HLA-B27 možnosti stanovení pomocí průtokové cytometrie. Absolventská práce

HLA-B27 možnosti stanovení pomocí průtokové cytometrie Absolventská práce Jan Vlasatý Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola Praha 1, Alšovo nábřeží 6 Studijní obor: Diplomovaný zdravotní laborant Vedoucí práce: Mgr. Alena Mikšíková Datum odevzdání práce: 23. 4. 2018 Datum obhajoby: červen 2018 Praha 2018

Prohlašuji, že jsem absolventskou práci vypracoval samostatně a všechny použité prameny jsem uvedl podle platného autorského zákona v seznamu použité literatury a zdrojů informací. Praha 17. dubna 2018 Podpis

Poděkování patří Mgr. Aleně Mikšíkové za odborné vedení absolventské práce. Další dík patří Ing. Zdenku Marešovi za cenné rady, podporu a zapůjčení počítačového zařízení a softwaru potřebného pro napsání této absolventské práce. Poděkovat bych chtěl také vedení laboratoře Česká Laboratorní s.r.o. za možnost měření dat v laboratoři a pracovníkům České Laboratorní s.r.o. za pomoc a trpělivost při zpracování této absolventské práce.

Souhlasím s tím, aby moje absolventská práce byla půjčována v knihovně Vyšší odborné školy zdravotnické a Střední zdravotnické školy, Praha 1, Alšovo nábřeží 6. Podpis

ABSTRAKT VLASATÝ, Jan. HLA-B27 možnosti stanovení pomocí průtokové cytometrie. Praha, 2018. Absolventská práce. VOŠZ a SZŠ Praha 1. Vedoucí absolventské práce Mgr. Alena Mikšíková. Cílem práce je porovnání dvou diagnostických souprav (IOset and DURACLONE) pro stanovení antigenu HLA-B27 průtokovou cytometrií. Porovnává se cena, doba přípravy vzorku, měření a citlivost záchytu pozitivity. Dalším cílem je zpracovat a předložit výsledky výskytu antigenu HLA-B27 u vyšetřovaných osob v roce 2017 v laboratoři Česká Laboratorní s.r.o. v Praze a jeho vztahu k diagnóze, pohlaví a věku pacientů. Vzorky pacientů vyšetřovaných na výskyt antigenu HLA-B27 v imunologické laboratoři Česká Laboratorní s.r.o. v Praze se vyšetřují metodou průtokové cytometrie reakcí antigenu s monoklonální protilátkou. IOtest je lepší volbou pro středně velké až velké laboratoře, protože je méně časově náročný (25 minut jedno vyšetření oproti 45 minut u DURACLONE), snadněji se měří na průtokovém cytometru a má vyšší frekvenci záchytu pozitivních pacientů (zachytil 7 z 8 pozitivních vzorků). V roce 2017 bylo vyšetřeno 344 pacientů. Osob s antigenem HLA-B27 bylo 40, bez antigenu 304. Z celkového počtu vyšetřených pacientů bylo vyšetřeno 142 mužů a 202 žen. Pozitivních žen bylo nalezeno 26 a pozitivních mužů 14. Nejvíce pozitivních pacientů bylo ve věku od 30 do 39 (7 žen a 5 mužů) let a také od 40 do 49 let (5 žen a 2 muži). Nejčastější diagnózou u pozitivních pacientů byla skupina diagnóz nemocí svalové a kosterní soustavy a u žen dále také skupina diagnóz nemoci krve a imunity. Asociace mezi antigenem HLA-B27 a chorobami je již dávno prokázaná, ovšem není odhalen přesný mechanismus, který spojení mezi HLA systémem a nemocemi podmiňuje. Nejznámější je asociace molekuly HLA-B27 s řadou nespecificky zánětlivých onemocnění např. ankylózující spondylitidou. Klíčová slova: průtoková cytometrie, HLA-B27 antigen, vyšetření HLA antigenů, T lymfocyty, Bechtěrevova nemoc, možnosti stanovení, ankylozující spondylitida

ABSTRACT VLASATÝ, Jan. The HLA-B27 Test Determination Posibilities by Flow Cytometry. Praha, 2018. Graduate work. VOŠZ a SZŠ Praha 1. Tutor Mgr. Alena Mikšíková. The background of this thesis is comparing of two diagnostic kits (IOtest and DURACLONE) used for setting of HLA-B27 antigen by flow cytometry. We compared the price, time of setting of the samples, main measuring and sensitivity to positive samples. The next background is to process and propose results of the incidence at check up patients in 2017 in the laboratory of imunology Česká Laboratorní s.r.o. in Prague and its connexion with diagnosis, sex and age of the patients. Patient samples examined for the presence of antigen HLA-B27 in the laboratory of imunology Česká Laboratorní s.r.o. in Prague are processed using the flow cytometry by reaction of antigens and monoclonal antibodies. IOtest is better choice for medium-sized or grand laboratories because IOtest is less time demanding (25 minutes for one sample against 45 minutes for one sample by DURACLONE), easier for the measuring by flow cytometry and IOtest has higher frequency of positivity assignment (assigned 7 of 8 positive samples). In 2017 were examined 344 patients. 40 persons had the HLA-B27 antigen, 304 persons did not. From the total number of examined patients were examined 142 men and 202 women. Positive were found 26 women and 14 men. The highest incidence of HLA-B27 was observed in the group of 30 to 39 years old (7 women and 5 men) and 40 to 49 years old (5 women and 2 men). The examined persons had mainly a group diagnosis of the musculoskeletal system diseases and next at women group diagnosis of diseases of the blood and immunity. The association between HLA-B27 antigen and the diseases has been proven long ago, but the exact mechanism which makes the link between the HLA system and diseases has not been revealed yet. The best known association is the association of the molecule HLA-B27 with many non-specific inflammatory diseases e.g. ankylosing spondylitis. Keywords: flow cytometry, HLA-B27 antigen, HLA antigens investigation, T lymfocytes, Bechterev disease, determination posibilities, ankylosing spondylitis

Obsah Úvod... 9 Cíl práce... 10 1 Teoretická část... 11 1.1 Hlavní histokompatibilní komplex... 11 1.2 Historie... 12 1.3 Molekuly HLA I. třídy... 12 1.3.1 Klasifikace a umístění HLA I. třídy... 13 1.3.2 Struktura HLA I. třídy... 13 1.3.3 Funkce HLA I. třídy... 14 1.4 Molekuly HLA II. třídy... 14 1.4.1 Klasifikace a umístění HLA II. třídy... 14 1.4.2 Struktura HLA II. třídy... 14 1.4.3 Funkce HLA II. třídy... 15 1.5 Molekuly HLA III. Třídy... 16 1.6 Genetická organizace a dědičnost HLA systému... 16 1.7 Polymorfismus HLA systému... 17 1.8 Typizace HLA systému... 17 1.8.1 Sérologické metody... 18 1.8.2 Průtoková cytometrie... 18 1.8.3 Molekulárně-genetické metody... 19 1.9 Nomenklatura HLA systému... 20 1.10 Vztah HLA systému k chorobám... 21 1.11 Antigen HLA-B27 a jeho vztah k chorobám... 22 2 Praktická část... 24 2.1 Použité metody a materiál... 24 7

2.1.1 Typizace antigenu HLA-B27 pomocí průtokové cytometrie... 24 2.2 Zpracování získaných dat... 29 3 Výsledky... 32 3.1 Porovnání IO testu a DURACLONE B27... 32 3.1.1 Časová náročnost a příprava vzorku... 34 3.1.2 Měření... 34 3.2 Výskyt antigenu HLA-B27 u vyšetřovaných osob za rok 2017... 35 3.3 Výskyt antigenu HLA-B27 u žen a mužů... 36 3.4 Výskyt antigenu HLA-B27 v závislosti na věku... 37 3.5 Výskyt antigenu HLA-B27 ve vztahu k diagnóze pacienta... 38 Diskuse a závěr... 40 Seznam obrázků... 42 Seznam tabulek... 43 Seznam grafů... 44 Seznam použitých zkratek... 45 Použitá literatura... 47 8

ÚVOD Imunitní systém je důležitý pro udržení homeostázy organismu. Odlišování škodlivého od neškodlivého, vlastního od cizího patří mezi jeho základní funkce. Imunopatologické stavy souvisejí s molekulami Major Histocompatibility Complex (MHC). U lidí mají označení Human Leukocyte Antigen (HLA). HLA komplex je skupina genů, která je spojována s více chorobami než jakákoliv jiná oblast lidského genomu zejména v souvislosti s infekcemi a autoimunitou. HLA systém je jeden z nejmladších genetických systémů. Je znám teprve necelé půlstoletí. Za tuto dobu však problematika HLA prodělala dramatický vývoj. Molekuly HLA se dělí na molekuly I. třídy, II. třídy a molekuly III. třídy. HLA molekuly tvoří vazebná místa pro antigenní fragmenty, které předkládají T-lymfocytům. K autoimunitním onemocněním dochází při poruše imunitního systému. Autoimunitní onemocnění je proces, při kterém jsou poškozovány vlastní struktury (tkáně) organismu. Důležitou roli při rozvoji těchto onemocnění mají genetické faktory, ale také vlivy vnějšího prostředí. V posledních letech dochází k velkému rozvoji výzkumu v závislosti HLA a autoimunitních onemocnění, přesto však doposud není u žádné z těchto chorob zcela objasněn mechanismus jejich vzniku. Autoimunitní onemocnění postihuje více jak 5 % populace a vytváří tak značný sociální problém. Některá autoimunitní onemocnění asociované s HLA komplexem jsou spojena pouze s jednou alelou, jiná onemocnění jsou spojena s polymorfismem alel více genů. Silná asociace je mezi genem HLA-B27 a ankylozující spondylitidou. Pro vyšetření jednotlivých HLA antigenů se používají tři hlavní metody sérologická metoda, průtoková cytometrie a molekulárně-genetická metoda. Nejvýznamnější sérologickou metodou je lymfocytotoxický test. Molekulárně-genetické metody jsou založené na principu polymerázové řetězové reakce (PCR). Průtokovou cytometrií se nejčastěji vyšetřují antigeny HLA-DR a HLA-B27. 9

CÍL PRÁCE Cílem této absolventské práce je srovnání dvou diagnostických souprav pro stanovení HLA- B27 v rutinní laboratoři. První soupravou je DURACLONE B27 Reagent Kit s protilátkami HLA-B27-PE, CD3 monoklonální protilátkou a HLA-B7. Druhou je IO TEST pro stanovení HLA-B27 antigenu s protilátkami HLA-B27-FITC a HLA-B7-PE. Srovnávacími kritérii jsou cena, doba přípravy vzorku, měření a citlivost záchytu pozitivity. Dle naší hypotézy by měl být IOtest lepší volbou pro rutinní laboratoř z důvodů menší časové náročnosti, záchytu pozitivit a snadnějšímu měření. A dalším výstupem práce bude zpracování a předložení výsledků výskytu antigenu HLA-B27 u osob v roce 2017 v laboratoři Česká Laboratorní s.r.o. v Praze a jeho vztahu k diagnóze, pohlaví a věku pacientů. 10

1 TEORETICKÁ ČÁST 1.1 Hlavní histokompatibilní komplex Jedním z určujících faktorů evolučního vývoje je variabilita. Ta umožňuje jednotlivci v rámci druhu určitá zvýhodnění přežití ve zhoršených podmínkách. Tyto získané výhody je jedinec schopen předat na své potomstvo. Mezi jasné variability patří genový polymorfismus. Organismus si však musí zachovat schopnost rozeznat cizí a vlastní. Tato vlastnost určuje integritu organismu a slouží k určování potenciálně nebezpečných tkání a buněk. Zároveň brání přijetí cizích buněk a tkání, což je komplikace v transplantační medicíně. Systém určující vlastní struktury nazýváme histokompatibilní. Histokompatibilních systémů je mnoho, za klíčový je však považován Hlavní histokompatibilní systém (Major Histokompatibility Complex, MHC). MHC se vyskytuje u všech vyšších živočišných druhů. U různých druhů je pojmenován různě, u myší H2 systém, u slepic molekuly B, u potkanů molekuly Rt1, u prasat SLA systém, u šimpanzů CHLA a u lidí je označován jako Human Leukocyte Antigen (HLA). (1) (2) Lidský MHC systém je velice polymorfní. Každý člověk má na povrchu svých buněk jedinečnou sestavu molekul HLA I. a II. třídy. Výjimkou jsou však jednobuněčná dvojčata, která mají totožný HLA systém. Molekuly jsou kódované dvojicemi alel umístěné na 6. chromozomu a jsou kodominantní, vyjadřují se současně. (3) Každý jedinec má na svých buňkách HLA antigeny I., II. a III. třídy, každý z nás má jedinečnou soustavu těchto znaků. Třídu I. a II. lze rozdělit podle jejich struktur, rozložení v tkáních a funkce. (4) Hlavní funkcí molekul tkáňové slučitelnosti neboli molekul HLA je předkládání cizorodých antigenních fragmentů. T-lymfocyty rozpoznají pouze antigeny navázané na žlábky HLA molekul, které představují největší strukturní odlišnost mezi HLA molekulami. Cytotoxické T- lymfocyty (se znaky CD8 + ) rozpoznávají antigeny z endogenních cizorodých částic ve spojení s molekulami HLA I. třídy. Pomocné T-lymfocyty (se znaky CD4 + ) rozpoznávají antigeny z exogenních cizorodých částic s molekulami HLA II. třídy. T-lymfocyty se vyvíjejí v thymu. 11

Pokud dojde k defektu T-lymfocytů, dochází k rozvinutí autoimunitního onemocnění, vznik těžkých infekcí nebo nekontrolovatelné rozvinutí nádoru. (5) (6) 1.2 Historie Hlavní histokompatibilní komplex člověka (HLA) je poměrně mladý genetický systém. Známe ho teprve necelé půlstoletí, za tuto dobu však problematika HLA prodělala rychlý a dramatický vývoj. Historie HLA antigenů sahá do 50. let 20. století, kdy francouzský imunolog Jean Dausset jako první objevil antigen HLA dnes označovaný jako HLA A2. V roce 1958 popsal francouzský imunolog Jean Dausset první HLA antigen. Identifikoval ho v séru pacientů, dostávající opakované transfúze. Použil při tom leukoaglutinační techniky. Tento antigen nazval MAC, název pochází z prvních písmen příjmení pacientů, jejichž krev Dausset a jeho kolegové použili při výzkumu. Později byl tento antigen přejmenován na HLA- A2. Za tento objev dostal Dausset v roce 1980 Nobelovu cenu. (7) (8) S historií HLA je také spojeno jméno Pavlov Ivanyi. Narodil se v Košicích a vystudoval Lékařskou fakultu Univerzity Karlovy. Během postdoktorátního pobytu v laboratoři J. Daussetta se v roce 1965 zásadním způsobem podílel na objevu HLA antigenů. Vybudoval první HLA typizační laboratoř ve střední Evropě. (9) V 70. letech byly objeveny již tři základní lokusy HLA sytému, lokusy HLA-A, HLA-B, HLA- C, a prokázalo se, že HLA systém je rozhodujícím prvkem, jenž udává individuální imunologickou reaktivitu. V 80. letech došlo k objevení antigenů lokusů HLA-DR, HLA-DQ a HLA-DP. Byl pochopen genetický základ HLA a jeho biologický význam. (1) 1.3 Molekuly HLA I. třídy Molekuly HLA I. třídy jsou také nazývané jako klasické histokompatibilní molekuly. Důležitá je především jejich klasifikace, umístění, struktura a funkce. 12

1.3.1 Klasifikace a umístění HLA I. třídy Do HLA I. třídy patří dvacet genů. Nejdůležitější antigeny HLA I. třídy jsou antigeny HLA-A, HLA-B a HLA-C, nacházející se nejdále od centromery. Vyznačují se vysokým polymorfismem. Mezi další antigeny HLA I. třídy patří HLA-E, HLA-F a HLA-G. Tyto antigeny jsou méně polymorfní. (3) Umístění HLA I. třídy se nacházejí v nestejném množství v membráně všech jaderných buněk, to znamená, že se nenachází na erytrocytech. Klasické antigeny můžeme nejvíce nalézt na T- lymfocytech a B-lymfocytech, trombocytech a granulocytech, méně pak na buňkách centrálního nervového systému, svalových a endokrinních buňkách. Neklasické antigeny nacházíme na somatických buňkách, HLA-G jsou pouze na trofoblastech. (5) (10) 1.3.2 Struktura HLA I. třídy Molekuly HLA I. třídy se skládají z těžkého neboli transmembránového glykoproteinového řetězce α a nekovalentně se vážící β2-mikroglobulin. Řetězec α se rozděluje na extracelulární hydrofilní oblast, transmembránovou hydrofobní oblast a intracelulární hydrofilní oblast. Extracelulární oblast obsahuje tři podjednotky α1, α2, α3 (obr. 1). Vazebné místo pro peptidy je u HLA I. třídy na obou koncích uzavřeno, proto se na ně váží téměř výhradně peptidy o délce 8-10 aminokyselin, které se do takového místa vejdou. Toto vazebné místo se nachází mezi podjednotkou α1 a α2. (3) (4) Obrázek 1 Struktura molekul HLA I. třídy (1) 13

1.3.3 Funkce HLA I. třídy Molekuly HLA I. třídy prezentují peptidy intracelulárního původu CD8+ (cytotoxickým) T- lymfocytům, tím je mohou upozornit a mobilizovat, pokud dojde k napadení buněk viry nebo při nádorových změnách. Tato schopnost se nazývá HLA restrikce. HLA-G a HLA-E molekuly slouží k ochraně plodu před T a NK buňkami matky. (10) (11) Antigenní fragment, nacházející se ve vazebném místě (žlábcích HLA molekul), je tvořen oligopeptidy, které pochází z vlastní produkce buňky. Antigen je v komplexu s HLA I. třídy rozeznán a následně dochází k obranné imunitní reakci. (6) 1.4 Molekuly HLA II. třídy Molekuly HLA II. třídy jsou společně s molekulami HLA I. třídy nejvýznamnější skupinou HLA tříd. Důležitá je jejich klasifikace, struktura a funkce (srovnání antigenů HLA I. a II. třídy viz tab. 1.). Na rozdíl od HLA I. třídy má HLA II. třídy méně širokou tkáňovou specifitu. (4) 1.4.1 Klasifikace a umístění HLA II. třídy Geny HLA II. třídy se u lidí nacházejí ve formě tří lokusů: HLA-DR, HLA-DQ a HLA-DP. Za fyziologických okolností se jejich antigeny vyskytují jen na buňkách prezentující antigen: APC (antigen presenting cell), dendritické buňky, monocyty, makrofágy a B-lymfocyty. (12) (13) 1.4.2 Struktura HLA II. třídy Molekuly HLA II. třídy jsou složeny ze dvou nekovalentně vázaných glykoproteinových řetězců těžkého α a lehkého β. Řetězce obsahují extracelulární hydrofilní oblast, transmembránovou hydrofobní oblast a intracelulární hydrofilní oblast. Transmembránové a intracelulární oblasti jsou ukotveny v membráně. Extracelulární oblast řetězce α má domény α1 a α2, oblast řetězce β má domény β1 a β2. Vazebné místo pro antigenní fragment je ve žlábku mezi α1 a β1 podjednotkou (obr. 2). Toto vazebné místo je na obou koncích otevřené, tudíž se 14

na něj mohou vázat i delší peptidy (obvykle 15-35 aminokyselin), které na jednom či obou koncích přečnívají. (1) (4) Obrázek 2 Struktura molekul HLA II. třídy (1) 1.4.3 Funkce HLA II. třídy Molekuly HLA II. třídy předkládají peptidy CD4+ (pomocným) T-lymfocytům. Prezentují peptidy, které se dostaly do endocytických váčků buňky pomocí fagocytózy nebo pinocytózy. Jsou to tedy proteiny extracelulárního původu. V buňce jsou tyto proteiny degradovány pomocí kyselého ph a proteolytických enzymů v endozómech. Sem jsou také transportovány molekuly HLA II. třídy, zde se na ně naváže peptid a společně jsou pak přemístěny na buněčný povrch. (3) (4) 15

Tabulka 1 Srovnání antigenu HLA I. a II. třídy (25) Antigeny HLA I. třídy Antigeny HLA II. třídy Název HLA-A, -B, -C HLA-DQ, -DR, -DP Struktura Výskyt Funkce Délka peptidu, který vážou Heterodimery Těžký řetězec 44kDa Β2mikroglobulin -12kDa Heterodimery α řetězec 32 kda β řetězec 28 kda Prakticky všechny buňky B-lymfocyty, makrofágy, aktivované T-lymfocyty Předkládání zpracovaných Předkládání zpracovaných endogenních antigenů T-lymfocytů, exogenních antigenů T- CD8+ lymfocytům CD4+ 8 10 AMK 10 25 AMK 1.5 Molekuly HLA III. Třídy Geny HLA III. třídy nejsou HLA geny, ale zahrnují geny pro polymorfní sérové a membránové receptory úzce spjaté s imunologickými funkcemi, jako properdinový faktor Bf a proteiny komplementu C2 a C4. Množství dalších genových lokusů v HLA jsou geneticky vázané s HLA geny, ale funkčně s nimi nesouvisí. Zahrnují geny pro TNF (tumor necrotis factor), stejně jako geny, které jsou-li defektní, podmiňují určitá onemocnění. Molekuly této třídy funkčně nesouvisí s aktivitou HLA systému, jsou rozpustné a nepůsobí jako transplantační antigeny. (1) (3) (14) 1.6 Genetická organizace a dědičnost HLA systému Hlavní histokompatibilní komplex se u člověka nachází na krátkém raménku 6. chromozomu (obr. 3). Systém se vyznačuje vysokou koncentrací genů na relativně krátkém úseku deoxyribonukleové kyseliny (DNA). (1) Jednotlivec od každého z rodičů zdědí jeden chromozom, na jehož lokusech se nachází kombinace alel, která představuje jednotku dědící se jako haplotyp. Každý jedinec tudíž nese 16

dva haplotypy, jeden od otce, druhý od matky. Soubor haplotypů vytváří genotyp. HLA alely se exprimují kodominantně. (3) (4) Dědičnost HLA systému se řídí Mendelovými zákony, podle kterých je 25% pravděpodobnost, že potomci budou mít identický HLA systém, 50% pravděpodobnost, že potomci se budou shodovat v jednom haplotypu a 25% pravděpodobnost odlišného haplotypu. (3) (4) Obrázek 3 Organizace genetické informace pro molekuly HLA systému (1) 1.7 Polymorfismus HLA systému Polymorfismem rozumíme v mezích populační genetiky skutečnost, že u jedinců téže populace se na daném genovém lokusu mohou nacházet různé variace genů zvané alely. HLA systém je nejpolymorfnější genovou oblastí lidského genomu. Každý člověk tedy nese na povrchu svých buněk unikátní sestavu molekul HLA I. a II. třídy. Výjimku tvoří lokus, který kóduje α řetězec molekul HLA-DR, ten je monomorfní. (1) (3) Polymorfismus má pro jedince i populaci ochranný význam. Pokud by buňka obsahovala jen jeden typ HLA alel, patogeny by se mohly snáze vyhnout imunitní odpovědi hostitele, protože by bylo obtížné získat peptidy vážící se na alelu z proteinu daného patogenu. Díky unikátní sestavě alel HLA zajistí pestré složení HLA molekul a pravděpodobnost, že antigen bude úspěšně prezentován, je velká. (12) 1.8 Typizace HLA systému Pro HLA typizaci se používají různé metodické postupy podle účelu stanovení. Mezi nejstarší patří serologické metody, které jsou založené na cytotoxické reaktivitě zprostředkované komplementovým systémem. V dnešní době hojně používanou metodou je průtoková 17

cytometrie, jejímž principem je navázání značené protilátky na antigen na stěně lymfocytů a následná detekce v průtokovém cytometru. Základní moderní metodou je genetická typizace založená na polymerázové řetězové reakci (PCR). 1.8.1 Sérologické metody Pro analýzu sérologické metody se používají lymfocyty pacienta, které se nechají inkubovat s panelem lidských anti-hla protilátek. Tyto protilátky se získají ze sér aloimunizovaných dárců (matek). HLA protilátky se vyskytují trvale až u 20 % žen po opakovaném těhotenství. HLA protilátky se také tvoří po transfuzi nebo transplantaci. Výsledkem je, že dojde k lýze lymfocytů při shodě protilátky a expresi HLA pacienta. Tato metoda není schopna rozlišit rozdíly na úrovni alel, ale určují expresy molekul HLA na membránách buněk. Sérologické metody se používají pro rozlišení molekul HLA I. a II. třídy. (1), (5) HLA sérologická typizace se provádí lymfocytotoxickým testem (LCT) na Terasakiho destičkách, na kterých jsou naneseny typizační séra s protilátkami proti HLA antigenům I. a II. třídy. Lymfocyty pacienta se smísí a inkubují s typizačním sérem, poté se přidá komplement. Pokud po přidání komplementu dojde k lýze, znamená to, že reakce je pozitivní. Výsledek lze pozorovat ve fluorescenčním mikroskopu po navázání vitálního barviva na DNA rozpadlých buněk. Když je reakce negativní, živé buňky se neobarví. (1) Sérologická typizace je zatížena určitou mírou nepřesnosti. Některé antigeny HLA systému patří do takzvané křížové reagující skupiny (CREGs cross-reactive groups). Antigeny patřící do této skupiny reagují s více séry a to může mít za následek falešnou pozitivitu. Naopak slabá exprese HLA molekul na buňkách pacienta může způsobit falešně negativní výsledek. (3) 1.8.2 Průtoková cytometrie Průtoková cytometrie (flow cytometry, FCM) je jedinečná metoda ve fenotypizaci a charakterizaci buněčných populací nebo částic, která v sobě spojuje principy spektrofotometru, konfokálního mikroskopu a metody analýzy obrazu. Využívá fluorescenčně značených protilátek, které se vážou na struktury na povrchu buňky (HLA antigeny). Po inkubaci se specifickými protilátkami (monoklonální protilátky) jsou buňky unášeny v proudu nosné kapaliny a každá jednotlivá buňka prochází optickou částí, kde je osvětlena 18

laserem. Rozptyl světla a fluorescence, kterou buňka emituje, se zaznamená. Analýza je založená na relativní velikosti buněk, granularitě, a na skutečnosti, zda buňka nese protilátku obarvenou fluorochromem. Světelný signál je detekován dvěma způsoby. Forward Scatter (FCS) je detektor umístěný v ose dopadajícího paprsku. Side Scatter (SSC) je detektor orientovaný úhlu 90 C na dopadající paprsek. Intenzita lineárně rozptýlených paprsků FSC je přímo úměrná velikosti a členitosti buňky, intenzita bočně rozptýlených paprsků je úměrná granularitě buňky (stav cytosolu, granula, buněčné inkluze). Metodika stanovení H A-B27 antigenu průtokovou cytometrií je podrobněji vysvětlena v praktické části této absolventské práce. (15) (16) 1.8.3 Molekulárně-genetické metody Molekulárně-genetické metody patří mezi vysoce spolehlivé a citlivé metody, umožňující detailní typizaci na genetické úrovni. Metoda je prováděna nejčastěji polymerázovou řetězovou reakcí (PCR). Pomocí PCR namnožíme daný úsek DNA, který kóduje HLA. K reakci jsou potřeba specifické primery, DNA polymeráza, pufr a deoxyribonukleotidy. (1) Primery jsou krátké, uměle nasyntetizované úseky DNA se známou specifickou sekvencí komplementární k bázím horního a dolního úseku DNA, který chceme namnožit. Primery tudíž slouží k ohraničení replikovaného úseku. (17) Enzym DNA polymeráza slouží k vytvoření fosfodiesterových vazeb, tedy ke vzniku nového vlákna. Nejvíce užívanou polymerázou je termostabilní Taq polymeráza z kmene bakterie Thermus aquaticus, která má teplotní optimum přibližně 72 C a neztrácí účinnost při teplotách okolo 90 C. (17) Polymerázová řetězová reakce probíhá ve třech krocích. Nejprve je potřeba vlákno DNA denaturovat při teplotě vyšší než 90 C, při níž se od sebe oddělí obě vlákna díky zániku vodíkových můstků. Poté nastává fáze ochlazení na 40-60 C, při níž se naváže primer. Ve třetím kroku se při 72 C vytváří nové vlákno přidáváním deoxyribonukleotidů k primeru a tím dochází k prodlužování vlákna. Tyto kroky se cyklicky opakují. (18) Molekulárně genetické metody se provádějí PCR se sekvenčně specifickými primery (PCR- SSP). Pomocí jednoho páru primerů dojde k namnožení dané části lokusu. Rozlišení alel probíhá reverzní hybridizací se sekvenčně specifickými DNA oligosondami. Přímé sekvenování slouží k určení nukleotidů a identifikaci nových HLA alel. Pro amplifikaci se 19

používají fluorochromem značené dideoxyribonukleotidy (ddntp), které po navázání na daný úsek DNA zastaví jeho další množení. Vznikají různě dlouhé fragmenty zakončené ddntp. Pomocí elektroforézy se fragmenty DNA rozdělí na základě své délky. Další metodou je metoda mikročipu. Po navázání DNA k mikročipu dojde k hybridizaci. Pomocí speciálních analyzátorů je hybridizace vyhodnocena. U HLA typizace průtokovým analyzátorem Luminex se používají se mikročástice značené fluorochromy. Nejprve se DNA amplifikuje, poté dojde k hybridizaci se sondami, které se váží na barevně značené mikročástice. Výsledky jsou zpracovávány v průtokovém analyzátoru pomocí laseru. (3) (5) 1.9 Nomenklatura HLA systému Nomenklaturu neboli názvosloví HLA systému stanovuje Nomenklaturní komise Světové zdravotnické organizace (WHO). Používají se dva typy nomenklatury, sérologická nomenklatura, která je původnější a novější molekulárně-genetická nomenklatura. Sérologická nomenklatura je založená na sérologickém nebo celulárním určování genových HLA produktů. Velkými písmeny jsou označovány lokusy A, B, C, DR, DQ, DP a číslem specifita antigenu. HLA antigeny dělíme podle sérologické nomenklatury do tří skupin. Antigeny základní, např. A9, A10, B40, DR3, antigeny splitové, např. A9, který je rozdělen na A23, 24 nebo A10, který je rozdělen na A25, 26 a 34. Antigeny obecné, např. antigeny DR51. DR52, DR53 na lokusu DR. (3) Molekulárně-genetická nomenklatura určuje alelové nukleové sekvence. Tato nomenklatura nabízí označení HLA specifity minimálně dvěma číslicemi, oproti serologické, která používá značení maximálně dvoumístné. Vzorovým příkladem pro molekuly HLA I. třídy je HLA- A*0101, kde velká písmena označují lokusy, první dvě číslice označují serologickou specifitu a druhé dvě číslice určují specifickou alelu. U molekul HLA II. třídy je názvosloví složitější. Příkladem je DRB4*0401. První písmeno označuje třídu, druhé rodinu, třetí α nebo β řetězec. Následující první dvě číslice označují sérologickou specifitu a poslední dvě konkrétní alelu. (1) (3) (4) 20

1.10 Vztah HLA systému k chorobám V 70. letech 20. století byl odhalen biologický význam HLA komplexu s ohledem na autoimunitní imunopatolgickou reaktivitu člověka. Penetrace nemoci v přítomnosti alely, která podmiňuje rozvoj choroby, není vždy 100%, ve většině případů je naopak nízká. Toto potvrzuje i fakt, že monozygotní dvojčata, která nesou identické alely na všech lokusech, mají shodu v přítomnosti autoimunitních imunopatologických nemocí v rozmezí 15-30%. Genetická podmíněnost nemoci určuje, že pravděpodobnost rozvoje choroby v průběhu života je větší, jeli přítomna alela asociována s chorobou, než pokud tato alela přítomna není. Stejně tak, jako existují lidé, kteří nesou alelu asociovanou s chorobou, a přesto u nich onemocnění nevypukne, tak existují i lidé, kteří asociovanou alelu nenesou, a přesto se u nich vyvine dané onemocnění. (19) Asociace některých chorob s HLA antigeny se vyjadřuje relativním rizikem (RR). Relativní riziko označuje, kolikrát se určité onemocnění vyskytuje častěji u lidí majících příslušný antigen oproti osobám, které tento antigen nemají. (20) Choroby asociované s HLA komplexem jsou polygenně podmíněné a multifaktoriální. Mezi geny, které se zúčastňují vnímavosti jedince k chorobě, patří jednak samotné geny HLA komplexu, jednak geny, které se nacházejí v HLA genetické oblasti, ale k samotnému HLA systému nepatří (komplement, enzymy a jiné), a geny přítomné na jiných chromozomech (geny pro antigenní receptor T-lymfocytů, imunoglobulinů, adhezivní molekuly, cytokiny a jejich receptory). (20) Genetická predispozice se projeví jenom tehdy, když se jedinec dostane do prostředí, ve kterém faktory působí jako spouštěcí mechanismus vedoucí ke klinickým projevům choroby. (20) Mezi nejvýznamnější asociace patří vztah mezi HLA-B27 a ankylozující spondylitidou, HLA- DQ6 a narkolepsií, HLA-DQ2 a celiakií, HLA-DR2,DQ6 a roztroušenou sklerózou, HLA- DQ8/DQ2 a juvenilním diabetem, HLA-Cw6 a psoriázou, HLA-B35 a subakutní tyreoiditidou (viz tab. č.2). (21) 21

Tabulka 2 Asociace HLA systému s chorobami (5) Onemocnění HLA znaky Relativní riziko Ankylozující spondylartritida (Bechtěrevova nemoc) B27 80 150 Uveitida B27 8 26 Reaktivní artritida B27 17 40 Narkolepsie DQA1*0102-DQB1*0602 40 129 Celiakie (DQ2) HLA-DQA1*0501-DQB1*02 DQA1*0201-DQB1*02, (DQ8) 10 50 6 15 HLA-DQA1*0301-DQB1*0302 Revmatoidní artritida DR4 4 11 Psoriáza Cw6 10-25 1.11 Antigen HLA-B27 a jeho vztah k chorobám Vztah mezi antigenem HLA-B27 a mnoha onemocněními dosud není zcela objasněn. Kromě ankylozující spondylitidy (Bechtěrevova choroba, spondyloartritida) byl zvýšený výskyt HLA- B27 zjištěn i u dalších chorob, např. Reiterův syndrom a uveitida. Populační studie potvrdily asociaci mezi antigenem HLA-B27 a ankylozující spondylitidou. Je možné ji pozorovat ve všech rasových a etnických skupinách, mezi kterými však existují rozdíly ve frekvenci výskytu antigenu HLA-B27, a v míře asociace (viz tab. č. 3). 22

Tabulka 3 Zastoupení antigenu HLA-B27 v různých etnických skupinách (22) Populace Frekvence výskytu antigenu HLA-B27 Kavkazská populace 8 10% Černoši Severní Ameriky 2 4% Japonci <1% Číňani 2 9% Hispánci 4% V populaci s vyšší frekvencí výskytu antigenu HLA-B27 je zpravidla i vyšší frekvence ankylozující spondylitidy a výraznější asociace s HLA-B27 než u populací s nižší frekvencí antigenu HLA-B27. Nejvýraznější asociace s ankylozující spondylitidou se pozoruje u bělošské populaci kavkazského původu, slabší u mongoloidů. U černochů vyskytuje zřídka antigen HLA-B27 i ankylozující spondylitida. (19) (22) V současné době je definováno dvanáct alelových variant antigenu HLA-B27. Základní subtypy, které se vyskytují v české populaci, jsou B*2705 a B*2702. Obě alely jsou asociované s ankylozující spondylitidou. Jednotlivé alelové varianty se mezi sebou liší pouze v aminokyselinách a v míře asociace s ankylozující spondylitidou. (19) Ankylozující spondylitida je chronické systémové zánětlivé onemocnění pohybového ústrojí. Tato choroba postihuje především páteř a klouby a může způsobit srůst obratlů. Patří do skupiny autoimunitních spondyloartropatií. Poprvé byla popsána v roce 1893 ruským neurologem Vladimírem Bechtěrevem. V celkové populaci se toto onemocnění vyskytuje přibližně v 0,5% a až 95% nemocných má antigen HLA-B27. (21) Vyšetření antigenu HLA-B27 se provádí pomocí diagnostického testu, zvláště v počátcích onemocnění, a slouží jen pro vyloučení diagnózy. Ti, kteří antigen HLA-B27 mají, jsou ve vysokém riziku. Tento antigen má asi 7% bělochů, ovšem jen u 3% se onemocnění pravdu rozvine. Pokud jsou nemocní HLA-B27 pozitivní, choroba se u nich projeví v mladším věku (15 30 let), než u nemocných se stejnou diagnózou, kteří však nemají HLA-B27 antigen. (21) (22) 23

2 PRAKTICKÁ ČÁST Cílem praktické části je srovnat dvě diagnostické soupravy pro stanovení antigenu HLA-B27 pomocí průtokové cytometrie v rutinní laboratoři. První soupravou je DURACLONE B27 Reagent Kit s protilátkami HLA-B27-PE, CD3 monoklonální protilátkou a HLA-B7. Druhou je IO TEST pro stanovení HLA-B27 antigenu s protilátkami HLA-B27-FITC a HLA-B7-PE. Srovnávacími kritérii jsou cena, doba přípravy vzorku, náročnost měření a citlivost záchytu pozitivity. A dále zpracovat a předložit výsledky o výskytu antigenu HLA-B27 u osob v roce 2017 v laboratoři Česká Laboratorní s.r.o. v Praze a jeho vztahu k diagnóze, pohlaví a věku pacientů. 2.1 Použité metody a materiál Ke stanovení HLA-B27 antigenu bylo použito metody průtokové cytometrie a setů určených ke stanovení antigenu HLA-B27 IOset a DURACLONE B27 Reagent Kit. Pro vyšetření HLA-B27 antigenu se odebírá 2-5 ml venózní nesrážlivé krve do zkumavky s K3EDTA (fialové víčko). Tato metoda se provádí v laboratoři klinické imunologie a sérologie. Statimové vyšetření (přednostní vyšetření před ostatními vzorky) se u této metody neprovádí. Výsledek vyšetření dostane ošetřující lékař obvykle do druhého dne. 2.1.1 Typizace antigenu HLA-B27 pomocí průtokové cytometrie 2.1.1.1 Preanalytická fáze Preanalytická fáze je soubor všech postupů a operací, kterými projde vzorek biologického materiálu od okamžiku vzniku požadavku na analýzu, do okamžiku, kdy je vzorek analyticky zpracován. Lékař, který odebírá vzorek, informuje pacienta o požadavcích na odběr. Každá laboratoř musí mít veřejně přístupnou Laboratorní příručku, ve které jsou uvedeny informace týkající se daného vyšetření. K odběru se používají jednorázové pomůcky a doporučené dezinfekční prostředky. 24

Pacient, u kterého má lékař podezření na antigen HLA-B27 (bolesti zad, ankylozující spondylitida, Reiterův syndrom, psoriatrická artritida, juvenilní chronická artritida, akutní uveitida, apod) je poslán na odběr. Pacient nemusí být nalačno, odebere se mu 2 5 ml venózní nesrážlivé krve do zkumavky s EDTA (fialové víčko). Odebranou krev je potřeba dobře promíchat, aby se dobře promísila s protisrážlivým činidlem a nevznikly sraženiny. Zkumavka s krví pacienta obsahuje štítek se jménem, datem narození a rodným číslem pacienta a datem odběru. Při odběru může dojít k chybě, např.: záměna zkumavky s krví jiného pacienta, nedostatečné množství vzorku pro analýzu, nesprávný poměr protisrážlivého činidla a krve, znečištění vzorku nezaschlou dezinfekcí při odběru, použití úzké jehly a násilné nasátí krve nebo prudké třepání krve ve zkumavce. Vzorek je poté dopraven do laboratoře (doporučená teplota při transportu je 15 25 C), kde je předán pracovníkům na přijmu vzorků. Ti vzorek zkontrolují a zkontrolují také řádně vyplněnou žádanku od lékaře, na které je uveden čas a datum odběru vzorku. Laboratoř odmítne vyšetření těch vzorků, u kterých žádanka není správně vyplněna, je potřísněna biologickým materiálem, odebrané množství materiálu není dostačující, nebo je vzorek chybně označen. Chybějící údaje je třeba telefonicky doplnit nebo ověřit. U biologického materiálu, který byl chybně odebrán, nelze vyšetření provést. Neadekvátní vzorek je označen jako neuzavřený a je třeba provést nový odběr. Správně vyplněná žádanka obsahuje tyto údaje: adresu zdravotnického zařízení, jméno a příjmení, rodné číslo, pohlaví a zdravotní pojišťovnu pacienta, diagnózu nemoci, požadovaná vyšetření, datum a čas odběru vzorku, odebraný materiál (typ vzorku), jméno, podpis a razítko odesílajícího lékaře s platným telefonním číslem. Pokud je žádanka i odebraný materiál v pořádku, vzorek je zapsán do laboratorního informačního systému (LIMS) a polepí se štítkem, na kterém je vytištěno jméno a rodné číslo pacienta a obsahuje specifický čárový kód. Vzorek je odnesen do laboratoře klinické imunologie a sérologie, kde si jej převezme pracovník imunologie. Následuje analytická fáze. (23) 2.1.1.2 Přístroje a pomůcky Pro stanovení HLA-B27 antigenu z lidské periferní krve budeme potřebovat průtokový cytometr vybavený 488 nm laserem, umožňujícím detekci forward a side scatter. V našem 25

případě se jedná o cytometr do firmy Becman Coulter NAVIOS, od které jsou i používané reagencie. Mezi další potřebné vybavení patří kalibrované automatické pipety na pipetování vzorků a reagencií (5μl, 25μl, 50μl a 500μl pipety), příslušné špičky a 5ml zkumavky vhodné pro měření v průtokovém cytometru a vortex. 2.1.1.3 Reagencie Balení DURACLONE B27 Reagent Kit obsahuje 50 zkumavek s vysušenou protilátkou, které jsou již připravené k použití, a 25 ml lyzačního pufru DuraLyse. Pro stanovení HLA-B27 antigenu pomocí IOsetu se používají protilátky IgG1 Mouse-FITC, HLA-B27-FITC a HLA-B7-PE a lyzační pufr Lysis Solution. Pro kalibraci a kontrolu správného měření průtokového cytometru se používá kalibrační roztok FlowCheck. 2.1.1.4 Princip Oba testy jsou založeny na schopnosti specifických monoklonálních protilátek navázat se na antigenní determinant exprimovaný leukocyty na jejich povrchu. Krev pacienta je inkubována se specifickými protilátkami, které se v případě přítomnosti specifického antigenu naváží na leukocyty. Červené krvinky jsou následně odstraněny pomocí lyzačního roztoku, který erytrocyty lyzuje. Leukocyty jsou poté analyzovány pomocí průtokové cytometrie. Průtokový cytometr měří rozptyl světla a fluorescenci buněk. To umožňuje vymezení populace, která nás zajímá, pomocí počítačového softwaru, který zobrazuje histogram korelující kolmou difúzi světla (Side Scatter neboli SS) a přímou difúzi světla s malým úhlem (Forward Scatter neboli FS). Další histogramy, kombinující dva rozdílné parametry dostupné na cytometru, mohou být použity při upřesnění označení oblasti, kterou chceme měřit. (15) Fluorescence vymezených buněk je analyzována na základě rozlišení pozitivních elementů a negativních. V našem případě se na základě síly fluorescence rozlišují HLA-B27 pozitivní a HLA-B27 negativní pacienti. 2.1.1.5 Postup Nejprve si popíšeme postup pro stanovení HLA-B27 antigenu pomocí IOtestu. Důležité je zkontrolovat údaje uvedené na zkumavce a žádance. Pro každý vzorek si připravíme a popíšeme dvě 5ml zkumavky jménem pacienta nebo číslem vzorku. Na první zkumavku připíšeme G1, na druhou HLA-B27. Do první zkumavky napipetujeme 5 μl IgG1 Mouse-FITC/PE (G1) 26

monoklonální protilátky a přidáme 50 μl dobře promíchané vyšetřované krve. Tato zkumavka plní funkci negativní kontroly, podle které se nastaví začátek měření v obou fluorescencích (FITC, PE). Do druhé zkumavky, nadepsané HLA-B27, napipetujeme 5 μl HLA-B27- FITC/HLA-B7-PE monoklonální protilátky a přidáme 50 μl vyšetřované krve. Obě zkumavky dobře promícháme na vortexu a necháme 10 minut inkubovat ve tmě při pokojové teplotě. Po deseti minutách do obou zkumavek přidáme po 500 μl lyzačního roztoku Lysis Solution, promícháme na vortexu a necháme opět inkubovat ve tmě dalších 10 minut. Poté je vzorek připraven k měření. V případě použití metody DURACLONE si z DURACLONE B27 Reagent Kitu vezmeme jednu zkumavku s již předpřipravenými vysušenými protilátkami na dně zkumavky, popíšeme ji pacientským jménem nebo číslem vzorku a napipetujeme do ní 25 μl vyšetřované krve. Dobře promícháme na vortexu, a necháme inkubovat 25 minut ve tmě při pokojové teplotě. Poté do zkumavky přidáme 500 μl lyzačního roztoku DuraLyse, který je součástí kitu a necháme inkubovat 15 minut ve tmě při pokojové teplotě. Vzorek je nyní připraven k měření. 2.1.1.6 Měření Vzorek připravený k měření (inkubovaný s protilátkami a lyzačním roztokem) dobře promícháme na vortexu a umístíme na první pozici do stojanu do průtokového cytometru. Na počítači otevřeme program NAVIOS software a ujistíme se, že je cytometr propojený s počítačem. Tento software umožňuje ovládání cytometru a označování populací buněk, díky čemuž docílíme vybrání právě těch leukocytů, které chceme měřit. Před prvním měřením je nutné nastavit fluorescenční filtry dle návodu výrobce, v našem případě už je vše v programu nastaveno a nic nastavovat nemusíme. Každý den se měří také kontrola pomocí FlowChecku, abychom se ujistili, že cytometr měří správně. V případě IOtest si z nabídky předpřipravených protokolů vybereme protokol s názvem HLA- B27. Toto je přednastavený protokol pro měření HLA-B27 antigenu pomocí metody IOtest. Stojánek se vzorkem (dvě zkumavky, na 1. pozici G1, na 2. pozici HLA-B27) umístíme do průtokového cytometru na místo pro něj určené. Do protokolu zadáme číslo stojánku a jméno pacienta. Spustíme měření pomocí tlačítka play v horní liště. Cytometr si ověří číslo stojánku pomocí čárového kódu a začne s měřením. V prvním okně označíme populaci lymfocytů, viz obr. č. 4. Ve druhém okně nastavíme kříž tak, aby všechny obarvené buňky byly umístěny v dolním levém kvadrantu viz obr. 4. Ve třetím okně posuneme posuvník kolmý na osu x k pravému konci píku - viz obr. č. 4. Lymfocyty jsou obarvené monoklonální protilátkou IgG1-27

FITC/IgG1-PE. Po změření alespoň 5 000 buněk (počet změřených buněk vidíme v pravém dolním rohu programu NAVIOS) zastavíme měření pomocí tlačítka stop. Cytometr začne měřit 2. zkumavku (HLA-B27). Zde už nic nenastavujeme ani neposouváme, vše jsme nastavili pomocí první zkumavky (G1), pouze necháme cytometrem naměřit alespoň 5 000 buněk a opět zastavíme měření pomocí stop. Cytometr doměří vzorek, vrátí ho do stojánku a vytiskne výsledný protokol. Obrázek 4 Program NAVIOS - označení populace lymfocytů v IOtestu, nastavení úsečky podle kontroly IgG1-FITC/IgG1-PE (screenshot z programu NAVIOS z laboratoře Česká Laboratorní s.r.o.) Při měření metodou DURACLONE do stojánku na 1. pozici umístíme připravený vzorek (inkubovaný s monoklonálními protilátkami a lyzačním roztokem) a v protokolu vybereme metodu DURACLONE B27, vyplníme číslo stojánku a jméno nebo číslo pacienta. V nastavení programu (ozubené kolečko) vybereme možnost QUICKset, díky čemuž se nám při měření zobrazí posuvník, který posuneme na potřebnou hodnotu. Zmáčkneme tlačítko play. V prvním a druhém okně označíme populace leukocytů (viz obr. č. 5). V 3., 4. a 7. okně nastavíme pomocí posuvníku hodnotu, která se nachází u píku. V případě 3. a 4. okna je to hodnota 19 a v případě 7. okna je to hodnota 15 (viz obr. č. 5). Poté necháme změřit alespoň 5 000 buněk a ukončíme měření tlačítkem stop a vytiskne se výsledný protokol. 28

Obrázek 5 Program NAVIOS - označení leukocytů v metodě DURACLONE B27 (screenshot z programu NAVIOS z laboratoře Česká Laboratorní s.r.o.) 2.2 Zpracování získaných dat Získaná data v České Laboratorní s.r.o. zpracovávají pracovníci s vysokoškolským titulem v oboru klinické imunologie. Jsou zde 3 možné výsledky pozitivní, negativní a hraniční hodnoty (viz obr. č 6 IOtest a obr. č. 7 DURACLONE). Rozmezí hodnot určuje výrobce reagencií pro každou šarži zvlášť. Pacientům s hraniční hodnotou je doporučeno genetické vyšetření pomocí PCR na přítomnost alely pro antigen HLA-B27. 29

U obou testů (IOtestu i DURACLONE) při interakci monoklonální protilátky s antigenem HLA-B7 a jinými anti HLA-B antigeny může dojít ke křížové reakci, což může způsobit falešnou pozitivitu. Proto je nutné potvrdit přítomnost anti HLA-B27 pomocí PCR. (24) Obrázek 6 Možné výsledky IOtestu nahoře negativní, uprostřed pozitivní, dole hraniční (screenshot z programu NAVIOS) 30

Obrázek 7 DURACLONE - výsledky - nahoře negativní, dole pozitivní (screenshot z programu NAVIOS) 31

3 VÝSLEDKY V první části se budeme věnovat srovnání setu na stanovení antigenu HLA-B27. Srovnávat budeme IOtest a DURACLON se zaměřením na časovou náročnost, měření a přípravu vzorku. V další části se zaměříme na statistiku výskytu antigenu HLA-B27 u vyšetřovaných osob za rok 2017 v závislosti na pohlaví, věku a diagnóze pacienta. 3.1 Porovnání IO testu a DURACLONE B27 K porovnání obou testů jsme si vybrali 50 pacientských vzorků, 25 mužů a 25 žen v různém věkovém rozpětí, nejmladšímu pacientovi byly 3 roky, nejstaršímu bylo 70. V této části práce se nezajímáme o diagnózu pacientů. Hlavním kritériem je výsledek jednotlivých metod. Konečný výsledek jsme ověřili pomocí metody PCR, kde jsme potvrdili přítomnost nebo nepřítomnost alely pro antigen HLA-B27. Celkové výsledky jednotlivých metod jsou ukázány v tabulce č. 4 a pro přehlednost v grafu č. 1. Tabulka 4 Výsledky jednotlivých testů Výsledky Výsledky jednotlivých tesů Počet pacientů HLA B27 IOTest DURACLONE B27 PCR Negativní 33 42 42 Hraniční 10 5 0 Pozitivní 7 3 8 Celkem 50 50 50 32

Výsledky jednotilvých testů 50 40 30 20 10 0 42 42 33 10 7 5 3 8 0 Negativní Hraniční Pozitivní HLA B27 IOTest DURACLONE B27 PCR Graf 1 Výsledky jednotlivých metod V případě IOTestu bylo z celkového počtu 50 vzorků 33 negativních, 10 hraničních a 8 pozitivních. U DURACLONE B27 jsme naměřili 42 negativních, 5 hraničních a 3 pozitivní pacienty. Pozitivní a hraniční pacienty jsme ověřili pomocí metody PCR. Z 8 pozitivních vzorků stanovených na průtokovém cytometru bylo 7 pozitivních na přítomnost alely pro antigen HLA-B27 i pomocí metody PCR. U jednoho pacienta se pravděpodobně jednalo o interakci mezi monoklonální protilátkou a anti HLA-B7, která způsobila falešnou pozitivitu. Ze 7 hraničních výsledků bylo pomocí PCR dourčeno 6 vzorků jako negativních a 1 jako pozitivní (viz tab. č. 5). Tabulka 5 Výsledky potvrzení antigenu HLA-B27 pomocí metody PCR Výsledky potvrzení antigenu HLA-B27 u pozitivních / hraničních výsledků Počet vzorků Pozitivní PCR Negativní PCR Pozitivní FLOW 8* 7 1 Hraniční FLOW 7 1 6 Celkem 15 8 7 * Jeden pacient pozitivní HLA-B27 IOTest ALE negativní PCR možná interakce s anti HLA-B7 Z výsledků vyplývá, že test DURACLONE je přesnější pro určení negativních pacientů. IOTest je citlivější, proto občas i negativní pacienty určí jako hraniční a poté je potřeba zvolit alternativní vyšetření, jako je PCR. Oproti tomu IOTest byl přesnější pro určení pozitivních pacientů, kde podle IOTestu bylo 7 pozitivních pacientů a podle DURACLONE 3 pozitivní a 33

5 hraničních. Po provedení PCR se ukázalo, že těchto 5 hraničních pacientů bylo také pozitivních. 3.1.1 Časová náročnost a příprava vzorku Doba přípravy vzorků se u jednotlivých metod podstatně liší. Déle trvá vyšetření pomocí DURACLONE, kde se celkový čas přípravy vzorku pohybuje kolem 45 minut (25 minut inkubace s monoklonálními protilátkami, 15 minut inkubace s lyzačním roztokem a 5 minut samotné měření. V případě IOTestu je doba přípravy znatelně kratší, přibližně 25 minut (10minut inkubace s monoklonálními protilátkami, 10 minut inkubace s lyzačním roztokem a 5 minut měření). Oba testy se liší i přípravou vzorku. Pro IOTest potřebujeme 2 zkumavky a 2 rozdílné monoklonální protilátky, kdežto u DURACLONE je vše už ve zkumavce předpřipravené od výrobce, stačí přidat krev a ušetří se i další materiál, jako špičky a zkumavky. Dalším rozdílem je množství pacientské krve pro jedno vyšetření. V případě IOtestu je to 50 μl, u DURACLONE potřebujeme jen poloviční množství, tedy 25 μl. 3.1.2 Měření Odlišné je i samotné měření na průtokovém cytometru, kde jednoznačně jednodušší je měření u IOTestu (viz kapitola 2.1.1.6). V případě DURACLONE je měření časově i prakticky náročnější, protože musíme nastavovat více parametrů najednou. Pro laboranta je určitě snadnější a pohodlnější IOTest. 34

3.2 Výskyt antigenu HLA-B27 u vyšetřovaných osob za rok 2017 V této praktické části práce se budeme zabývat výskytem antigenu HLA-B27 u vyšetřovaných osob za rok 2017 v laboratoři Česká Laboratorní s.r.o. Za rok 2017 se v laboratoři Česká Laboratorní s.r.o. vyšetřovalo celkem 344 pacientů, z toho bylo 40 pacientů pozitivních, 271 negativních a 33 hraničních (viz graf č. 2). Z těchto 344 pacientů bylo 142 mužů a 202 žen (viz graf č. 3). Z grafu vyplývá, že na vyšetření antigenu HLA-B27 bylo posláno o něco více žen (59 %) než mužů (41 %) Poměr pozitivní / negativní / hraniční pacienti Pozitivní Negativní Hraniční 9% 12% 79% Graf 2 Poměr pozitivní / hraniční / negativní pacienti za rok 2017 Celkový poměr muži / ženy Muži Ženy 41% 59% Graf 3 Celkový poměr vyšetření muži / ženy za rok 2017 35

Celkem 3.3 Výskyt antigenu HLA-B27 u žen a mužů Z celkového počtu 40 pozitivních pacientů za rok 2017 bylo 26 žen (65%) a 14 mužů (35%) pozitivních na přítomnost antigenu HLA-B27 (viz tab. č. 6 a graf č. 4) Z celkového počtu 344 vyšetřovaných osob bylo 14 mužů pozitivních na antigen HLA-B27 (4,1 %) a 26 žen pozitivních na antigen HLA-B27 (7,6 %). Tabulka 6 Celkový počet HLA-B27 pozitivních pacientů muži / ženy Celkový počet HLA-B27 pozitivních pacientů % z počet HLA-B27 pozitivních pacientů celku Muži 14 35 Ženy 26 65 Celkem 40 100 Celkový počet HLA-B27 pozitivních pacientů 40 30 20 10 Muži 14 Ženy 26 0 Graf 4 Celkový počet HLA-B27 pozitivních pacientů poměr muži / ženy 36

3.4 Výskyt antigenu HLA-B27 v závislosti na věku Pacienti byli rozděleni do devíti skupin po podle věku a déle podle pohlaví. Výskyt antigenu HLA-B27 v závislosti na věku a pohlaví viz tabulka č. 7 a graf č. 5. Tabulka 7 Výskyt HLA-B27 antigenu v závislosti na pohlaví a věku Věk Počet pacientek Výskyt HLA-B27 antigenu v závislosti na pohlaví a věku ŽENY Pozitivní - ženy % pozitivních z celku Počet pacientů Muži Pozitivní - muži % pozitivních z celku 0-9 6 0-4 1 25,00 10-19 9 1 11,11 8 0-20-29 15 3 20,00 27 3 11,11 30-39 38 7 18,42 28 5 17,86 40-49 56 5 8,93 29 2 6,90 50-59 34 4 11,76 18 0-60-69 29 3 10,34 13 0-70-79 11 2 18,18 8 0-80-89 4 1 25,00 7 3 42,86 Celkem 202 26 142 14 Výskyt HLA-B27 antigenu v závislosti na pohlaví a věku Pozitivní -ženy Pozitivní - muži 7 5 5 0 1 1 0 3 3 2 4 3 2 0 0 0 1 3 0-9 10-19 20-29 30-39 40-49 50-59 60-69 70-79 80-89 Graf 5 Výskyt HLA-B27 antigenu v závislosti na pohlaví a věku pacientů 37

Z tabulky a grafu je patrné, že největší výskyt pozitivních pacientů je ve věku mezi 30-39 rokem života a dále u žen ve věkovém rozmezí 40 49let. 3.5 Výskyt antigenu HLA-B27 ve vztahu k diagnóze pacienta Pacienty jsme podle diagnózy rozdělili do 9 skupin nemoci krve a imunity (D), nemoci kůže a podkožního vaziva (L), nemoci dýchací soustavy (J), nemoci svalové a kosterní soustavy (M), alergie (A), nemoci endokrinní a metabolické (E), nemoci oka a očních adnex, nemoci ucha (H), nemoci oběhové soustavy (I), celkové lékařské vyšetření (Z) viz tabulka č. 8 a graf č. 6. Nejvíce pozitivních pacientů je u diagnóz nemocí svalové a kosterní soustavy (45%) a u diagnóz nemocí krve a imunity (22,5%). Tabulka 8 Výskyt HLA-B27 antigenu v závislosti k diagnóze pacienta Výskyt HLA-B27 antigenu v závislosti k diagnóze pacienta Skupiny diagnóz Počet % z celku D - Nemoci krve a imunity 9 22,5 J - nemoci dýchací soustavy 3 7,5 L - nemoci kůže a podkožního vaziva 1 2,5 M - nemoci svalové a kosterní soustavy 18 45 T - Alergie 1 2,5 E - nemoci endokrinní a metabolické 1 2,5 H - nemoci oka a očních adnex, nemoci ucha 2 5 I - Nemoci oběhové soustavy 3 7,5 Z - celkové lékařské vyšetření 2 5 Celkem 40 100 38

20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 Výskyt HLA-B27 antigenu v závislosti k diagnóze 9 3 1 18 1 1 2 3 2 Graf 6 Výskyt HLA-B27 antigenu v závislosti k diagnóze pacienta Graf č. 7 nám ukazuje výskyt antigenu HLA-B27 v závislosti k diagnóze pacienta a na pohlaví. Nejvíce je pozitivních žen je u diagnóz nemocí svalové a kosterní soustavy (10 žen) a nemocí krve a imunity (8 žen). Muži s antigenem HLA-B27 mají nejčastěji diagnózu nemoci svalové a kosterní soustavy (8 mužů). 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 1 8 0 3 1 0 8 10 2 1 1 1 1 1 1 1 0 0 Muži Ženy Graf 7 Výskyt antigenu HLA-B27 v závislosti k diagnóze a na pohlaví pacienta 39