Možnosti ovlivnění obsahu mykotoxinů v potravním řetězci

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Možnosti ovlivnění obsahu mykotoxinů v potravním řetězci Bakalářská práce Vedoucí práce: Doc. Ing. Jiří Skládanka, Ph.D. Lenka Slonková Brno 2012

Na tomto místě bych ráda poděkovala Doc. Ing. Jiří Skládanka, Ph.D. za odborné rady, cenné připomínky a materiál, který mi poskytnul v průběhu realizace této práce.

Prohlašuji, že bakalářskou práci jsem zpracovala samostatně na základě literatury uvedené v seznamu. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. datum....................................................

Abstract Slonková, L. Possibilities of influencing the content of mycotoxins in food chain. Bachelor s thesis. Brno 2012 This thesis deals with the possibilities of influencing the content of mycotoxins in the food chain. The present work is characterized by filamentous fungi, the most important producers and the most serious diseases caused by fungi, including fungal and mykoalergosis. The next section describes the mycotoxins that are secondary metabolites of microscopic filamentous fungi. Mycotoxins are highly toxic and carcinogenic substances produced by fungi Aspergillus, Penicillium, Fusarium. Key words:mycotoxins, filamentous fungi, toxigenic fungi Abstrakt Slonková, L. Možnosti ovlivnění obsahu mykotoxinů v potravním řetězci. Bakalářská práce. Brno 2012. Bakalářská práce se zabývá možnostmi ovlivnění obsahu mykotoxinů v potravním řetězci. Předložená práce charakterizuje vláknité mikroskopické houby, jejich nejdůležitější producenty a nejzávažnější onemocnění způsobené plísněmi, mezi které patří mykózy a mykoalergózy. V další části práce byly popsány mykotoxiny, které jsou sekundární metabolity vláknitých mikroskopických hub. Mykotoxiny jsou vysoce toxické a karcinogenní látky, produkované plísněmi Aspergillus, Penicillium, Fusarium. V další části práce jsou popsány nejvýznamnější mykotoxiny, které ve středoevropských zemích jsou aflatoxiny, ochratoxiny, fumonisiny aj. Závěr práce je věnován snížení produkce mykotoxinů v krmivech a v potravinách rostlinného i živočišného původu, kdy je dobré řešit spíše prevenci, protože dekontaminace infikovaných produktů je prakticky nemožná. Klíčová slova: mykotoxiny, vláknité mikroskopické houby, toxinogenní plísně 4

Obsah 1 Úvod 7 2 Cíl práce 8 3 Vláknité mikroskopické houby 9 3.1 Morfologie................................. 10 3.2 Rozmnožování plísní........................... 11 3.2.1 Pohlavní rozmnožování...................... 13 3.2.2 Nepohlavní rozmnožování.................... 13 3.3 Napadení potravin a krmiv plísněmi................... 13 3.4 Onemocnění vyvolané plísněmi...................... 14 3.4.1 Mykózy.............................. 14 3.4.2 Mykoalergózy........................... 15 3.5 Nejdůležitější rody toxinogenních plísní................. 15 3.5.1 Rod Aspergillus.......................... 16 3.5.2 Rod Penicillium.......................... 19 3.5.3 Rod Fusarium........................... 20 4 Mykotoxiny 22 4.1 Klasifikace................................. 22 4.2 Mykotoxikózy............................... 23 4.3 Významné mykotoxikózy......................... 25 4.3.1 Ergotismus............................ 25 4.3.2 Alimentární toxická aleukie................... 25 4.3.3 Akutní kardiální beri-beri.................... 26 4.4 Výskyt mykotoxinů v krmivech a jejich vliv na potravinové suroviny. 26 4.5 Producenti mykotoxinů.......................... 28 4.6 Faktory ovlivňující produkci mykotoxinů v potravinách........ 28 4.6.1 Teplota.............................. 29 4.6.2 Vlhkost.............................. 29 5

4.6.3 Přítomnost kyslíku........................ 30 4.6.4 Hmyz............................... 30 4.6.5 Substrát.............................. 30 4.7 Přehled a charakteristika nejvýznamnějších mykotoxinů........ 31 4.7.1 Ochratoxiny............................ 31 4.7.2 Patulin............................... 32 4.7.3 Zearalenon............................. 33 4.7.4 Fumonisiny............................ 34 4.7.5 Aflatoxiny............................. 35 4.8 Možnosti ovlivnění obsahu mykotoxinů v potravním řetězci...... 38 5 Závěr 40 6 Reference 41 6.1 Knižní literatura............................. 41 6.2 Internetové zdroje............................. 42 Přílohy 45 A Faktory ovlivňující výskyt mykotoxinů v potravinách a krmivech 46 B Významní producenti mykotoxinů v potravinách a potravinových surovinách 47 6

1 Úvod Každý člověk na světě se již setkal s vláknitými mikroskopickými houbami. A i kdyby tvrdil, že se s nimi dosud nesetkal, stačí mu vysvětlit, že tento název pod sebou skrývá docela obyčejné plísně. Vláknité mikroskopické houby provází lidstvo už od nepaměti. Na naší planetě se vyskytují asi 300 miliónů let. Pokud se řekne plíseň, vnímá ji člověk jako organismus vyskytující se v našich domácnostech a pro lidstvo představující zdravotní riziko. Vláknité mikroskopické plísně se vyskytují všude tam, kde existuje organická hmota. V životním a pracovním prostředí jsou plísně přítomné v ovzduší, půdě, ve vodě nebo na povrchu živých i odumřelých organismech. Vhodným substrátem pro růst a rozmnožování toxinogenních mikromycetů jsou potraviny a potravinové suroviny živočišného i rostlinného původu. Je třeba si uvědomit, že plísně mohou produkovat toxické látky - mykotoxiny, které jsou pro organismus lidí a zvířat škodlivé. Mykotoxiny jsou vysoce toxické sekundární metabolity, produkované především plísněmi rodu Aspergillus, Fusarium, Penicillium. Tyto látky způsobují řadu závažných onemocnění pro člověka i zvířata. K jedné z nejvýznamnějších a nejlépe popsaných skupin mykotoxinů patří aflatoxiny. Aflatoxiny jsou produkované toxinogenními kmeny Aspergillus flavus a Aspergillus parasiticus. Mezi nejtoxičtější aflatoxiny patří aflatoxin B1, který je nejsilnější přírodní karcinogen a nejúčinnější hepatokarcinogen. Některé plísně se člověk během své existence naučil využívat ke svému prospěchu. To potvrzuje i objev výskytu penicilinu (antibiotikum) produkovaný plísní Penicilllium chrysogenum. V současné době jsou i nadále objevovány a charakterizovány nové plísně a mykotoxiny. 7

2 Cíl práce Cílem bakalářské práce bylo: popsat charakteristiku plísní a sekundární metabolity (mykotoxiny), přiblížit vhodné podmínky pro růst plísní a tvorbu mykotoxinů, zaměřit se na výskyt mykotoxinů v krmivech, na poli a následný přechod z krmiv přes živočišné produkty do potravin, prostudovat možnosti omezení výskytu mykotoxinů v krmivech, potravinách a potravinových surovinách. 8

3 Vláknité mikroskopické houby Mikromycety jsou vícebuněčné, eukaryotní, pokročile heterotrofní mikroorganismy (Ostrý, 2000). V převážné většině se jedná o saprofytické organismy, které plní v ekosystémech nenahraditelnou roli destruentů a podílí se tak významně na koloběhu látek a energie v přírodě. Jen malá část hub se přizpůsobila k parazitismu jiných organismů, včetně člověka. Po celém světě jsou rozšířené některé druhy mikroorganismů a spolu s kvasinkami a kvasinkovými mikroorganismy tvoří skupinu mikroskopických hub (Malíř a kol., 2003). Velká morfologická a fyziologická rozmanitost a adaptabilita mikromycetů k nejrůznějším ekologickým podmínkám umožňuje výskyt všude tam, kde existuje organická hmota (Fassatiová, 1979). Spory mikromycetů jsou jednobuněčné a vícebuněčné výtrusy, které slouží k rozmnožování, šíření a jejich přežívání v nepříznivých podmínkách (Paříková a Kučerová, 2001). Spory hrají významnou úlohu v patogenezi ekotoxických onemocnění v případě patogenních hub (mykóza, mykoalergie, mykotoxinózy), (Šilhánková, 2002). V životním a pracovním prostředí jsou vláknité mikromycety přítomné v ovzduší, půdě, ve vodě, na povrchu živých a odumřelých organismů, v krmivu, na různých předmětech nebo na plochách. Velmi vhodným substrátem pro osídlení, růst a rozmnožování toxinogenních mikromycetů jsou potraviny a potravinové suroviny živočišného a rostlinného původu (Chlupáčová, 2002; Malíř a kol., 2003; Ostrý, 2011). Vliv na zvýšený výskyt spor či fragmentů hyf v ovzduší závisí i na klimatických podmínkách a na stupni narušení biologické rovnováhy životního prostředí. Z celkového počtu 100 000 druhů hub tvoří mikroskopické houby 6 000 rodů s 64 000 druhy. V potravinách je popsáno 114 druhů mikromycetů (Ostrý, 2000; Macháček, 2004). Věda zabývající se houbami se nazývá mykologie a systematičtí mykologové taxonomicky člení houby na: oddělení: Myxomycota (hlenky), oddělení: Chytridiomycota, oddělení: Hypochytridiomycota, oddělení: Oomycota (řasohouby), oddělení: Eumycota: třída: Zygomycetes, třída: Trichomycetes, 9

třída: Endomycetes, třída: Asomycetes, třída: Basidiomycetes, pomocná třída: Deuteromycetes (fungi imperfecti) (Paříková a Kučerová, 2001). Systematika hub je velmi složitá. Jedná se zde o heterogenní skupinu nejen z hlediska fylogenetického a taxanomického, ale i po stránce morfologické a ekologické. Obecně můžeme houby dělit na: makroskopické - houby vyšší s plodnicí viditelnou pouhým okem, mikroskopické - houby nižší, které můžeme sledovat pod mikroskopem. Mikroskopické houby můžeme dále z praktického hlediska dělit na : mikroskopické kvasinkové houby, kvasinky a kvasinkovité, mikroskopické vláknité houby - mikromycety (Paříková a Kučerová, 2001). Optimální teploty pro růst mikromycet jsou od 18 C do 32 C, ale mnohé přežívají i pod bodem mrazu a některé sporulují kolem 0 C (Chlupáčéová, 2002). Teplota 71 C je pro houby letální. Některé mikromycety řadíme mezi termotolerantní a rostou při teplotách kolem 40 C (Macháček, 2004). 3.1 Morfologie Mikroskopické houby náleží eukaryotickým organismům. Základem jejich těla je vláknitý útvar, který se nazývá hyfa (Votava, 2003). Hyfy mohou být dělené buněčnými přehrádkami (vícebuněčné - ascomycota a mitosporické houby) nebo mohou být nedělené (jednobuněčné - typické pro spájivé houby = Zygomycota), (Paříková a Kučerová, 2001). Typ přehrádek je charakteristický pro jednotlivá oddělení hub. Ve stěně přehrádek hyf většiny zástupců oddělení Basidiomycota jsou vytvořeny dolipory, to jsou póry, jejichž obě strany jsou kryty membránovou čepičkou parentosomem. Přehrádky zástupců hyf oddělení Ascomycota rostou centripetálně, uprostřed přehrádky zůstává jednoduchý pór, který umožňuje přechod plazmy i jader. Uzavírání pórů je spojeno s Woroninovými tělísky (krystalické útvary v buňce poblíž pórů). Jednotlivé buňky hyf mohou mít jedno jádro (monokaryotické mycelium), dvě jádra (dika- 10

Obrázek 1: A - Hyfa s přehrádkami; B - Conocytická hyfa (Paříková a Kučerová, 2001) ryotické mycelium) nebo více jader (heterokaryóza), (Malíř a kol., 2003). Hyfy se opakovaně větví a vytvářejí velmi složitou spleť vláken, která se nazývá mycelium (podhoubí). Můžeme je pozorovat na různých plochách a na povrchu nejrůznějších materiálů v podobě barevných nárůstů (bílé, žluté, krémové, hnědé, modré, zelené, šedé, černé), (Křižíková, 2010). Vliv na barvu mycelia mají pigmenty, které zbarvují nejen povrchovou membránu vegetativní části plísně, ale hlavně jejich výtrusy spory (Šilhánková, 2002). 3.2 Rozmnožování plísní Plísně se rozmnožují jednak rozrůstáním hyf a jednak sporami (Šilhánková, 2002). Spory jsou mikroskopické rozmnožovací částice plísní, které vznikají pohlavním nebo nepohlavním (vegetativním) způsobem. Jsou lehké, vodoodpudivé a velice snadno se uvolňují z rozmnožovacích útvarů do okolního prostředí, kde kontaminují tak i další povrchy a plochy předmětů (Chlupáčová, 2002). Nepohlavní rozmnožování se může opakovat několikrát do roka, což vede k produkci velkého množství spor (Paříková a Kučerová, 2001). Existují dva základní způsoby vzniku spor - thalický a blastický. Thalický vývoj: představuje vznik spory z již existující struktury - hyfy, obvykle kombinací lytických procesů a rozpadu hyfy. Blastický vývoj: buňky spor se tvoří de novo(malíř a kol., 2003). U jednoho jedince se tedy podle způsobu rozmnožování rozlišuje forma pohlavní - teleomorfa (perfektní, sexuální stádium) a forma nepohlavní - anamorfa (imperfektní, asexuální stádium - Obrázek 2). Životní cyklus plísní (Obrázek 3) začíná vyklíčením spory. Klíček nejprve prorazí buněčnou stěnu, kdy v této fázi získává vlákno živiny přímo ze spory, z níž vyrůstá. Jestliže vyklíčené vlákno nalezne dostatek živin, rozroste se v hyfu a pak v mycelium. Mycelium se poté diferencuje na část vegetativní a část reprodukční (Paříková a Kučerová, 2001). 11

Obrázek 2: Schematické znázornění anamorfního a tleomorfního stadia (Paříková a Kučerová, 2001) Obrázek 3: Životní cyklus plísní (1 spora, 2 naklíčená spora, 3 hyfa, 4 mycelium, 5 mycelium s rozmnožovacím orgánem, 6 rozmnožovací orgán s uvolňujícími se sporami (Paříková a Kučerová, 2001) 12

3.2.1 Pohlavní rozmnožování Způsob pohlavního rozmnožování, typ reprodukčních struktur, jejich velikost a tvar, představují základní kritéria klasifikace hub do vyšších taxonomických jednotek. Při sexuální reprodukci hub, vznikají pohlavní spory po předchozím sexuálním procesu uvnitř - endospory nebo vně - exospory specializovaných buněk (Malíř a kol., 2003). Pohlavního rozmnožování je schopna většina pravých hub, jejímž výsledkem je tvorba askospor, bazidiospor, oospor nebo zygospor. Pohlavní spory vznikají po spájení dvou buněk. Mezi plísněmi jsou známy homothalické rody u nichž dochází ke spájení buněk vyrůstající z téže hyfy, ale převážná část plísní je heterothalická, kde každý druh obsahuje kmeny pohlavního typu a kmeny opačného typu (Šilhánková, 2002). 3.2.2 Nepohlavní rozmnožování Vegetativní spory se mohou tvořit buď na vegetativních hyfách nebo na zvláštních fruktifikačních orgánech. Podle umístění orgánů zde rozlišujeme exospory nebo-li konidie a endospory (Malíř a kol., 2003). Exospory různých rodů jsou značně odlišné, např. mohou mít tvar elipsoidní, srpkovitý, kulovitý, válcovitý, spirálovitě stočený apod., dále mohou být jednobuněčné zvané mikrokonidie nebo vícebuněčné makrokonidie a umístěny jednotlivě v řetězcích nebo v kulovitých útvarech. Podle způsobu tvorby rozeznáváme: oidie neboli artrospory - vznikající rozpadem vláken v jednotlivé buňky, blastospory - které se tvoří pučením, konidie - které vznikají ze základní buňky. Jestliže je hyfa nesoucí konidie odlišná od ostatních hyf, nazývá se konidiofor, který může být jednoduchý, větvený nebo na konci zduřelé ve vezikulu (Šilhánková, 2002). 3.3 Napadení potravin a krmiv plísněmi Na potravinách a potravinářských výrobcích i krmivech se vyskytuje celá řada plísní, která potraviny znehodnocuje jak po stránce senzorické, tak i po stránce nutriční. Při tomto rozkladu se mohou tvořit toxické látky, které způsobují onemocnění lidí a zvířat (Macháček, 2004). Nejčastěji se plísně vyskytují na potravinách a krmivech, jsou-li pro ně vytvářeny optimální podmínky pro růst a rozmnožování (teplota, vlhkost apod.). Plíseň může buď potravinou prorůstat, nebo jí může porůstat. Prvotní porosty jsou nejprve bělavé, 13

vatové, později mění barvu do šedozelené až černé, ale v některých případech se mohou vyskytovat i barvy žluté, oranžové, červené a jiné. Většinou vydávají charakteristický zápach. Pokud se jedná o kapaliny pak plíseň roste buď na povrchu nebo pod hladinou, případně prorůstá chomáčkovitě celou kapalinou (Polster, 1971). 3.4 Onemocnění vyvolané plísněmi 3.4.1 Mykózy Schopnost některých hub vyvolávat u člověka závažnou infekci mykózu patří k nejzávažnějším formám jejich působení na lidské zdraví (Malíř a kol., 2003; Klaban, 2012). Mykózy jsou pravá infekční onemocnění vyvolaná mikroskopickými houbami. Mykotická infekční agens napadala osoby, které měly problémy s imunitním systémem, z důsledku dlouhodobě podávaných antibiotik, chemoterapeutik s imunosupresivními účinky nebo při hormonální léčbě, ozařování apod. Jedná se o dermatomykózy, ale i o mnohem závažnější onemocnění, které může končit smrtí (Paříková a Kučerová, 2001). V součastné době je popsáno asi 250 druhů hub parazitujících člověka. V převážné většině případů za všechny onemocnění odpovídají dermatofyty a několik druhů oportunních původců, především kvasinka Candida albicans a Aspergillus fumigatus. Z epidemiologicko ekologického hlediska lze patogenní houby rozdělit do čtyř skupin: 1. saprotrofické exogenní houby vyvolávají především inhalační a kontaktní infekce (zdrojem infekce je vnější prostředí jako je např. půda, mrtvá organická hmota apod. toto onemocnění se přenáší především vzduchem, 2. saprotrofické endogenní houby (kandidy a jiné kvasinky) onemocnění se nejčastěji projevuje při narušení přirozených bariér, 3. saprotrofické exogenní houby se zvýšeným infekčním potenciálem, které do člověka proniká inhalací nebo traumatickou inokulací (původci subkutánních mykóz), 4. pravé, obligátně parazitické houby antropofilní dermatofyty, které mají vysoký infekční potenciál a napadají i zdravé jedince. První dvě skupiny se řadí mezi oportunní houby, které vyvolávají onemocnění většinou u hostitele s významnou poruchou imunity. Další dvě skupiny jsou primárně parazitické houby, které mají vysoký infekční potenciál, ale stupeň poškození hostitele je malý. Z lékařského hlediska můžeme dělit mykotické infekce na: 14

kožní a slizniční mykózy, endemické mykózy vyvolané dimorfními houbami, oportunní mykózy (Malíř a kol., 2003). 3.4.2 Mykoalergózy Mykoalergie jsou hypersenzitivní reakce imunitního systému hostitele na antigenní stimulaci houbovým alergenem. Převážně se jedná o alergeny přítomné na sporách. Po chemické stránce je většina mykoalergenů tvořena proteiny, glykoproteiny nebo polysacharidy (Klaban, 2012). Mykoalergózy se mohou projevovat jako přecitlivělost na spory plísní nebo i na jejich metabolické produkty (Paříková a Kučerová, 2001). Plísně produkují značné množství spor, které se uvolňují do ovzduší a u citlivých osob vzniká vůči antigenům mikromycetů alergie při níž dochází k podráždění spojivek, dýchacích cest, vznikají alergická respirační onemocnění a bronchitidy (Babáková, 2010). Účinek plísní jako alergenů závisí na počtu jejich částic ve vzduchu, na koncentraci těkavých látek, délce pobytu člověka v kontaminovaném prostředí nebo na dispozici člověka a jeho imunitního systému. Podle způsobu vstupu alergenů do organismu rozlišujeme: alergie inhalační (dýchacími orgány), alergie kontaktní (dotykem kůže), alergie potravinové (vstup zažívacím traktem), (Paříková a Kučerová, 2001). Za nejvýznamnější a nejfrekventovanější alergeny můžeme považovat plísně následujících druhů: Alternaria, Cladosporium, Botrytis, Aspergillus, Penicillium, Mucor (Klaban, 2012). Plísně patří mezi tři nejčastěji se vyskytující alergeny a jsou na třetím místě za plyny a roztoči (Malíř a kol., 2003). 3.5 Nejdůležitější rody toxinogenních plísní Mezi nejdůležitější rody, jejichž druhy produkují mykotoxiny, patří rody Aspergillus, Fusarium, Penicillium. 15

3.5.1 Rod Aspergillus Aspergillus je anamorfní rod oddělení Ascomycota, řádu Eurotiales a čeledi Trichocomaceae. Jedná se o fylogeneticky starý rod a v současné době obsahuje více než 221 druhů. Pohlavní stádia jsou vřeckaté houby, které vytvářejí plodničky menší než 1 mm (Šilhánková, 2002). Nepohlavní rozmnožovací struktury rodu Aspergillus jsou tvořeny konidioforem, který je hlavicově zakončen. Konidiofor je vlákenko, které může vyrůstat buď přímo ze substrátu mycelia nebo ze vzdušných hyf, je hyalinní, žlutě nebo až hnědě zbarvený, se stěnou hladkou, bradavčitou, zdrsnělou, nebo ostnitou. Na vrcholu se konidiofor pomalu nebo náhle rozšiřuje v měchýřek kulovitého, polokulovitého, elipsoidního nebo palicovitého tvaru. Na části nebo po celém povrchu měchýřku vyrůstají fialidy (konidiogenní buňky), které jsou rozmístěny v jedné řadě, ve dvou řadách nebo nad sebou. Fialidy jsou lahvicovitého tvaru na vrcholu zúženy v krátký konidiogenní krček, kterým vypučí tvořící se mladé konidie v bazipetálních řetězcích. Konidie mohou být kulovité, elipsoidní, oválné nebo hruškovité a na povrchu jsou buď hladké, zdrsnělé nebo ostnité. Velmi často jsou mezi sebou spojeny plazmatickými můstky konektivy (Malíř a kol., 2003). Rod Aspergillus je vybaven bohatým enzymatickým systémem, např. amylolytickými, pektolytickými a proteolytickými enzymy a je schopen snášet nízkou aktivitu vody. Tyto vlastnosti mu dovolují přežívat na rozmanitých biologických materiálech, kde je představen jako významný původce kažení krmiv a potravin. Této vlastnosti je využíváno pro průmyslovou přípravu těchto enzymů, které se používají v potravinářském průmyslu, např. amylolytické a proteolytické enzymy se používají v pivovarství, pektolytické enzymy v konzervárenství. Některé druhy rodu Aspergillus jsou využívány pro výrobu organických kyselin, jako je např. Aspergillus niger pro výrobu kyseliny citronové. Aspergily jsou značně toxické a i přesto, jsou schopny produkovat antibiotika, ale dosud nenašly lékařské uplatnění (Šilhánková, 2002). Nejvýznamnější zástupci rodu Aspergillus: Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus. Aspergilus niger Aspergilus niger (Obrázek 4) je jedním z nejrozšířenějších a snadno identifikovatelných druhů této skupiny, které jsou velmi bohatě vybaveny enzymy a jejich konidie jsou svým černým barvivem chráněny proti nepříznivým účinkům slunečního záření (Šilhánková, 2002). Vyskytuje se celosvětově, ale především v teplejších oblastech na rozmanitých potravinách, jak rostlinného původu, tak i živočišného původu. Několik let byl považován za netoxinogenní, ale v 90. letech byla u několika kmenů proká- 16

zaná produkce mykotoxinu (ochratoxin A). Často se vyskytuje v potravinách, jako např. obiloviny, kukuřice, sójové boby, ořechy, ryby, luštěniny. Jeho teplotní nároky na růst jsou okolo 35-37 C, minimum 6-8 C, maximum 45-47 C (Kubátová, 2009). Aspergillus flavus Obrázek 4: Aspergilus niger (Kubátová, 2009) Aspergillus flavus (Obrázek 5) je druh s celosvětovým výskytem převážně však v subtropických a tropických oblastech, běžně se vyskytuje jako saprofyt na různých substrátech rostlinného původu a v půdě, které tvoří žlutozelené konidie ( www.mycology.adelaide.edu.au.,2012 ). Aspergillus flavus produkuje velmi účinné toxiny, z nichž nejznámější jsou aflatoxiny, které způsobují rakovinu jater a mají mutagenní účinek. Často se vyskytuje v burských oříškách a cereáliích dále je kontaminantem mnoha dalších potravin, např. obilovin a výrobcích z obilovin, kukuřici, ovoce, exotické koření apod. Produkuje hepatotoxické a karcinogenní aflatoxiny B a kyselinu cyklopiazonovou. Patří mezi oportunní patogeny, které způsobují mykózu zvanou Aspergilóza (aspergilóza průdušek). Jeho optimální teploty pro růst a rozmnožování jsou okolo 33 C, ale může růst i v rozmezí teplot od 10-12 do 43-48 C (Kubátová, 2009). Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus (Obrázek 6) se vyskytuje se po celém světě, ale hojněji však v teplejších oblastech, na rozmanitých plodinách, kde tvoří velké množství zelených spor. A.fumigatus je producentem mykotoxinů (fumitremoriny, verruculogen a gliotoxin). Je důležitým lidským oportunním patogenem způsobující onemocnění plic u imunodeficitních pacientů, u ptáků i jiných dalších živočichů. Optimální teploty jsou okolo 40-42 C, může růst i v rozmezí teplot od 12 do 55 C (Kubátová, 2009). 17

Obrázek 5: Aspergilus flavus (Kubátová, 2009) Obrázek 6: Aspergillus fumigatus (Kubátová, 2009) 18

3.5.2 Rod Penicillium Rod Penicillium zahrnuje asi 220 druhů, převážně se jedná o imperfektní stádia rodů Eupenicillium a Talaromyces, které vytvářejí pohlavní askospory a jsou řazeny do třídy Ascomycetes (Malíř a kol., 2003). Plísně tohoto rodu se vyskytují ve formě optovaného nepigmentovavného mycelia. Nepohlavní rozmnožovací orgány jsou rovněž tvořeny konidioforem, který je na konci větvený v metuly a na ni přisedají fialidy. Z fialid se odškrcují řetízky konidií zelenošedé až modré barvy (Fassatiová, 1979). Růst Penicilií je podobný jako u aspergilů velmi rychlý a identifikace jednotlivých druhů je kvůli jejich značné variabilitě často obtížná. Penicilia se vyskytují v půdě, na povrchu živých i odumřelých organismů nebo ve vodě. Jejich spory se nacházejí v ovzduší a zachycují se na nejrůznějších substrátech, kde dokážou vyklíčit i při minimálních požadavcích na živiny. Rod Penicillium se vyskytuje a způsobuje kažení na všech potravinách, zejména pak na pečivu, zelenině a ovoci. Některé rody jsou schopny u citlivějších jedinců vyvolávat alergické reakce nebo můžou produkovat mykotoxiny, a to i u zástupců, které se používají v potravinářském průmyslu (Fassatiová, 1979), např. Penicillium roqueforti (Obrázek 7), který se používá pro výrobu sýrů typu Roquefort, může se však vyskytnout jako kontaminant jiných potravin nebo krmiv. V čisté kultuře je schopen P.roqueforti produkovat toxin, ale na sýrech je jeho produkce velmi slabá a látka se rozkládá (Kubátová, 2009). Obrázek 7: Penicillium roqueforti (Kubátová, 2009) Dříve byl celý rod považován za nepatogenní pro člověka. Nedávné výzkumy, ale prokázaly, že jihoasijský druh Penicillium marneffei, jehož rezervoárem jsou bambusové krysy Rhizomys pruinosus a Rhizomys sinensis vyskytující se v Laosu, Thajsku, Vietnamu a jižní Číně je schopen vyvolat infekci u člověka. Tento druh může v oblastech jižní Asie vyvolávat disseminované infekce u lidí s pohlavní nemocí AIDS, které 19

postihují hlavně plíce, játra a kůži. Kromě zmíněného druhu existuje řada dalších druhů, např. Penicillium islandicum, Penicillium expansum, které mohou způsobovat lidské infekce např. opakované nálezy Penicillium expansum, Penicillium islandicum a dalších druhů v materiálu z onychomykóz a dermatomykóz (Votava, 2003). 3.5.3 Rod Fusarium Zástupci rodu Fusarium jsou považovány za součást ekosystému, kde se podílí na rozkladu organické hmoty. Řada druhů se během evoluce přizpůsobila k parazitismu rostlin, ale za určitých podmínek může být patogenní jak pro člověka tak i živočichy. Rod Fusarium patří k významným toxinogenním polním mikromycetům (Malíř a kol., 2003). Rod Fusarium je velice rozsáhlý a v přírodě velmi rozšířený. Plísně rodu Fusarium se vyznačují bohatým septovaným myceliem (žlutým, růžovým, šedým, červeným, hnědým, fialovým), na kterém jsou tvořeny dva druhy konidií: mikrokonidie: jednobuněčné, elipsoidní, oválné nebo široce vejčité. Mohou být uspořádány v řetízcích nebo nepravých paličkách, které vznikají shlukem lepkavých spor, makrokonidie: dvoubuněčné až vícebuněčné, mají typický charakteristický rohlíčkovitý nebo srpovitý tvar. U velkého množství druhů se vyskytují mikrokonidie a makrokonidie součastně. Některé druhy mikrokonidie nevytvářejí vůbec, naopak jiné druhy mohou produkovat jenom mikrokonidie bez makrokonidií. Některé druhy tvoří ještě chlamydospory (zduřelé buňky se silnou stěnou), nacházející se uprostřed hyf, případně i v makrokonidiích. Jsou různého tvaru i velikosti, o různém počtu buněk, často se zabarvenou stěnou se strukturou bradavičnatou (Šilhánková, 2002). Vláknité mikroskopické houby rodu Fusarium jsou široce rozšířeny a vyskytují se ve vodě, v půdě a ve vzduchu. Jsou to parazité rostlin a kontaminují zejména obiloviny - pšenice, žito, ječmen, oves (Betina, 1990). Napadení obilí fuzárií během vlhkého léta vede k velkým národohospodářským ztrátám, jelikož obilí, které bylo kontaminováno mykotoxiny, nemůže být použito ani pro krmné účely (Nedělník a kol., 2003). Plísně rodu Fusarium může dále způsobovat kažení jablek, rajčat nebo brambor. Některé druhy mají schopnost produkovat mykotoxiny v obilí. Pokud se tyto mykotoxiny dostanou do potravního řetězce, mohou ovlivnit lidské zdraví a zdraví zvířat (Šilhánková, 2002). Mezi nejznámější toxiny produkované rodem Fusarium patří skupina trichothecenových mykotoxinů, jako jsou deoxynivalenol, moniliformin, T2-toxin, zearalenon (Šimůnek, 2004). 20

Fusarium culmorum Fusarium culmorum (Obrázek 8) je rozšířen především v půdě a na cereáliích. Způsobuje krčové i kořenové hniloby u obilovin a napadá i uskladněné brambory a cukrovou řepu. Optimální podmínky pro jeho růst a rozmnožování jsou 25 C. Produkuje řadu mykotoxinů zejména trichoteceny a zearalenony (Kubátová, 2009). Obrázek 8: Fusarium culmorum (Kubátová, 2009) 21

4 Mykotoxiny Mykotoxiny jsou sekundární metabolity vláknitých mikromycetů, které patří mezi toxiny přírodního původu. Jsou nebílkovinné povahy, toxické nejen pro člověka, ale i pro živé organismy (Malíř a kol., 2003; Komprda, 2004). Mykotoxiny jsou chemicky velmi různorodé sloučeniny produkované toxinokogenními mikromycetami. Ne všechny kmeny mikromycetů jsou toxinogenní. Důvod, proč jsou mykotoxiny produkovány je vysvětlován tím, že slouží plísním jako prostředek v boji o potravu a v boji o přežití. Mykotoxiny nejsou nezbytné při rozvoji a rozmnožování vláknitých mikromycetů ve srovnání s primárními metabolity (nukleové kyseliny, aminokyseliny, proteiny, mastné kyseliny, sacharidy), (Malíř a kol., 2003). V součastné době je známo přes 400 mykotoxinů (Ostrý, 2011). I nadále jsou objevovány a chemicky charakterizovány nové mykotoxiny (Malíř a kol., 2003). Pravidla pro produkci mykotoxinů v potravinách dle Betiny přítomnost samotné houby ještě není důkazem, že produkovala toxin, příslušný toxin mohou produkovat rozdílné rody hub, houba může produkovat více jak jeden toxin, příslušný toxin může v potravinách nebo v krmivech přetrvávat, ačkoli se zde toxinogenní houba už nevyskytuje. Mykotoxiny vykazují celou řadu významných toxických účinků, které hrají úlohu v patogenezi akutních a chronických alimentárních otrav člověka mykotoxikóz (Ostrý, 2011). Mykotoxiny kontaminují potraviny rostlinného i živočišného původu a následně ohrožují lidské zdraví (LI, 2012). Do potravin se dostávají cestou z kontaminovaných krmiv přes organismus hospodářských zvířat (Ostrý, 2000). Z tohoto důvodu je přítomnost porostu plísní na potravinách spojena s rizikem kontaminace potraviny nežádoucí látkou. Odstranění již naprodukovaných mykotoxinů z potraviny je téměř nemožné, ale z některých krmiv lze mykotoxiny odstranit, např. vymýváním kapalným čpavkem, kyselinou octovou nebo kapalným oxidem uhličitým. Vedlejšími nežádoucími účinky je senzorické znehodnocení a snížení nutriční hodnoty potravin (Šimůnek, 2004). 4.1 Klasifikace Mykotoxiny představují pestrou skupinu sloučenin. Jejich relativní molekulová hmotnost běžně nepřesahuje 1000 Da. Stejně tak jako ostatní sekundární metabolity, nelze mykotoxiny jednoduše klasifikovat do jednotlivých skupin sloučenin pouze na základě chemické struktury bez ohledu na jejich výskyt, producenty či 22

charakteru a intenzity vyvolaných toxických účinků. Produkce mykotoxinu toxinogenními kmeny je ovlivněna řadou faktorů a za správných podmínek k ní nemusí docházet. Ne všechny kmeny toxinogenních mikromycet jsou toxinogenní (Velíšek, 2002). Mykotoxiny lze členit podle velkého množství kritérií. Nejjednodušší členění mykotoxinů je podle chemické struktury. Jehož výhodou je snadné a jednoznačné zařazení látky o známé chemické struktuře. Mykotoxiny můžeme dále členit podle toxicity a jejich toxických účinků k cílovým orgánům (Šimůnek, 2004). Tabulka 1: Dělení mykotoxinů dle chemické struktury Skupina Furanorurany Substituované pyreny a hydroxypyreny Substituované chinony Nenasycené laktony Griseofulviny Epoxytrichotheceny Polycyklické substituované indolové deriváty Cyklické dipeptidy Mykotoxiny jiné struktury Mykotoxin Aflatoxiny, sterigmatocystin,versicolorin Kyselina koji, sekalonové kyseliny Luteoskyrin, rubratoxin Patulin, kyselina penicillová, kyselina mykofenolová, ochratoxiny, rubratoxin B Griseofulvin T-2 toxin, fusarenony, satratoxiny Kyselina cyklopiazonová, paspaliny, penitremy Gliotoxin, sporidesminy, roquefortin, fumitremorgen Zearalenon, curvularin, citrinin Tabulka 2: Dělení mykotoxinů podle jejich toxicity Toxicita Mykotoxin Silně toxické Aflatoxin, citreoviridin, cyklochlorotin, ochratoxin A, patulin, T-2 toxin Středně toxické Citrinin, kyselina cyklopiazonová, kyselina penicilová Slabě toxické Griseofulvin, kyselina koji, zearalenon 4.2 Mykotoxikózy Mykotoxikózy jsou onemocnění vyvolaná sekundárními metabolity, toxickými látkami, které plísně produkují přímo do substrátu, na němž rostou. Jedná se o mykotoxiny v napadených potravinách, zemědělských produktech a krmivech. Mykotoxiny způsobují závažná onemocnění, která jsou závislá na množství mykotoxinu v organismu (Paříková a Kučerová, 2001). Mykotoxiny, které způsobují závažná onemocnění u lidí i zvířat jsou zejména aflatoxiny, fumonisiny, vomitoxin, zearalenon 23

Tabulka 3: Dělení mykotoxinů podle toxických účinků k cílovým orgánům Toxický účinek Dermatotoxiny Estrogeny Genotoxiny Hematotoxiny Hepatotoxiny Imunotoxiny Neurotoxiny Neurotoxiny Toxiny gastrointestinálního traktu Mykotoxiny Trichoteceny, psoraleny, verukariny Zearalenon Aflatoxiny, ochratoxin A, citrinin, zearalenon, patulin, trichoteceny, fumonisiny, fusarin C Aflatoxiny, ochratoxin A, zearalenon, trichoteceny Aflatoxiny, luteoskyrin, sterigmatocystin Aflatoxiny, ochratoxin A, trichoteceny, patulin, gliotoxin Citrinin, ochratoxin A Penitrem A, verukulogeny, fumonisiny Trichoteceny a T-2 toxin (Vondrášková, 2011). K nejstarším zjištěným mykotoxikózám patří ergotismus, alimentární toxická aleukie, akutní kardiální beri-beri (Ostrý, 2011). Onemocnění člověka vyvolaná mykotoxiny: jistě prokázaná, ergotismus, akutní kardiální beri-beri, alimentární toxická aleukie, multifaktoriální, kde je mykotoxin jedním z činitelů, toxická hepatitida, primární hepatom, karcinom jícnu, pulmonální mykotoxikóza, reyův syndrom, nedostatečně prokázaná, kardiomyopatie kobaltového piva, pelagra, 24

balkánská endemická nefropatie, onyalai (Šimůnek, 2004). 4.3 Významné mykotoxikózy 4.3.1 Ergotismus Ergotismus je onemocnění, které způsobují námelové alkaloidy. Je to otrava toxiny plísně paličkovice nachové. Patří mezi první zjištěné mykotoxikózy u člověka, spojené s požíváním potravin z obilnin (žita) a rýže kontaminovanými tvrdými černými nebo temně fialovými sklerocii (námelem) polní mikroskopické houby rodu Claviceps purpurea (Malíř a kol., 2003). Toto onemocnění bylo rozpoznáno v minulém století. V současné době se v Evropě vyskytují pouze náhodné otravy. Větší výskyt je v rozvojových zemích (Etiopie), (Šimůnek, 2004). Ergotismus se může rozvíjet ve dvou formách, a to: gangrenózní, konvulzivní. Ke vzniku gangrenózní formy vedou toxické námelové alkaloidy ergotismus a ergocristin (Malíř a kol., 2003). U gangrenózní formy dominují spasmy drobných cév, vyvolané při opakovaném působení toxinů. Při požívání větších dávek dochází k odumření akrálních částí těla (ušní boltce, brady, nos, rty, prsty aj.),(šimůnek, 2004). První příznaky této nemoci se projevují edémem končetin, parestéziemi a končí gangrénou. Konvulzivní forma je vyvolána námelovými alkaloidy produkovanými mikromycety Claviceps fusiformis (Malíř a kol., 2003). U této formy se vyskytují zejména tělové a sluchové halucinace (Šimůnek, 2004). Intoxikace byla provázena nejprve závratěmi, zvracením, po kterých následovaly neurologické příznaky např. ospalost, slepota, paralýza (Malíř a kol., 2003). 4.3.2 Alimentární toxická aleukie Alimentární toxická aleukie je onemocnění způsobené konzumací prosa a ječmene kontaminované mikroskopickými houbami rodu Fusarium (Fusarium poae a Fusarium sporotrichoides), (Malíř a kol., 2003). Napadení obilí toxinem T-2 bylo v důsledku ponechání obilí na poli pod sněhem a sklízelo se až z jara. Pod sněhem bylo napadeno chladnomilnými fusariemi a z hlediska nedostatku potravy následně konzumováno (Šimůnek, 2004). 25

Onemocnění probíhá ve třech fázích: první fáze: dochází k prudkému nástupu na bráně vstupu. Jedná se o trávicí ústrojí - zvracení, záněty sliznice, průjmy mohou být i krvavé. T-2 toxin však do organismu proniká i skrze neporušenou pokožku, druhá fáze: dostavuje se zdánlivá úleva, doprovázena poklesem počtu krevních destiček a bílých krvinek, třetí fáze: v této fázi jsou nemocní postiženi jednak bakteriálními infekcemi, a to pro normálního člověka neškodnou flórou, jednak krvácením (může dojít i k vykrvácení žen během menstruace). Postiženy bývají i krční mandle (Šimůnek, 2004). V současné době se se zlepšením podmínek sklizně obilovin tato choroba zcela vymizela (Malíř a kol., 2003). 4.3.3 Akutní kardiální beri-beri Akutní kardiální beri-beri je onemocnění ze žluté rýže, které vzniká po konzumaci kontaminované rýže mykotoxiny. Jedná se o mykotoxiny např. luteoskyrin, citrinin, islandotoxin, rugulosin, citreoviridin, cyclochlorotin tyto mykotoxiny jsou produkovány toxinogenními mikromycety (např. Penicillium islandicum, Penicillium citrinum, Penicillinum citreoviride), které jsou kontaminanty rýže. Hlavní příznaky vyvolané Penicillium citreoviride je ochrnutí končetin (Malíř a kol., 2003). Dalšími příznaky jsou křeče a vzestupná paralýza. Srdce může mít výraznou poruchu rytmu tzv. Wenckebachovy periody, kdy dochází k zástavě srdce a následné smrti (Šimůnek, 2004). 4.4 Výskyt mykotoxinů v krmivech a jejich vliv na potravinové suroviny Kontaminace krmiv mykotoxiny není rovnoměrná, ale velmi heterogenní z hlediska v závislosti na podmínkách skladování. Účinek více mykotoxinů přítomných v krmivu může být odlišný od účinku stejného typu mykotoxinu, který je přítomen v krmivu samostatně (Doležal a kol., 2009). Zkrmování kontaminovaných krmiv hospodářskými zvířaty, může mít za následek výskyt mykotoxinů v potravinách živočišného původu (mléko a mléčné výrobky, maso a masné výrobky), (Velíšek, 2002). Působení mykotoxinů má tak silný kumulativní účinek na pěstování krmiv, že jejich efekt je zvyšován řadou zátěžových a stresových situací jako je, např. střídání teplot během dne a noci, nedostatečná aplikace fungicidů již na poli, pravidelné vysévání stejné plodiny (pšenice, kukuřice) na jeden pozemek, čímž dochází k akumulaci spor 26

v půdě s následným oslabením rostliny (Zeman a kol., 2006). V našich klimatických podmínkách je produkce mykotoxinů spojena s výskytem polních plísní (Fusarium, Alternaria), tedy dalším faktorem pro výskyt mykotoxinů je počasí během vegetačního období a sklizně. Některé mykotoxiny (ochratoxin, patulin) vznikjí i během skladování krmiv (Velíšek, 2002). Produkce toxinů v krmivech je ovlivněna různými faktory: fyzikálními: teplota, vlhkost prostředí, vlhkost vlastního substrátu, složení substrátu, dostupnost kyslíku a živin, způsob sklizně a skladování, mechanické poškození povrchového obalu (tkáně), výskyt polních plísní apod., chemickými: složení sušiny krmiva, přítomnost fungicidních baktericidních látek, hodnota ph, přítomnost mikroprvků, aktivace konzervačních prostředků, podíl a složení epifytní mikroflóry apod., biologickými: vlastnostmi kmene a druhové příslušnosti plísní, toxinogenní vlastnosti, konkurenčními vztahy plísní a bakterií (Zeman a kol., 2006). Tvorba a výskyt mykotoxinů v krmivech je celosvětovým problémem ve všech geografických oblastech a podle odhadů FAO je mykotoxiny kontaminováno až 25% konzumovaných potravin (Velíšek, 2002). V drůbežářském průmyslu jsou mykotoxiny v krmivech považovány za druhý nejzávažnější problémem. Existuje celá řada mykotoxinů, včetně ochratoxinu, který je známý jako neurotoxin a poškozuje ledvinové tkáně nebo aflatoxin, který má nepříznivé účinky na játra (Abidin a kol., 2011). Účinky toxinů mikroskopických hub se mohou projevovat v postižení různých tkání, funkcí organismu u lidí i zvířat a to zejména na: poškození parenchymatózních orgánů (játra, ledviny), snížení srážlivosti krve, poškození centrálního nervového systému, oslabení imunitního systému, akutní nebo chronické změny, mutagenní, teratogenní a karcinogenní účinky. Působení mykotoxinů resp. aflatoxinů na zvířata je rozdílná vůči pohlaví, věku, fyziologickému stavu zvířat. Z hospodářských zvířat jsou na reakci všech druhů mykotoxinů nejvnímavější prasata, z hrabavé drůbeže křepelky a z vodní drůbeže kachny. U skotu je méně literárních zdrojů o intoxikaci, neboť díky pufrovací schopnosti a aktivitě mikroflóry dokážou redukovat a tolerovat i vyšší množství mykotoxinů 27

převážně zearalenonu a ochratoxinu. Aflatoxiny snižují v bachoru produkci těkavých mastných kyselin, a tím negativně ovlivňují produkci mléka. U telat může docházet k anorexii, průjmům a tím pádem k pomalému růstu (Doležal a kol., 2009). V chovech prasat bývají častou komplikací zaplísněných krmiv výhřezy konečníků, snížené přírůstky a snížený příjem krmiva (Babáková, 2010). Schéma (Příloha A) znázorňuje průnik mykotoxinů do potravního řetězce člověka i hospodářských zvířat a následný výskyt v potravinách a krmivech (Velíšek, 2002). 4.5 Producenti mykotoxinů Potraviny rostlinného a živočišného původu jsou vynikajícím substrátem pro růst a množení toxinogenních vláknitých mikromycetů a následné produkci mykotoxinů. V potravinách živočišného původu se dále vyskytují rezidua mykotoxinů, které se z kontaminovaného krmiva dostávají do organismu hospodářských zvířat (Malíř a kol., 2003). V potravinách bylo popsáno více jak 70 druhů toxinogenních plísní producentů mykotoxinů. V tabulce (Příloha B) jsou uvedeny významní producenti mykotoxinů v potravinových surovinách a potravinách(malíř a kol., 2003; Ostrý, 2011). V posledních letech dochází z hlediska výzkumu v oblasti producentů mykotoxinů k zajímavým a nečekaným zjištěním, která byla nezávisle konfirmována. Byl izolován např. kmen Aspergillus niger, který produkuje fumonisin B2 a kmen Fusarium kyushuense, který produkuje aflatoxin B1 a G5. Tato zjištění mění dosavadní pohled na toxinogenní plísně producenty mykotoxinů. (Ostrý, 2011) 4.6 Faktory ovlivňující produkci mykotoxinů v potravinách Při pěstování kulturních plodin vzniká celá řada složitých vztahů a interakcí mezi rostlinou, hmyzem, mikroskopickými houbami a způsobem ošetřování rostlin. Tyto interakce poté ovlivňují produkci a obsah mykotoxinů v potravinových surovinách. Produkci mykotoxinů můžeme ovlivnit vhodným výběrem odrůdy a vhodným agrotechnickým opatřením. V tomto případě se dá předpokládat, že potravinová surovina bude zdravotně nezávadná z hlediska obsahu fytoalexinů a mykotoxinů. Pokud dojde k selhání obranných mechanismů rostliny a agrotechnická opatření nebudou dostatečná, potravinová surovina bude posouzena jako zdravotně závadná a s pravděpodobností bude obsahovat mykotoxiny a fytoalexiny (Malíř a kol., 2003). Tvorba mykotoxinů je závislá vedle druhu mikroskopické houby na fyzikálních, chemických a biologických podmínkách růstu. Mykotoxiny nejsou přímo produkty genové, ale jsou to sekundární metabolity, jejichž tvorba je závislá na enzymatických aktivitách v buňce. Z hlediska druhových podmínek toxinogenity jde o schopnost houby produkovat ty enzymy, které se podílejí na přeměně prekursoru přes mezi- 28

produkty na mykotoxin (Šimůnek, 2004). K růstu toxinogenních mikromycetů a následné tvorbě mykotoxinů může docházet na poli, před sklizní, během sklizně, během přepravy nebo i při uskladnění a to konkrétně na potravinách jako jsou olejniny, cereálie, ovoce, zelenina (Velíšek a Hajšlová, 2009). Obsah mykotoxinů pak záleží na následujících faktorech: vlhkosti, teplotě, poškození obalu zrna, přítomnosti kyslíku, délce skladování, oxidu uhličitého, složení substrátu, sporulaci, mykologickém profilu toxinogenních vláknitých mikromycetů, mikrobiálních interakcích a přítomnosti hmyzu. Mezi nejdůležitější fyzikální vlastnosti ovlivňující produkci mykotoxinů patří teplota (Malíř a kol., 2003). 4.6.1 Teplota Existuje určité teplotní rozmezí, uvnitř kterého mohou být mykotoxiny vytvářeny, přičemž od optima směrem k limitům klesá množství produkovaného toxinu i procento kmenů schopných produkovat identifikovatelné množství mykotoxinu (Šimůnek, 2004). Optimální teplota pro růst plísní zahrnuje široké rozmezí v souvislosti s druhem plísně (18-28 C), některé dokáží růst i při -10 C nebo 60 C (Chlupáčová, 2002). Např. Fusarium sporotrichiella a Cladosporium fagi rostou a tvoří toxiny při teplotě -5 C. U většiny saprofytických plísní je vysoká vlhkost (60-90%) a vyšší teplota (25-35 C) optimálními podmínkami pro jejich růst a rozmnožování, mnohdy i tvorbu mykotoxinu. U kmenů Aspergillus flavus se neprokázala produkce aflatoxinů při teplotě nižší než 16 C. Teplejší klima je příznivější pro produkci aflatoxinu a fumonisinů, v chladnějším pásmu převládá produkce ochratoxinu, vomitoxin a zearalenon (Zeman a kol., 2006). 4.6.2 Vlhkost Rozlišujeme polní vláknité mikromycety, které se rozrůstají na různých rozkládajících se substrátech a vyžadují vysokou relativní vlhkost (20-25%), zatímco skladištní vláknité mikromycety jsou schopny růst na substrátech s nižší relativní vlhkostí (10-18%). Proto se zde sleduje vodní aktivita a w 1. Tento faktor se počítá z rovnováhy vody mezi substrátem a okolním vzduchem při dané teplotě. Růst všech mikroorganismů je charakterizován vodní aktivitou a w : minimální, 1 Aktivita vody - vyjadřuje osmotickou sílu vody přítomné v potravině, která je dostupná a využitelná mikroorganismům. Čím nižší je aktivita vody, tím hůře se mohou mikroorganismy rozmnožovat a negativně potravinu ovlivňovat. 29

optimální, maximální. Pro většinu vláknitých mikromycetů je minimální vodní aktivita a w, kontaminující cereálie 0,7. Například Aspergillus flavus nebo Penicillium restrictum jsou schopny růst při a w nižší jak 0,75 při 25 C, stejně tak dokážou růst i ostatní vláknité mikromycety jako Aspergillus halophilicus, A.glaucus, A.restrictus, které se nacházejí v suchém ovoci, zavařeninách, sušeném mléce a cereálních výrobcích. Například optimální podmínky pro růst Aspergillus flavus a Aspergillus parasiticus je aktivita vody a w 0,95 a teplota asi 36 C, zatímco aflatoxiny jsou produkovány při teplotě 33 C a a w 0,99 (Malíř a kol., 2003). 4.6.3 Přítomnost kyslíku Většina vláknitých mikromycetů potřebuje pro svůj růst a rozmnožování aerobní podmínky. Nejvíce kyslíku pro svůj růst vyžadují vláknité mikromycety, které kontaminují povrch substrátu. Vláknité mikromycety s nižšími nároky na kyslík se vyskytují v hloubce substrátu. Některé mikromycety jsou schopny se rozvíjet a množit v anaerobním prostředí (např. Byssochlamys, které produkují termostabilní askospóry), (Malíř a kol., 2003). 4.6.4 Hmyz Působení hmyzu hraje úlohu především v zemích s tropickým klimatem a rovněž při kontaminaci na poli než během uskladnění. Hmyz a roztoči jsou přenašeči spor vláknitých mikromycetů, které se ukládají na povrchu substrátu v místě poškození. Např. cereálie jsou daleko více náchylné ke kontaminaci mykotoxiny a mikromycety v místech zamořených hmyzem. Hmyz poškozuje obal zrna, což usnadňuje penetraci inokula dovnitř zrna. Důležitou roli při poškození kukuřice hrají larvy masařek, hmyz, brouci, chrousti. Kontaminace podzemnice olejné a kukuřice vláknitými mikromycety Aspergillus flavus nebo aflatoxiny je před sklizní často ovlivněna nálety hmyzu. Během uskladnění zrna může docházet k sekundární kontaminaci toxinogenními mikromycety s následnou produkcí mykotoxinů (aflatoxin B1, ochratoxin A nebo citrinin na kukuřici a ječmeni), (Malíř a kol., 2003). 4.6.5 Substrát Vláknité mikromycety nejsou schopny rozvíjet se se stejnou intenzitou na jakémkoliv substrátu. 30

Kvalitativní a kvantitativní složení určitých živin, zvláště cukrů významně ovlivňuje kontaminaci substrátu aflatoxiny. Aflatoxiny kontaminují zejména ořechy (mandle, pistácie) a cereálie. Ochratoxin A produkovaný Aspergillius ochraceus nejčastěji kontaminuje arašídy a sóju. Substrátová specificita vychází z rozdílných fyzikálních a chemických vlastností (vodní aktivita, teplotní vodivost, obsah AMK, lipidů, proteinů, mastných kyselin a minerálů), (Malíř a kol., 2003). Tabulka 4: Významní producenti mykotoxinů v potravinách a potravinových surovinách Mykotoxiny Vláknité mikromycety Aspergillus flavus, A.parasiticus Druh substrátu Podporující podmínky Aflatoxiny Arašídy,bavlna,cereálie, vlhké teplo, tropické olejniny, sušené ovoce oblasti, přehřátí při uložení Zearalenon Fusarium Kukuřice, čirok mírné klima, opožděná sklizeň, rychlé uskladnění Deoxynivalenol Fusarium Kukuřice, cereálie mírné podnebí, rychlé uskladnění Trichoteceny (jiné než DON) Fumonisiny Ochratoxin A Patulin Fusarium Kukuřice, cereálie mírné podnebí, rychlé uskladnění Fusarium moniliforme Kukuřice mírné podnebí, rychlé uskladnění Aspergillus Káva, ječmen, oves, vlhkost při uskladnění, ochraceus, žito, pšenice studené a vlhké Penicillium klima viridicatum Penicillium expansum Jablka,kompoty, džusy, siláže makroskopické poškození plodu, nedostatek anaerobiózy 4.7 Přehled a charakteristika nejvýznamnějších mykotoxinů 4.7.1 Ochratoxiny Byly objeveny víceméně náhodou díky laboratornímu screeningu toxinogenních kmenů mikromycet, izolovaných v Jižní Africe (Aspergillus ochraceus aj.). Do této skupiny je zařazen ochratoxin A, 4 - hydroxyochratoxin A, ochratoxin α (Votava, 2003). Celkem existuje asi sedm různých ochratoxinů, z nichž nejtoxičtější a nejznámější je Ochratoxin A. Hlavním produkčním organismem je Aspergillus ochraceum, dále pak A.alliaceus, A. ostianus, A. mellus a další plísně tohoto rodu (Kos a Krska, 2012). 31

Ochratoxin A může být také produkován rodem Penicillum zejména Penicillium viridicatum, P.cyclopium, P. variable, který kontaminují potraviny i krmivo pro hospodářská zvířata (Tománková a kol., 2006). Ochratoxin A (Obrázek 9) se vyskytuje v celé řadě komodit jak rostlinného, tak živočišného původu. Tento mykotoxin byl objeven v kukuřici, cereáliích, vepřovém masu, kakau, sójových bobech, ovsu, ječmeni, citrusových plodech, kávě a podzemnici olejné. Ochratoxin A má silné nefrotixické a hepatotoxické účinky, ale vykazuje i imunosupresivní, cytotoxický a karcinogenní účinky (Vlková a kol., 2009). U člověka byly nálezy ochratoxinu A v krvi a v tkáních. V krvi je ochratoxin A velmi silně vázán, až z 95% na plazmatické proteiny konkrétně na albumin, kde hraje významnou úlohu v organismu a podílí se na toxicitě Ochratoxinu A (Malíř a kol., 2003). Limit toxicity pro Ochratoxin A je 1 ppm. Tak jako ostatní mykotoxiny je vysoce termostabilní a není možné ho zničit pouhým varem (Vlková a kol., 2009). Obrázek 9: Ochratoxin A (Kos a Krska, 2012) 4.7.2 Patulin Mykotoxin Patulin (Obrázek 10) byl poprvé objeven během výzkumu nových antibiotik v roce 1941 při pokusech na laboratorních zvířatech, ale při dalších výzkumech byly zjištěny vedle antibiotických účinků i toxické účinky, proto byl původně popsán jako antibiotikum účinné na grampozitivní a gramnegativní bakterie i na Mycobacterium tuberculosis. Patulin má baktericidní, bakteriostatické a antifugální účinky a je velmi toxický pro rostlinné i živočišné buňky. Vykazuje mutagenní, karcinogenní a teratogenní aktivitu a způsobuje poškození gastrointestinálního traktu, zejména žaludeční sliznice (distenze, hyperemie, hemoragie, edém), (Malíř a kol., 2003; Betina, 1990). Při produkci patulinu se uplatňují především čtyři rody: Penicillium, Aspergillus, Paecilomyces a Byssochlamys. Mezi nejznámější patří Penicillium expansum (kontaminant jablek a ovoce), P. claviforme, P. roqueforti, dále Aspergillus clavatus, Byssochlamys nivea (Betina, 1990; Tománková a kol., 2006; Krmenčík, 2007). Patulin je znám především jako kontaminant jablek a jejich produktů. Růst plísně a následná tvorba patulinu probíhá teprve až při poškození povrchové tkáně plodu. Patulin byl také zjištěn v ovoci s přirozenou hnědou hnilobou, jako jsou např. grepy, 32