METODY STUDIA PROTEINŮ Mgr. Vlasta Němcová vlasta.furstova@tiscali.cz OBSAH PŘEDNÁŠKY 1) Stanovení koncentrace proteinu 2) Stanovení AMK sekvence proteinu Hmotnostní spektrometrie Edmanovo odbourávání 3) Obecné principy specifické detekce molekul 4) Vizualizace proteinů pomocí mikroskopických technik Imunohistochemie Fluorescenční a konfokální mikroskopie Elektronová mikroskopie 5) Stanovení míry exprese proteinu ELISA Průtoková cytometrie SDS-PAGE + Western blot 6) Stanovení fyziologické role proteinu Genový knock-out Genový knock-down pomocí sirna Overexprese proteinu 1
1) STANOVENÍ KONCENTRACE PROTEINŮ založené na spektrofotometrickém stanovení (měření absorbance) metoda podle Bradfordové BCA metoda (Bicinchoninová metoda) stanovení z UV spektra atd. 2
METODA PODLE BRADFORDOVÉ (Bradford assay) princip: kolorimetrická reakce po smíchání Bradfordova činidla s roztokem obsahujícím proteiny Bradfordovo činidlo obsahuje barvivo Coomassie Brilliant Blue - váže se na bazické a aromatické aminokyselinové zbytky v proteinech (Arg, Phe, Try, Pro) změna barvy roztoku z hnědé na modrou detekce při 595 nm Blank Koncentrace proteinu BCA METODA (BCA assay) detekční činidlo obsahuje BCA (bicinchoninic acid) kolorimetrická reakce založena na interakci činidla přímo s peptidovou vazbou (a ne pouze s určitými AMK) purpurové zbarvení detekovatelné při 562 nm Blank Koncentrace proteinu 3
Absorbance (A595 nm) PRINCIP STANOVENÍ KONCENTRACE PROTEINŮ nutno vytvořit kalibrační křivku ze série roztoků o známé koncentraci proteinu nejčastěji je používán bovinní sérový albumin (=BSA) 0.500 0.400 0.300 y = 0.2286x + 0.0008 R² = 0.9996 Změřená hodnota absorbance 0.200 0.100 0.000 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 BSA (ug/ul) Zjištěná koncentrace proteinu STANOVENÍ Z ABSORBANCE V UV OBLASTI proteiny absorbují v UV spektru (260-280 nm) díky přítomnosti aromatických aminokyselin (tyrosin a tryptofan, méně cystein) není nutná kalibrační křivka výpočet dle rovnice [Protein] (mg/ml) = 1.55*A 280-0.76*A 260 všechny metody založené na přítomnosti pouze určitých aminokyselin předpokládají stejné zastoupení těchto AMK ve vzorcích!!! 4
2) STANOVENÍ AMINOKYSELINOVÉ SEKVENCE PROTEINŮ Edmanovo odbourání Hmotnostní spektrometrie EDMANOVO ODBOURÁNÍ označení N-koncové AMK a její odštěpení od zbytku AMK řetězce identifikace AMK pomocí chromatografie anebo elekroforézy limitace délkou peptidového řetězce max. cca 30 AMK (delší proteiny nutno nejdříve naštěpit na kratší fragmenty) 5
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE mass spectrometry detekce molekulové hmotnosti proteinových fragmentů HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE porovnání hmotnostního spektra získaného analýzou vzorku s dostupnými databázemi proteinů nalezení AMK sekvence proteinu (nebo identifikace neznámého proteinu) 6
3) OBECNÉ PRINCIPY SPECIFICKÉ DETEKCE MOLEKUL (nejen proteinů) zajištění specifické detekce možnosti detekce signálu ZAJIŠTĚNÍ SPECIFICKÉ DETEKCE nalezení detekované molekuly ve vzorku na základě známé a specifické interakce jiné molekuly s detekovanou molekulou Touto molekulou umožňující detekci může být: 1. malá organická molekula molekula, která se specificky váže k cílovému proteinu (např. phaloidin k F-aktinu, DAPI a ethidium bromid k DNA) 2. protein, o kterém je známo, že interaguje s detekovaným proteinem ( např. DNáza I s G-aktinem) 3. protilátka specificky rozpoznávající detekovaný protein (IMONODETEKCE) - nejčastěji používaný systém pro detekci proteinů, protože protilátku lze připravit proti jakémukoliv proteinu 7
PŘÍMÁ A NEPŘÍMÁ IMUNODETEKCE Přímá detekce detekovatelný produkt Nepřímá detekce substrát detekovatelný produkt amplifikace signálu substrát enzym enzym sekundární protilátka primární protilátka značená primární protilátka neznačená primární protilátka + značená sekundární protilátka (sekundární protilátka interaguje s Fc fragmentem primární protilátky váže se na všechny protilátky vytvořené určitým živočišným druhem) MOŽNOSTI DETEKCE SIGNÁLU s detekovanou molekulou interagující molekula obvykle není schopna produkovat detekovatelný signál detekující molekula konjugována s jinou molekulou umožňující vizualizaci Touto molekulou umožňující detekci může být: 1. těžký kov 2. fluorofor 3. enzym, jehož enzymová aktivita umožňuje vizualizaci detekované molekuly 8
MOŽNOSTI DETEKCE SIGNÁLU s molekulou použitou pro detekci cílového proteinu může být konjugován: 1) těžký kov - nejčastěji koloidní zlato ( imunogold labeling ) Somatostatin v D buňkách pankreatu MOŽNOSTI DETEKCE SIGNÁLU s molekulou použitou pro detekci cílového proteinu může být konjugován: 2) fluorofor = molekula schopná absorbovat záření určité vlnové délky a vyzářit (emitovat) záření jiné vlnové délky (=detekovaný signál) - při použití různých fluoroforů možnost sledování kolokalizace molekul (výskyt na stejné buňce nebo stejném místě v buňce) Pr: detekce cirkulujících nádorových buněk odvozených od epiteliálních nádorů (DNA barvená DAPI, anti-cd45 -FITC, anti-cytokeratin -TRITC) 9
MOŽNOSTI DETEKCE SIGNÁLU s molekulou použitou pro detekci cílového proteinu může být konjugován: 3) enzym vizualizace detekované molekuly po reakci se substrátem chemiluminiscence jako enzym se obvykle používá křenová peroxidáza (= horse radish peroxidase = HRP) štěpí luminol za vzniku světla, které je detekováno chromogenní (barevná reakce) vzniká barevný produkt - míra zbarvení může být měřena kvantifikace detekované molekuly - např. enzym alkalická fosfatáza (= AP) produkt reakce musí být nerozpustný, pokud chceme vidět lokalizaci detekované molekuly produkt reakce musí být rozpustný, pokud chceme měřit intenzitu vzniklého zabarvení v roztoku 3) VIZUALIZACE PROTEINŮ POMOCÍ MIKROSKOPICKÝCH TECHNIK imunohistochemie fluorescenční a konfokální mikroskopie elektronová mikroskopie 10
IMUNOHISTOCHEMIE detekce v mikroskopickém preparátu (obvykle tenký řez tkáně) obvykle pomocí specifických protilátek a barevné reakce za vzniku nerozpustného produktu FLUORESCENČNÍ MIKROSKOPIE excitační filtr umožňuje výběr vlnové délky pro excitaci fluoroforu, světlo jiné vlnové délky je emitováno fluoroforem a je propuštěno bariérovým filtrem do okuláru lze detekovat signál vždy jen od jednoho fluoroforu, při vícenásobném značení se musí obraz do vícenásobného skládat počítačově) 11
FLUORESCENČNÍ vs. KONFOKÁLNÍ MIKROSKOPIE fluorescenční mikroskop do okuláru se dostává signál z celé vrstvy tkáně (nebo z celé výšky buňky), nelze spolehlivě detekovat vzájemnou pozici molekul, protože signál z různých vrstev vzorku se překrývá FLUORESCENČNÍ vs. KONFOKÁLNÍ MIKROSKOPIE konfokální mikroskop do okuláru se díky konstrukci mikroskopu dostává signál pouze z jedné roviny preparátu (tzv. konfokální roviny) možnost detekce vzájemné lokalizace molekul 12
FLUORESCENČNÍ vs. KONFOKÁLNÍ MIKROSKOPIE modrá DNA barvená DAPI zelená volný aktin (G-aktin) barvený pomocí konjugátu DNázy I s fluoroforem AlexaFluor 488 červená polymerizovaný aktin (F- aktin) barvený konjugátem phaloidinu s fluoroforem TRITC volba typu mikroskopie závisí na tom, co chceme pozorovat a jakou informaci chceme získat GFP = green fluorescent protein protein s přirozenou schopností fluorescence, izolovaný původně z medúzy Aequorea victoria (zelená fluorescence po osvícení modrým světlem) používán jako reporterový protein pro studium lokalizace proteinů a jejich dynamiky i v živých buňkách (sekvence DNA kódující tento protein vložena za gen kódující zkoumaný protein tak, aby došlo k expresi zkoumaného proteinu s připojeným GFP) v takto upravených buňkách/tkáních lze po excitaci příslušnými vlnovými délkami detekovat signál GFP, který ukazuje lokalizaci zkoumaného proteinu podařilo se vyrobit organismy, které mají expresi GFP ve všech molekulách těla 13
ELEKTRONOVÁ MIKROSKOPIE Protilátka obvykle značená koloidním zlatem Somatostatin v D buňkách pankreatu 4) STANOVENÍ MÍRY EXPRESE PROTEINŮ ELISA SDS-PAGE + Western blot Průtoková cytometrie (bude vysvětleno v přednáškách Ústavu imunologie) metody založené nejčastěji na použití specifických protilátek 14
ELISA = enzyme-linked immunosorbent assay = EIA (= enzyme immunoassay) používaná zejména v imunologii první rutinně používaná metoda pro detekci HIV infekce umožňuje detekci i kvantifikaci antigenu nebo protilátky ve vzorku tělesná tekutina (plazma, sérum, moč, ) detekce založená na interakci antigen-protilátka provedené in-vitro, obvykle v 96-jamkové destičce předchůdce metoda RIA (=radioimmunoassay) nutné použití radioaktivně značených antigenů nebo protilátek ELISA použití: detekce hladin protilátek (alergie, vakcinace, ) detekce virových infekcí (hepatitis B, hepatitis C, HIV-1, HIV-2, pohlavně přenosné choroby) detekce hladin hormonů (HCG v těhotenství, LH, TSH, T3, T4) detekce prozánětlivých markerů v krvi (cytokiny) 15
ELISA jak vznikl název metody (enzyme-linked immunosorbent assay) imobilizace antigenu/protilátky na plastik 96-jamkové destičky ( sorbent - vazba na plastik zjednodušuje veškeré promývání) vazba detekované molekuly ze vzorku na imobilizovaný antigen/protilátku vazba specifické protilátky konjugované s enzymem umožňujícím detekci na tuto molekulu (.imuno - protilátka umožnuje specifickou detekci) detekce signálu po přidání substrátu enzymatické reakce (enzyme-linked - signál vzniká a je zesílen pomocí enzymem katalyzované reakce) ELISA - TYPY přímá (detekované agens je imobilizováno přímo na plast destičky, primární protilátka je značena enzymem umožňujícím detekci) nepřímá (detekované agens je imobilizováno přímo na plast destičky, sekundární protilátka je značena enzymem umožňujícím detekci) sendvičová (detekované agens se váže na specifickou protilátku imobilizovanou v destičce, poté je detekováno kombinací neznačené primární a značené sekundární protilátky) kompetitivní (detekované agens je smícháno s totožným agens, které je značeno enzymem umožňujícím detekci dochází ke kompetici agens značeného a neznačeného (ze vzorku) o vazbu na protilátku imobilizovanou na destičce, signál po přidání substrátu vytváří jen agens značené čím více detekovaného agens ve vzorku, tím větší kompetice se značeným agens, tím méně značeného agens se váže na destičku, tím méně signálu) 16
ELISA - TYPY Substrate Substrate Primary antibody conjugate Substrate Primary antibody Secondary antibody conjugate Capture antibody přímá nepřímá sendvičová ELISA TYPY kompetitivní ELISA 17
KVANTIFIKACE DETEKOVANÉ MOLEKULY detekce intenzity zabarvení jamek pomocí spektrofotometru (ELISA reader) detekce absorbance při příslušné vlnové délce intenzita barvy odpovídá přímo úměrně množství detekovaného antigenu nebo protilátky (pouze u kompetitivní ELISy se jedná o nepřímou úměrnost) nutná kalibrace testu použití ředicí řady standardů (antigen nebo protilátka totožné s detekovanými) z hodnot známých koncentrací standardů a jim příslušejících absorbancí se sestaví závislost (graf), ze které se vypočítá koncentrace detekovaného antigenu/protilátky SDS-PAGE separace proteinů podle molekulové hmotnosti = sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis proteiny nutno před separací denaturovat za pomoci denaturačních činidel (SDS, merkaptoethanol nebo dithiotreitol, a tepla) separaci postupují jednotlivé polypeptidové řetězce proteinů (zachovaná pouze primární struktura) 18
SDS-PAGE SDS dává proteinům homogenní záporný náboj (stejný na jednotku délky proteinu) separace proteinů víceméně pouze podle molekulové hmotnosti proteiny jsou záporně nabité pohyb v elektrickém poli ke kladné elektrodě (ANODA) SDS-PAGE _ záporně nabité proteiny taženy ke kladné elektrodě čím delší polypeptidový řetězec, tím více inhibován při průchodu gelem kratší proteiny doputují dále než delší + 19
SDS-PAGE molekulová hmotnost detekovaného proteinu jde zjistit porovnáním jeho velikosti s markerem molekulových hmostností = komerčně dostupná směs proteinů o známých velikostech jednotka molekulové hmotnosti používaná pro proteiny je Dalton (1 000 Da = 1 kda) 1 Da odpovídá hmotnosti atomu vodíku WESTERN BLOT použití nejčastěji pro porovnání míry exprese proteinů přenos proteinů separovaných pomocí SDS-PAGE na povrch vázající proteiny (nitrocelulózová nebo PVDF membrána) pohyb záporně nabitých proteinů v elektrickém poli z gelu na membránu proteiny přeneseny na membránu ve stejné vzájemné pozici vzniká otisk (blot) gelu na mebráně detekce proteinu na membráně pomocí specifických protilátek (membrána umožňuje jednoduchou manipulaci ) 20
Control 1 mm SA 1 mm SA + 0.2 mm OA 0.2 mm OA Control 1 mm SA 1 mm SA + 0.2 mm OA 0.2 mm OA Control 1 mm SA 1 mm SA + 0.2 mm OA 0.2 mm OA WESTERN BLOT detekce konkrétních proteinů obvykle pomocí specifických protilátek a chemiluminiscence nebo barevné reakce za vzniku nerozpustného produktu WESTERN BLOT příklady detekce BiP Aktin P-c-Jun Aktin PARP Aktin pro porovnání exprese mezi jednotlivými vzorky je nutné analyzovat stejné množství proteinu ve všech vzorcích průkaz stejné nanášky detekcí některého housekeeping proteinu (aktin, tubulin, GAPDH, ) 21
2D-ELEKTROFORÉZA kombinace 2 typů separace 1) isoelektrická fokusace 2) SDS-PAGE 5) STANOVENÍ FYZIOLOGICKÉ ROLE PROTEINU Genový knock-out Genový knock-down pomocí sirna Overexprese proteinu 22
GENOVÝ KNOCK-OUT obě alely určitého genu odstraněny nebo nefunkční studium loss-of-function mutací - sledování změn fenotypu, jaké orgány postiženy, ztráta některých genů je letální už v embryonálním vývoji vs. transgenní organismus - vnesen gen Knock-out kaspázy 9 u myši defekt vývoje mozku GENOVÝ KNOCK-DOWN A sirna TECHNOLOGIE sirna = small interfering RNA snížení exprese proteinu využitím buněčných mechanismů obrany proti dsrna (mechanismy protivirové obrany) transfekce buněk dsrna o délce cca 20 nt (sekvence vychází ze sekvence genu, jehož exprese je inhibována) sledován efekt výrazného snížení exprese příslušného proteinu 23
OVEREXPRESE PROTEINU sledování efektu nadbytku určitého proteinu (nebo jeho konstitutivně aktivní či inaktivní formy) za účelem purifikace proteinu pro jinou metodu, např. pro zjištění enzymové kinetiky, 3D struktury nutno transfekovat buňky expresním vektorem obsahujícím sekvenci kódující příslušný protein k pomnožení expresních vektorů lze využít bakteriální buňky (transformace expresním vektorem) STUDIJNÍ LITERATURA & UŽITEČNÉ ODKAZY Základní literatura: Alberts B. et al: Molecular Biology of the Cell, 5. vydání, str. 517-522, 566-568, 585-593, 604-607 Další materiály k fluorescenci a průtokové cytometrii pro zájemce: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support/tutorials.html 24