Molekulárně biologické metody princip, popis, výstupy

Podobné dokumenty

Predikce epidemií listerióz molekulárně biologickými metodami

EKONOMICKÉ ASPEKTY GENETICKÝCH VYŠETŘENÍ. I. Šubrt Společnost lékařské genetiky ČLS JEP

PŘEHLED SEKVENAČNÍCH METOD

Detekce a typizace bakteriálních původců alimentárních onemocnění. Tereza Gelbíčová

Sekvenování nové generace. Radka Reifová

MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÉ METODY V ENVIRONMENTÁLNÍ MIKROBIOLOGII. Martina Nováková, VŠCHT Praha

Ondřej Scheinost Nemocnice České Budějovice, a.s.

Sekvenování nové generace. Radka Reifová

MOLEKULÁRNĚ-BIOLOGICKÉ METODY V SURVEILLANCE A ŠETŘENÍ EPIDEMIÍ

Nové technologie v mikrobiologické laboratoři, aneb jak ovlivnit čas k získání klinicky relevantního výsledku

Genetický polymorfismus jako nástroj identifikace osob v kriminalistické a soudnělékařské. doc. RNDr. Ivan Mazura, CSc.

Sekvenování příští generace (Next Generation Sequencing, NGS)

1. Definice a historie oboru molekulární medicína. 3. Základní laboratorní techniky v molekulární medicíně

V. letní škola metod molekulární biologie nukleových kyselin a genomiky Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat AF MENDELU

Molekulární diagnostika

Met e o t d o y d m ol o ek e ul u ár á n r í n í g e g n e e n t e i t ky v m ikro r b o i b ol o og o i g i Pavel Dřevínek

Biotechnologický kurz. II. letní škola metod molekulární biologie nukleových kyselin a genomiky

Masivně paralelní sekvenování

Využití DNA sekvencování v

Genotypování: Využití ve šlechtění a určení identity odrůd

Masivně paralelní sekvenování

Analýza DNA. Co zjišťujeme u DNA DNA. PCR polymerase chain reaction. Princip PCR PRINCIP METODY PCR

Biotechnologický kurz. III. letní škola metod molekulární biologie nukleových kyselin a genomiky

DY D NE N X Hana Vlastníková

Metody molekulární biologie

2 Inkompatibilita v systému Rhesus. Upraveno z A.D.A.M.'s health encyclopedia

Biotechnologický kurz. II. letní škola metod molekulární biologie nukleových kyselin a genomiky

NGS analýza dat. kroužek, Alena Musilová

Role epidemiologa v systému používajícím molekulární surveillance. Jana Prattingerová Státní zdravotní ústav

Využití DNA markerů ve studiu fylogeneze rostlin

6. Kde v DNA nalézáme rozdíly, zodpovědné za obrovskou diverzitu života?

MOLEKULÁRNÍ TAXONOMIE - 4

Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ

Elektroforéza Sekvenování

Molecular Ecology J. Bryja, M. Macholán MU, P. Munclinger - UK

Metody používané v MB. analýza proteinů, nukleových kyselin

Automatizace v klinické mikrobiologii

Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ

Surveillance invazivního meningokokového onemocnění a doporučená vakcinační strategie v České republice

Genetické markery, markery DNA

Mendelova genetika v příkladech. Genetické markery

Metody používané v MB. analýza proteinů, nukleových kyselin

Co zjišťujeme u DNA ACGGTCGACTGCGATGAACTCCC ACGGTCGACTGCGATCAACTCCC ACGGTCGACTGCGATTTGAACTCCC

Aplikace molekulárně biologických postupů v časné detekci sepse

Využití molekulárních markerů v systematice a populační biologii rostlin. 10. Další metody

Mgr. et Mgr. Lenka Falková. Laboratoř agrogenomiky. Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Mendelova univerzita

Mikrosatelity (STR, SSR, VNTR)

Molekulární genetika

Inovace studia molekulární a buněčné biologie

Využití molekulárních markerů v systematice a populační biologii rostlin. 11. Next generation sequencing (NGS)

Genetický polymorfismus

Využití metod strojového učení v bioinformatice David Hoksza

Identifikace stafylokoků prostřednictvím sekvenování konzervativních genů

Využití rep-pcr v bakteriální taxonomii

Analýza DNA. Co zjišťujeme u DNA

Vzdělávací materiál. vytvořený v projektu OP VK CZ.1.07/1.5.00/ Anotace. Biosyntéza nukleových kyselin. VY_32_INOVACE_Ch0219.

Invazivní meningokokové onemocnění v České republice v roce 2017

Genetické markery - princip a využití

Význam sekvenační analýzy v mikrobiologické diagnostice

Inovace studia molekulární a buněčné biologie reg. č. CZ.1.07/2.2.00/

Využití rekombinantní DNA při studiu mikroorganismů

Nové přístupy v modifikaci funkce genů: CRISPR/Cas9 systém

Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ

Metagenomika NGS (454, Illumina, IonTorrent) Petra Vídeňská, Ph.D.

RIGORÓZNÍ OTÁZKY - BIOLOGIE ČLOVĚKA

Málo obvyklé nemocniční nákazy

L. acidophilus_(psmm _ TIDE):

Mikrosatelity (STR, SSR, VNTR)

EKO/MEM - Molekulární ekologie mikroorganizmů Klonování a sekvenování přírodní DNA základ pro fylogenetickou analýzu společenstva

Co zjišťujeme u DNA ACGGTCGACTGCGATGAACTCCC ACGGTCGACTGCGATCAACTCCC ACGGTCGACTGCGATTTGAACTCCC

Molekulární metody ve studiích kořenových systémů. Jiří Košnar, 2016

Inovace studia molekulární a buněčné biologie

CVIČENÍ II. IZOLACE DNA, DETEKCE GENŮ METODOU PCR, STANOVENÍ PŘÍBUZNOSTI IZOLÁTŮ METODOU ERIC PCR

KLASIFIKACE A IDENTIFIKACE BAKTERIÍ

Metody studia historie populací. Metody studia historie populací

Polyfázová identifikace kmenů Aeromonas encheleia

Osekvenované genomy. Pan troglodydes, Neandrtálec, 2010

Centrum aplikované genomiky, Ústav dědičných metabolických poruch, 1.LFUK

Fingerprinting mikrobiálního společenstva (DGGE/TGGE, RFLP,T-RFLP, AFLA, ARDRA, (A)RISA)

Výzkumné centrum genomiky a proteomiky. Ústav experimentální medicíny AV ČR, v.v.i.

Interpretace výsledků bakteriologických vyšetření

Tematické okruhy k SZZ v bakalářském studijním oboru Zdravotní laborant bakalářského studijního programu B5345 Specializace ve zdravotnictví

USING OF AUTOMATED DNA SEQUENCING FOR PORCINE CANDIDATE GENES POLYMORFISMS DETECTION

Pracovní skupina pro molekulární mikrobiologii TIDE

Invazivní meningokokové onemocnění v České republice v roce 2018

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti NUKLEOVÉ KYSELINY

DYNEX nabízí komplexní řešení v oblasti zpracování a analýzy biologických materiálů pomocí molekulárně biologických metod.

Molekulárně biologické a cytogenetické metody

Genetické metody v zoologii

Nové technologie v mikrobiologické diagnostice a jejich přínos pro pacienty v intenzivní péči


Struktura a analýza rostlinných genomů Jan Šafář

STRATEGIE NEXT-GENERATION SEKVENOVÁNÍ PRO REALIZACI PROJEKTŮ MALÉHO AŽ STŘEDNÍHO ROZSAHU NÁVOD NA OBJEDNÁNÍ

Nukleové kyseliny Replikace Transkripce translace

Využití metagenomiky při hodnocení sanace chlorovaných ethylenů in situ Výsledky pilotních testů

Pulzní gelová elektroforéza Při konvenční gelové elektroforéze je rozdělení molekul je podmíněno rychlejším průchodem menších molekul pórovitou

Masivně paralelní sekvenování v diagnostice závažných časných epilepsií. DNA laboratoř KDN 2.LF a FN v Motole

Struktura a funkce biomakromolekul

Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a Státním rozpočtem ČR InoBio CZ.1.07/2.2.00/

Transkript:

& Molekulárně biologické metody princip, popis, výstupy Klára Labská Evropský program pro mikrobiologii ve veřejném zdravotnictví (EUPHEM), ECDC, Stockholm NRL pro herpetické viry,centrum epidemiologie a mikrobiologie, Státní zdravotní ústav

ÚVOD využití molekulárně biologických metod v mikrobiologii a epidemiologii zkvalitnění laboratorní diagnostiky infekčních onemocnění surveillance infekčních onemocnění terapie infekčních onemocnění Přesná surveillance data jsou předpokladem: účinné kontroly infekčních onemocnění provádění opatření v ohnisku onemocnění hodnocení účinnosti vakcinační strategie a doporučování její aktualizace Molekulární metody jsou postupně zaváděny v evropských zemích do rutinního použití v surveillance infekčních onemocnění. Molekulární epidemiologická data jsou mezinárodně srovnatelná, globální surveillance řešení přeshraničních hrozeb infekčních onemocnění.

Cíle sdělení Popsat: Metody bez potřeby celogenomového sekvenování PFGE MLST MLVA Ribotypizace Sequence-based typing (SBT); Rozdíl mezi klasickou sekvenací a metodami NGS (next generation sequencing) Metodu celogenomového sekvenování - WGS - její aplikace

Makrorestrikční analýza pulzní gelová elektroforéza (PFGE) Nukleová kyselina patogenu je štěpena bez amplifikace Restrikčními endonukleázami enzymy, které štěpí NA vždy v určité sekvenci (palindrom) Následná elektroforéza v pulzním elektrickém poli Pulzotyp= restrikční profil Lze porovnat Standartizováno (PulseNet)

PFGE -využití zůstává jako podpůrná typizační metoda Listeria monocytogenes Salmonella enterica Shiga toxin-producing E. coli (STEC) https://uvmgg.fandom.com/wiki/pulsed_field_gel_electrophoresis

MLVA =Multiple Loci Variable number of tandem repeats Analysis PCR amplifikace úseků s repetitivními sekvencemi a elektroforetické stanovení délky Variabilní úseky= lokusy Různý počet lokusů pro různé sp. Standartizovaný protokol (PulseNet, ECDC) MLVA profil např 14-0-2-4-1-7-1-6 (=8 lokusů)

MLVA využití Salmonella enterica spp. enteritidis (sekundární metoda) Shiga toxin-producing E. coli (STEC) Mycobacterium tuberculosis complex MIRU VNTR (mycobacterial interspersed repetitive units)

Ribotypizace Stejný princip jako MLVA Clostridium difficile U prokaryot geny pro16s ribosomalní RNA, 23S ribosomalní RNA, and 5S rrna jsou v organizovány do operonu Clostridium difficile 11 RNA operonů standartizovaný protokol (ECDC) nomenklatura (https://webribo.ages.at/webribo)

MLST =multi locus sequencing PCR amplifikace vybraných house keeping genů (5-7) a jejich sekvenace jedna varianta sekvence genu = alela Kombinací alel vzniká ST sequence type = sekvenční typ CC klonální komlex = skupina sekvenčních typů http://beta.mlst.net/instructions/default.html

MLST -využití Standartizované protokoly a databáze na https://pubmlst.org/databases/ Pro více než 100 druhů prokaryot a eukaryot

Sequence-based typing (SBT) Varianta MLST pro Legionella pneumophila Kromě housekeeping genů i faktory virulence European Working Group for Legionella Infections (EWGLI) Protokol Databáze s nomenklaturou číslování alel, ST sekvenční typy

Sekvenace = získání informace o sekvenci (pořadí nukleotidů) 1977 Frederic Sanger Princip dideoxynukleotidů Terminátory řetězce při amplifikaci DNA Následná elektroforéza Délka sekvenovaného úseku cca 800-1500 pb Rozlišení přítomnosti heterogenních sekvencí cca od 20% Úsek čtený z obou stran

Next-Generation (NGS) sekvenování nové generace Zastřešující termín pro vysokovýkonnostní sekvenační platformy = Masivní paralelní sekvenace Illumina (Solexa) sequencing Ion torrent: Proton / PGM sequencing SOLiD sequencing Pacific Biosciences RS MinION Nanopore Jednotlivé platformy se liší v objemu dat, chybovosti, délce osekvenovaného fragmetu a ceně

izolace cílové DNA/RNA sekvenace Složení cílové sekvence příprava DNA knihovny čištění dat

Analýza WGS dat MLST analýzy 1: Core genome = geny by měly mít všichni zástupci druhu 2: Disposable genome = volný 3: unique genome = unikátní MLST (7 house-keeping genů/lokusů) r MLST (53 genů/lokusů ribozomálních proteinů) cg MLST (core genom cca 1000-3000 genů/lokusů) wg MLST (core genom + accesory genom) } Accessory genom doplňkový 3 2 2 1 3 2 3 - Výstup je v alelách a ST (sekvenčních typech) pangenom

Analýza WGS dat SNP analýza SNP single nucleotid polymorfism = bodová mutace/inzerce/delece A G T C G C G T A T G T C T G A C C C A G T C G C A T G T A T C G C G T A T A T G A C C C A G T C G C G A T G A C C C G T A T G T A T C G C G T G T A T G A A G T C G C G A T G A C G C G T A T T G T A T C G T A T G A G T C G C G T A T G T C T G A C C C A G T C G C G T A T G T CA T G A C C C A G T C G C G T A T G T A T G A C C C A G T C G C G T A T A T G A C C C A G T C G C G Zjištěná T A T G bodová T A T G mutace A C C C T C G C G T A T G T A T G A Referenční sekvence Sekvence jednotlivých readů Výsledná sekvence

cg MLST = core genome multi locus seqence typing Core genome = soubor genů, který by měli mít všichni zástupci druhu Varianta genu = alela Soubor všech analyzovaných genů tvoří sekvenační typ ST Vizualizace Minimum spanning tree Neighbor joining tree Preferovaný způsob analýzy WGS dat Neisseria meningitidis Campylobacter jejuni/campylobacter coli Listeria monocytogenes Salmonella enterica Shiga- toxigenní E. coli (STEC) Neisseria gonorrhoeae Mycobacterium tuberculosis komplex Bordetella pertussis Standartizace nomenklatury http://pubmlst.org/ BIGSdb-Lm cgmlst https://bigsdb.pasteur.fr/liste ria/listeria.html

Vizualizace (nejen) WGS dat MST-minimum spanning tree Fylogenetické stromy

Závěr Molekulárně biologické metody se uplatňují v epidemiologii v řešení epidemií, surveillance i zpětném dohledání zdroje/vehikula Probíhá masivní snaha o standartizaci postupů,názvosloví i výstupů Náklady klesají