STANVENÍ AMINKYSELINVÉH SLŽENÍ BÍLKVIN Důvody pro stanovení AK složení určení nutriční hodnoty potraviny, suroviny (esenciální vs. neesenciální AK) charakterizace určité bílkovinné frakce nebo konkrétní bílkoviny (první krok před určováním struktury bílkoviny) Postup stanovení aminokyselinového složení 1. izolace bílkovin (přítomnost sacharidů, lipidů komplikuje další kroky) 2. hydrolýza vzorku 3. vlastní stanovení aminokyselin v hydrolyzátu Hydrolýza bílkovin má zajistit rozštěpení bílkovinných makromolekul na stavební jednotky aminokyseliny Možnosti provedení: kyselá hydrolýza alkalická hydrolýza enzymová hydrolýza Kyselá hydrolýza bílkovin nejčastěji hydrolýza 6M HCl při 110 C 16-72 hod (rychlá hydrolýza: mikrovlnný ohřev 145-155 C, 4 hod) nevýhody kyselé hydrolýzy: destrukce Trp (zčásti Ser, Thr) hydrolýza amidových vazeb Gln a Asn Glu resp. Asp částečná oxidace Cys 11
při předběžné oxidaci vzorku permravenčí kyselinou dochází ke konverzi sirných aminokyselin: Cys cysteová kyselina ( SH S 3 H) Met methioninsulfon Alkalická hydrolýza bílkovin 4,2M NaH nebo 2M Ba(H) 2 nebo 4M LiH, 110 C, 22 hod (nebo mikrovlnný ohřev 50-60 min) zpravidla se používá jen pro stanovení Trp (chybu minimalizuje použití 5-methyl-tryptofanu jako interního standardu) dochází k destrukci Arg a cystinu 12
STANVENÍ A DŮKAZY AMINKYSELIN Stanovení AK volných vázaných v bílkovinách a peptidech Důvody pro analýzu aminokyselin nutriční hodnota, AK složení bílkoviny kontrola receptury výrobku Phe vs. potraviny pro fenylketonuriky potraviny fortifikované esenciálními AK Glu jako ochucující přísada určování druhu suroviny Planární chromatografie aminokyselin zejména TLC, HPTLC (PC se používá málo) slouží ke kvalitativní, příp. semikvantitativní analýze porovnání polohy skvrn vzorku na chromatogramu se skvrnami standardních látek, F hodnoty denzitometrické měření skvrn spektrofotometrické měření po eluci látky ze skvrny Příklady podmínek pro TLC aminokyselin: silikagel, mobilní fáze: butanol kyselina octová voda (4:1:1) nebo dvourozměrná chromatografie na silikagelu (1.směr: Cl 3 MeH 17% NH 3 2:2:1 objemově, 2.směr: fenol voda 3:1 hmotnostně) 13
Detekce aminokyselin v planární chomatografii eakce s ninhydrinem (postříkání chromatogramu acetonovým roztokem, odpaření, záhřev): většina AK poskytuje červenofialové až modrofialové produkty H + 2 + H N H C ++ 2 + 3 H 2 prolin a hydroxyprolin poskytují žlutý produkt N H Detekce ninhydrinem je neselektivní, reagují i bílkoviny, peptidy, aminy, amoniak Jiná možnost detekce: ninhydrin + Cu(N 3 ) 2 různě barevné skvrny jednotlivých AK Další detekční (resp. derivatizační) činidla: kyselina trinitrobenzensulfonová ( žluté produkty) 2,4-dinitrofluorbenzen ( žlutě zbarvené deriváty, dělení TLC) 4-toluensulfonová kyselina ( tosylderiváty) dansylchlorid ( fluoreskující dansylderiváty) 14
Stanovení celkového množství aminokyselin Formolová titrace aminokyselin po reakci AK s formaldehydem (aduje se na aminoskupinu) se uplatní kyselý charakter karboxylu a kyseliny lze titrovat odměrným roztokem hydroxidu na fenolftalein + + H 2 2 N= 2 Spektrofotometrická stanovení ninhydrinem absorbance produktů se měří při 570 nm (u prolinu a hydroxyprolinu při 430 nm) kys. trinitrobenzensulfonovou: v alkalickém prostředí vznikají žluté produkty, měří absorbance při 340 nm N 2 N 2 + 2 N S 3 H S 2 NH N 2 -H 2 2 N N 2 prolin a hydroxyprolin nereagují Manometrické stanovení aminokyselin (VAN SLYKE) kys. dusitá konvertuje α-aminokyseliny na α-hydroxykyseliny, uvolňuje se ekvimolární množství dusíku, kyselé produkty rozkladu HN 2 se absorbují v roztoku hydroxidu, množství dusíku se určí z nárůstu tlaku 15
Stanovení aminokyselin vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií Nejčastější typy: iontoměničová chromatografie (IEC): dělení ve formě aminokyselin, pokolonová derivatizace chromatografie na obrácené fázi (P-HPLC): zpravidla dělení derivátů aminokyselin předkolonová derivatizace Možnosti detekce aminokyselin v HPLC Vlastní absorpce AK v UV se analyticky většinou nevyužívá (absorbují jen aromat. AK, detekce je neselektivní a málo citlivá). Tryptofan lze detekovat fluorimetricky. K detekci většiny AK slouží derivatizace, tj. konverze analytu na derivát vhodných spektrálních nebo elektrochemických vlastností. Derivatizace může být pokolonová (separované AK vystupující z kolony reagují s tokem činidla a vznikají deriváty např. reakce s ninhydrinem) předkolonová (deriváty se vytvoří reakcí složek vzorku s činidlem před nástřikem do chromatografu) Příklady detekce AK s použitím derivatizace Detekce Činidlo Pozn. UV/VIS ninhydrin dabsyl chlorid PITC pokolonová deriv., 570 a 440 nm 425 a 436 nm 254-280 nm fluorimetrická PA dansyl chlorid ex. 330 nm, em. 455 nm předkolonová d.,ex. 340 nm, em. 510 nm elektrochemická PA 0,4-0,7 V 16
Chemické reakce probíhající při derivatizaci AK příklady: ( 3 ) 2 N N = N S 2 Cl + dabsylchlorid - HCl ( 3 ) 2 N N = N S 2 NH dabsylderivát Pozn.: dabsylchlorid reaguje i se sek. aminokyselinami (Pro) a aminy PITC (fenylisothiokyanát) fenylthiokarbamoyl (PTC) aminokyselina Pozn.: PITC se používá také při Edmanově odbourání peptidů; v tom případě vznikají fenylthiohydantoiny H H + H 2 N + HS 2 2 H merkaptoethanol PA (ortho-ftalaldehyd) S 2 2 H N Pozn.: PA lze použít i k detekci sek. aminokyselin (Pro) po jejich oxidaci chlornanem 17
(konverze na primární amin) S 2 Cl S 2 NH + H 2 N - HCl N( 3 ) 2 N( 3 ) 2 dansylchlorid dansylderivát 18
Stanovení aminokyselin iontoměničovou chromatografií Klasický přístup (automatické analyzátory aminokyselin): dělení AK na silně kyselém katexu eluce řadou pufrů o rostoucí hodnotě ph (3,3-10,5) v několika krocích pokolonová derivatizace ninhydrinem (reakční cívka 130-135 C) detekce monitorováním absorbance při 570 a 440 nm HPLC směsi aminokyselin pokolonová derivatizace ninhydrinem horní křivka: A570 spodní křivka: A440 nástřik jednotlivých AK: 10 nmol Alternativy: gradientová eluce použití jiných činidel pro pokolonovou derivatizaci (PA, fluorimetrická detekce velmi vysoká citlivost) Chromatogram hydrolyzátu sójové mouky připraveného po předchozí oxidaci sirných AK; derivatizace ninhydrinem; 1 cysteová kys. 2 Asp, 3 Met sulfon, 4 Thr, 5 Ser, 6 Glu, 18 Lys, 19 His, 20 NH 3, 21 Arg 19
ychlá IEC analýza 16 aminokyselin; pokolonová derivatizace o-ftalaldehydem a merkaptoethanolem; fluorescenční detekce: excitace 360 nm, emise 418-700 nm; nátřik jednotlivých AK: 2,5 nmol Stanovení aminokyselin chromatografií na obrácené fázi zpravidla předkolonová derivatizace (dabsyl-, dansyl-chlorid, PA) gradientová eluce derivátů AK detekce (UV/VIS, fluorimetrie ) P-HPLC směsi derivátů aminokyselin s PA a ME kolona C 18, 5µm, 250 4,6 mm, předkolona C 18, 40µm, 80 4,6 mm mobilní fáze A: THF+ MeH+ 0,05M NaAc (ph 5,9) 1+19+80 mobilní fáze B: MeH + 0,05M NaAc (ph 5,9) 80+20 průtok 1,7 ml/min fluorescenční detekce nástřik 5 pmol (aminokyseliny), NH 3 (20 pmol) 20
Stanovení aminokyselin plynovou chromatografií pro dosažení potřebné těkavosti je nutná derivatizace bvyklý způsob dvoustupňová derivatizace: 1) esterifikace aminokyseliny alkoholem (MeH, PrH, iprh, BuH, ibuh, iamh) v prostředí 3M HCl: + 1 H - H 2 C 1 2) acylace aminoskupiny esteru anhydridem kyseliny (octové, trifluoroctové, pentafluorpropionové, heptafluorbutanové): 2 C + C 1 C 1 + 2 2 C NH C 2 Příklad: GC analýza N-heptafluorbutyryl isobutyl derivátů aminokyselin kapilární kolona WCT 50 m 0,22 mm stacionární fáze SE 30 teplota kolony 100-250 C detekce FID 21
Alternativní postupy derivatizace aminokyselin a) silylace bis(trimethylsilyl) trifluoracetamidem (BSTFA) CF 3 C N(Si( 3 ) 3 ) 2 - CF 3 C CSi( 3 ) 3 NHSi( 3 ) 3 b) reakce s alkyl-chloroformiátem + 2 Cl C 1-2 HCl C C 1 NH C 1 - C 2 C 1 NH C 1 N-alkoxykarbonyl derivát esteru aminokyseliny ( 1 = Me, Et) 22