Konini. Ke stanovení byly nejprve použity primery pro gen Gapdh (Obrázek 11) a následně primery Actin (Obrázek 12). Parametry PCR byly nastaveny podle předchozí optimalizace. Teplota annealingu pro primery Gapdh byla 60 C a teplota annealingu primerů Actin byla 62 C. Byly použity všechny vzorky, u kterých bylo primárně určeno, že obsahují dostatečné množství DNA potkanů pro PCR. Obrázek 11 Agarózový gel po vizualizaci, který zobrazuje výsledek opakování PCR vzorků DNA potkanů a krmiva při použití specifických primerů pro pšeničný gen Gapdh při annealingové teplotě 60 C. Popis obrázku: M) velikostní marker, 1) P5, 2) P11, 3) 12, 4) P14, 5) P22, 6) P26, 7) P34, 8) P42, 9) P45, 10) P49, 11) P53, 12) P59, 13) krmivo Konini, 14) krmivo kontrola. 47