informační magazín číslo 14-2010

informační magazín číslo 14-2010 KLINICKÁ BIOCHEMIE? ŠIRŠÍ MOŽNOST VOLBY PROGRAMOVANÁ BUNĚČNÁ SMRT ANEB FENOMÉN APOPTÓZY CENA ARNOLDA BECKMANA KLINICKÉ VYUŽITÍ AMH

Vážení čtenáři, zákazníci, dovolte, abych vám v prvním vydání časopisu In vitro diagnostika v roce 2010 dodatečně popřál všechno nejlepší v tomto roce, především zdraví, ale také hodně úspěchů jak v soukromém, tak profesním životě. Uplynulý rok byl obdobím, které je těžké hodnotit pozitivně. Byl to rok, který zasáhl významně do soukromého i pracovního života nás všech, a to především vypuknuvší finanční krizí. Na jeho začátku jsme mohli doufat, že se nás finanční potíže nedotknou a pokud ano, tak jen málo. Nakonec však krize finanční přerostla v krizi ekonomickou a postihla všechna odvětví a resorty ŠTĚPÁN TINTĚRA VĚRA VEJVODOVÁ národního hospodářství. O tom jsme měli možnost se přesvědčit na konci loňského roku prostřednictvím úsporných opatření navržených vládou ČR a dnes již známým výsledkem propadu národního rozpočtu. V rezortu zdravotnictví se dopady ekonomické krize nejevily tak hluboké. Vlivem propadu výroby a nárůstu nezaměstnanosti však došlo k poklesu příjmů do národního rozpočtu a také k poklesu výběru zdravotního pojištění. Finanční rezervy zdravotních pojišťoven (snad moudře) naakumulovaných v letech prosperity tak byly rychle vyčerpány a v současné době stojíme před obdobím nedostatku finanční zdrojů získaných výběrem zdravotního pojištění. Na druhou stranu naše zdravotnictví zažívá nevídanou finanční podporu v oblasti investic na rozvoj úrovně poskytované zdravotní péče a na pořizování nových technologií z prostředků evropských fondů. Lze očekávat, že se v letošním roce budeme potýkat s nedostatkem financí na vlastní provoz zdravotnických zařízení a zároveň s možností čerpat investiční prostředky z fondů EU. Ať tomu bude tak či jinak, nezbývá nám všem než se s danou situací vyrovnat, překonat jisté obtíže a vytvořit si slušný základ pro rozvoj v letech budoucích. Přeji vám dostatek vytrvalosti, trpělivosti, vůle a rozhodnosti překonat nepřízeň osudu a dosáhnout kýžených úspěchů. Rok 2010 je pro společnost Immunotech a.s. přelomovým rokem. Dojde v něm k rozdělení jejích vývojových, výrobních a komerčních aktivit. Zatímco vývoj a výroba zůstanou hlavním programem společnosti Immunotech a.s., komerční aktivity budou převedeny do společnosti Beckman Coulter Česká republika s.r.o., která je dceřinou společností firmy Immunotech a.s. Tento proces je spojen V současné chvíli vrcholí převod výroby manuálních IVD souprav z USA do Prahy. Immunotech a.s. se tak stává největším výrobcem manuálních diagnostických souprav v rámci celého koncernu Beckman Coulter. Bez nadsázky lze říci, že společnost Immunotech a.s. se tak řadí k největším výrobcům IVD prostředků na světě. Společnost Beckman Coulter Česká republika s.r.o. má pak před sebou rok transformace na komerční entitu koncernu Beckman Coulter, včetně přechodu na nový informační systém a plnou integraci do systému koncernu Beckman Coulter. Konsolidací produktového portfolia firmy Olympus a Beckman Coulter se společnost Beckman Coulter Česká republika s.r.o. stává ještě významnějším partnerem pro klinické laboratoře v České republice. Pevně věřím, že obě naše společnosti a zejména jejich zaměstnanci úspěšně zvládnou všechny náročné úkoly a že se tak stane především ve prospěch zákazníků. Přeji všem zaměstnancům společnosti Immunotech a.s. a Beckman Coulter Česká republika s.r.o. hodně zdraví, úspěchů a spokojenosti v roce 2010. s akvizicí divize laboratorní diagnostiky firmy Olympus, která proběhla v minulém roce. Před oběma společnostmi jak Immunotech a.s., tak i Beckman Coulter Česká republika s.r.o. stojí v nadcházejícím období celá řada náročných úkolů. ŠTĚPÁN TINTĚRA E-MAIL: STINTERA@BECKMAN.COM 2 informační magazín číslo 14-2010

Obsah Klinická biochemie širší možnost volby 4 V minulém roce společnost Beckman Coulter Inc. koupila divizi laboratorní diagnostiky společnosti Olympus. Tato akvizice znamenala rozšíření nabídky společnosti Beckman Coulter o biochemické systémy AU a systémy automatizace preanalytické fáze OLA, dnes AutoMate. Analyzátory řady AU family concept 6 Zvolte kterýkoli přístroj - systém zůstává stejný Analyzátory UniCel DxC klinická biochemie 8 Programovaná buněčná smrt aneb fenomén apoptózy 10 Nové monoklonální protilátky pro průtokovou cytometrii 23 Nová generace kapilárních elektroforéz 24 Beckman Coulter se svými více než 230 patenty představuje celosvětového lídra v oblasti kapilárních elektroforéz. O tom svědčí i zcela nová generace tohoto druhu elektroforéz, jejímž reprezentantem je unikátní přístroj PA 800 plus. FRIP Field Rotor Inspection Program 25 Cena Arnolda Beckmana 26 Beckman Coulter Česká Republika a Česká společnost pro biochemii a molekulární biologii (ČSBMB) vyhlašují Časopis vydává a distribuuje IMMUNOTECH a.s., Radiová 1, 102 27 Praha 10 www.beckman.cz Časopis připravují Ing. Vanda Filová, PhD. Ing. Kateřina Kožaná Ing. Eva Králová Ing. Hana Krátká Mgr. Pavel Kružík RNDr. Helena Kurzweilová, CSc. Ing. Kateřina Lapišová, PhD. Ing. Petr Suchan Mgr. Patrik Šaf RNDr. Jozef Smolka Do časopisu přispěli RNDr. Štěpán Tintěra Ing. Věra Vejvodová Ing. Lukáš Palivec, PhD. RNDr. Kristián Koubek, DrSc. - ÚHKT Mgr. Pavel Kružík Ing. Eva Králová Mgr. Hana Coufalová, MUDr. Josef Kopáč - Lékařská laboratoř RNDr. Helena Kurzweilová, CSc. Ing. Vanda Filová, PhD. Ing. Jitka Černá RNDr. Jozef Smolka Mgr. Jozefína Bernátová Mgr. Hana Hlaváčová Ing. Martin Váňa Ing. Kateřina Kožaná Ivan Šarkan - autor křížovky Ing. Stanislav Čermák - autor tajenky Graf ická podoba Nina Nováková Tiskárna REPRO servis s. r. o. Starochuchelská 15/195, 159 00 Praha 5 Náklad čísla 1800 výtisků Nová souprava pro stanovení protilátek CMV IgG a CMV IgM 27 na imunochemických analyzátorech Beckman Coulter Novinky od beckmanů 28 aneb několik slov o manuálních imunodiagnostických soupravách AMH a jeho klinické využití 28 Možnost existence hormonu, který v průběhu prenatálního vývoje inhibuje přeměnu Müllerových vývodů v ženské genitálie, formuloval již ve 40. letech 20. století francouzský badatel Alfred Jost. Existence této látky byla prokázána díky úsilí jeho žáků o tři desetiletí později. Nová ELISA souprava na stanovení AMH II. generace 31 Celostátní sjezd ČSKB v Praze 31 Škola prietokovej cytometrie Nová Polianka 32 IV. Bratislavské hematologické a transfuziologické dni s medzinárodnou účasťou 33 XVII. Sympózium dyslipoproteinémia a ateroskleróza 34 Sekcia pre aterosklerózu SSKB Vzdělávání z evropských fondů ve společnosti Immunotech 35 Teambulding 2009 35 aneb vzhůru do Zvánovického hvozdu Pražská padesátka 37 Útvar lidských zdrojů 38 Křížovka o ceny 39 Kde se můžeme setkat (leden červen 2010) 40 Konference/seminář s účastí společnosti Immunotech a.s. formou stánku informační magazín číslo 14-2010 3

Klinická biochemie širší možnost volby V minulém roce společnost Beckman Coulter Inc. koupila divizi laboratorní diagnostiky společnosti Olympus. Tato akvizice znamenala rozšíření nabídky společnosti Beckman Coulter o biochemické systémy AU a systémy automatizace preanalytické fáze OLA, dnes AutoMate. Koncern Beckman Coulter tak má vedle svých původních systémů UniCel DxC další platformu biochemických analyzátorů, a to výše zmíněné systémy AU. V souvislosti s touto skutečností se nabízí otázka, kterou platformu analytických systémů bude společnost nadále podporovat a jak se tato skutečnost promítne do obchodní strategie společnosti. Než tuto otázku zodpovím, je potřeba zjistit, čím se tyto dvě analytické platformy liší. Oba systémy se v minulosti vyvíjely vedle sebe, a to zcela nezávisle jeden na druhém. Je to logické, protože každá technologie byla v rukou jiné společnosti a každá tato společnost měla svoji koncepci vývoje analytické platformy. Vývoj technologií byl rovněž ovlivněn národním prostředím vývojových základen obou systémů. Mám zde na mysli místo, kde jsou tato vývojová a výrobní centra doma tedy Japonsko a USA. I nezasvěcený laik na první pohled rozpozná technologickou odlišnost jednotlivých systémů. Zatímco se systémy UniCel DxC, coby vývojový článek systémů Synchron, vyznačují technologickou robustností, nové systémy AU vycházejí z vývoje předchozích systémů za využití precizních komponent a známé japonské miniaturizace. Dalo by se tedy soudit, že se jedná o naprosto rozdílné technologie, které nelze postavit vedle sebe. Zkusme se na to, čím se oba systémy liší či čím si jsou podobné, podívat z pohledu zákazníka uživatele. Obě společnosti se v minulosti rozrostly do nadnárodních rozměrů, a to je nasměrovalo k respektování požadavků uživatelů na celém světě. V tomto ohledu tedy obě společnosti sbíraly informace ze zcela shodného segmentu trhu. Na uvedených analytických platformách vyvíjely v průběhu času metody (testy), po nichž byla poptávka, a to v požadované kvalitě, především s ohledem na klinické aspekty jejich potřeby. Jinými slovy, na obou systémech jsou aplikovány shodné metody. V případě metod rutinní klinické biochemie se navíc jedná o metody, které spolu velice dobře korelují, přinejmenším v drtivé většině metod. Z tohoto pohledu lze tedy konstatovat, že se jedná o velice podobné systémy, které mohou stát vedle sebe v jedné laboratoři. Nezbývá tedy než se pídit dál. Z logistického pohledu kompatibility reagencií lze opět pouze konstatovat, že se jedná o rozdílné systémy. Reagencie Další vývoj biochemických analyzátorů bude určován především trendy v automatizaci ve smyslu kombinovaných systémů a konsolidace pracovních stanic nebo propojení jednotlivých analyzátorů v lince a jejich svázání či nezávislosti na preanalytické fázi. se do obou systémů vkládají ve zcela rozdílných lahvičkách či kontejnerech. Nelze vložit kontejner určený pro systémy Synchron (UniCel DxC) do analyzátorů AU. To ovšem nevylučuje fakt, že je v kontejnerech pro oba systémy stejná reagencie, a to v takové koncentraci, že se v konečném důsledku jedná o stejnou metodu a aplikaci. Společnost Beckman Coulter pracuje na sjednocení chemie, reagencií pro oba systémy. Přesto je skutečnost, že se reagencie do obou systému vkládají v naprosto rozdílných kontejnerech, z pohledu posouzení rozdílnosti zásadní. Přesto ani tento fakt nevylučuje možnost postavit oba systémy vedle sebe v jedné laboratoři. V současné době jsou laboratoře vybaveny celou řadou nekompatibilních systémů a nikdo se nad tím nepozastavuje a nepohoršuje. Také bychom se mohli zeptat, jak se oba systémy doplňují. Tady lze jednoznačně konstatovat, že oba systémy společně pokrývají širokou škálu nabízeného výkonu. Tento aspekt je zajímavý především z pohledu ekonomiky provozu. Poddimenzovaný výkon analyzátoru s sebou nese problémy v rychlosti pořizování výsledků jednotlivých vyšetření a jejich dostupnosti klinikovi. Dále provozní zatížení poddimenzovaného výkonu analyzátoru přináší jistá rizika. Naopak předimenzování výkonu analyzátoru znamená jak vyšší investice do vlastní technologie, tak i vyšší provozní náklady na spotřební materiál potřebný především k provozní údržbě, jako jsou například promývací roztoky. Vraťme se tedy k původní otázce. Kterou technologickou platformu má společnost Beckman Coulter dále podporovat a vyvíjet? V průběhu vývoje jednotlivých technologií biochemických analyzátorů obou společností byly zohledněny i aspekty, které se týkaly návaznosti analytických platforem na technologie preanalytické, případně postanalytické fáze a návaznosti na imunochemické metody v rámci koncepce konsolidace pracovních stanic. A zde se najednou vynoří skutečnost, že existuje důvod, proč v rámci jedné společnosti podporovat obě technologické platformy. V současných laboratořích se setkáváme s několika rozdílnými pohledy na automatizaci laboratorního procesu. 4 informační magazín číslo 14-2010

Plná automatizace a spojení preanalytické fáze s fází analytickou a následně i s fází postanalytickou, nebo konsolidace pracovních stanic s oddělením automatizace preanalytické fáze? Které řešení je kdy vhodné? To závisí již jen na uživateli, na jeho vizi a na způsobu, jakým chce této vize dosáhnout. Pro ilustraci lze uvést několik případů. Uživatel je například vybaven celou řadou samostatných analytických systémů. Toto řešení mu poskytuje vysokou variabilitu rozložení konkrétních testů na jednotlivé systémy. Tím hlavním důvodem může být kvalitativní hledisko. V takovém případě může uživatel ze sortimentu společnosti Beckman Coulter volit jak systém UniCel DxC, tak systém AU. Navíc se mu naskýtá možnost volit takový systém, který jej plně uspokojí z pohledu nabízeného výkonu. Biochemické systémy v nabídce Beckman Coulter pokrývají širokou výkonnostní škálu od malých analyzátorů (AU 480) až po analyzátory s vysokým výkonem (AU 5400). Systémy UniCel DxC se v této škále nacházejí uprostřed a doplňují tak nabídku biochemických systémů. Takto diverzifikované analytické platformy lze jednoduše doplnit o nezávislou preanalytickou technologii AutoMate. Dalším příkladem může být laboratoř, která směřuje ke konsolidaci vyšetření na co nejmenší počet pracovních stanic. Tady se pak nabízí řešení na platformě UniCel DxC a DxI, které ve svém propojení tvoří kompaktní kombinovaný systém UniCel DxCi (UniCel DxC880i, UniCel DxC860i, UniCel DxC660i a UniCel DxC680i), a to v závislosti na poměru biochemických a imunochemických vyšetření. Hlavním kritériem proč volit takovéto řešení je vedle kvality i ekonomika. V tomto případě lze opět doplnit uvedené řešení preanalytickou stanicí AutoMate. Dalším příkladem je plně automatizovaná laboratoř rutinních vyšetření. V takovém případě společnost Beckman Coulter nabízí řešení spojení preanalytické, analytické a postanalytické fáze prostřednictvím linky Power Processor s centrifugací, alikvotací a napojením jednotlivých analytických systémů v počtu a typech dle potřeb laboratoře. Toto řešení umožňuje propojení biochemických systémů AU a UniCel DxC a dále jejich propojení s imunochemickým systémem UniCel DxI, ale i systémy jinými. V postanalytické fázi pak figuruje plně automatizovaný skladový systém vzorků, včetně opakování testů nebo jejich doplnění. Všechna výše zmiňovaná řešení lze z pohledu prenalytiky doplnit o systém Remisol pro sledování vzorků v laboratoři a validaci výsledků stanovení. Uvedené příklady jsou důvodem, proč společnost Beckman Coulter hodlá i nadále podporovat obě biochemické platformy jak UniCel DxC, tak systémy AU. Pak je tu ještě jeden velice významný důvod, a to z pohledu současných uživatelů obou systémů početná základna obou instalovaných systémů. Suma sumárum, společnost Beckman Coulter bude i nadále podporovat řešení laboratorních provozů s využitím jak platformy AU, tak UniCel DxC. Další vývoj biochemických analyzátorů bude určován především trendy v automatizaci ve smyslu kombinovaných systémů a konsolidace pracovních stanic nebo propojení jednotlivých analyzátorů v lince a jejich svázání či nezávislosti na preanalytické fázi. Vizí společnosti Beckman Coulter je spokojený zákazník. Spokojenost zákazníka je hlavní nástroj, jak se stát úspěšnou firmou na poli laboratorní diagnostiky. Pevně věříme tomu, že akvizice divize laboratorní diagnostiky společnosti Olympus umožní koncernu Beckman Coulter ještě lépe uspokojovat potřeby zákazníka. ŠTĚPÁN TINTĚRA E-MAIL: STINTERA@BECKMAN.COM informační magazín číslo 14-2010 5

Analyzátory řady AU family concept ZVOLTE KTERÝKOLI PŘÍSTROJ - SYSTÉM ZŮSTÁVÁ STEJNÝ nalyzátory AU jsou hojně zastoupeny v laboratořích v České a Slovenské republice. Rádi bychom vám dnes představili novou řadu těchto analyzátorů, která vychází z původní platformy a je na trhu novinkou. V polovině loňského roku představila firma zcela nový analyzátor AU680, který je následovníkem úspěšného modelu pro středně velké laboratoře. Po něm následovaly další nové analyzátory AU480 pro menší laboratoře a AU2700Plus pro velkokapacitní laboratoře. Tato nová řada analyzátorů je, stejně jako předchozí, postavena na stejné platformě a obecně lze říci, že téměř jedinou vlastností, kterou se přístroje liší, je rychlost zpracování vzorků a s tím přímo související vlastnosti strojů, jako jsou jejich rozměry, kapacita podavače vzorků, počet kyvet apod. Nové analyzátory nabízejí mnoho výhod, mezi které bezesporu patří snížení objemu reagencií a vzorku, snížení celkového reakčního objemu nebo zvýšení počtu současně prováděných analýz. Pro minimalizaci prostoru potřebného k instalaci jsou analyzátory nově vybaveny otočným ramenem s dotykovou obrazovkou a klávesnicí. Filozofie AU analyzátorů (jejich obsluha, software, vzorkové stojánky atd.) je u všech přístrojů nové řady stejná. Vzorky jsou do strojů vkládány ve stojáncích. Pro jejich snadné zpracování používají všechny systémy AU stejné flexibilní stojánky, které umožňují současné použití zkumavek o průměru 11,5 mm až 16 mm. Podavač stojánků je u analyzátorů AU navržen tak, aby manipulace byla co nejjednodušší. Do pásového podavače lze najednou vložit různý počet stojánků se vzorky podle rychlosti jejich zpracování u různých analyzátorů: AU480 umožňuje současné vložení 8 stojánků, tj. 80 vzorků, AU680 15 stojánků, tj. až 150 vzorků, a AU2700Plus 30 stojánků, tedy až 300 vzorků. Stojánky se vzorky je možné u všech analyzátorů kontinuálně přidávat v průběhu práce. Přednostní zpracování urgentních vzorků je u analyzátorů řešeno dvěma způsoby prvním z nich je tzv. SUPERSTATIM, kdy je vzorek vložen do chlazeného STAT rotoru a je okamžitě po vložení upřednostněn před všemi ostatními vzorky. Druhým způsobem je předřazení urgentních vzorků v červených statimových stojáncích. Možnost reflexního testování a automatické opakovaní vzorků zkracuje dobu potřebnou k analýzám. Analyzátor AU680 je vybaven dopravníkem k přednostnímu zpracování reflexních a opakovaných testů. Doba kompletní analýzy vzorků se tak významně zkrátila a přispěla tak ke zkrácení TAT a tedy k rychlejší odezvě laboratoře. Vzorková dávkovací jehla je stejně jako u předchozí řady analyzátorů vybavena funkcí detekce sraženiny, detekce hladiny vzorku, detektorem pro prevenci nárazu a poškození, funkcí rychlosti nasávání v závislosti na objemu a funkcí nastavení pohybu ramene. Všechny tyto funkce vytváří systém bezpečné manipulace se vzorkem nabízející: výjimečnou spolehlivost, přesnost a bezpečnost dávkování vzorků minimální dávkovací objemy vzorku 1,0 μl (AU480 a AU680) a 1,6 μl (AU2700plus) automatické opakované provedení analýzy s původním, ředěným nebo kondenzovaným objemem vzorku bez zásahu obsluhy 6 informační magazín číslo 14-2010

Lahvičky na systémové reagencie jsou navrženy tak, aby je bylo možné umístit přímo do chlazeného reagenčního prostoru všech typů AU analyzátorů. Možnost použití různých velikostí reagenčních lahviček, od 15 ml až do 120 ml (AU2700Plus), dává možnost volby množství reagencie podle četnosti požadavků na danou metodu. Každý z reagenčních prostorů je vybaven snímačem čárového kódu pro identifikaci reagencií, aby nedocházelo k jejich záměně. Kontrola reagencií v softwaru analyzátoru je velmi jednoduchá a zahrnuje přehled reagencií a počet testů, popř. i objem reagencie. Možnost vložení i více lahviček se stejnou reagencií a automatický přechod dávkovače k dávkování z další lahvičky vylučuje nutnost přerušení práce stroje pro doplnění reagencie. Možnost současného zpracování 63 (AU480 a AU680), resp. 51 (AU2700Plus) různých analytů nabízí skutečnou konsolidaci metod na jednom přístroji. Systémové reagencie byly vyvinuty společně s biochemickými analyzátory tak, aby poskytovaly nejenom přesné a spolehlivé výsledky, ale i pohodlné zpracování a ekonomický provoz. Reagencie jsou dodávány tzv. ready to use, tj. připravené k použití, jsou kompatibilní se všemi analyzátory nové řady AU a mají jednotné nastavení. Jejich použití garantuje efektivitu, která je dána ekonomikou nákladů a jednoduchou kontrolou spotřeby. Pro konsolidaci základních a speciálních metod na analyzátorech AU lze použít více než 100 aplikací reagencií, včetně rutinních analýz, analýz specifických proteinů, homogenních imunoanalýz, DAU, TDM a ISE. Při jejich průměrné 60ti-denní stabilitě v přístroji a dlouhodobé stabilitě jejich kalibrace nedochází k znehodnocení a jsou plně využity ke zpracování. Technologie bodového fotometru je založena na moderní koncepci. Přednosti tohoto systému jsou: bezúdržbový fotometrický systém pouze jeden měřicí úkon, což zrychluje provádění analýz potlačení jakýchkoli šumů snižujících kvalitu signálu snížení reakčního objemu až na 120 μl v kyvetě Všechny přístroje jsou vybaveny stejnými kyvetami, které jsou vyrobeny z křemíkového skla. Jejich inkubace je řešena tak, aby vyhovovala maximální kvalitě a účinnosti současně s minimalizací údržby. Zcela nový software, kterým jsou všechny analyzátory vybaveny, je velmi přehledný a intuitivní a má integrovánu i řadu vlastností, které, jak Pro lepší orientaci uvádíme tabulku základních parametrů analyzátorů řady AU: AU480 AU680 AU2700Plus Výkon (testy/hod) 400 / 800 / 1600 / 800 s ISE 1200 s ISE 2134 s ISE Současně prováděné analýzy 60 + 3 ISE 60 + 3 ISE 48 + 3 ISE Kapacita podavače vzorků 80 150 300 Objem vzorku 1 25 μl 1 25 μl 1,6 25 μl Reagenční prostory 76 pozic 60 pozic R1 48 pozic R1 R1/R2 48 pozic R2 48 pozic R2 Objem reagencií 10 250 μl 15 250 μl 15 250 μl Celkový reakční objem 90 350 μl 120 425 μl 120 425 μl Reakční čas 8 min 37,5 s 8 min 40 s 8 min 22 s věříme, zpříjemní uživatelům AU přístrojů práci s analyzátory. Software nové řady AU analyzátorů je v českém jazyce. Stejný software u všech přístrojů umožní, že, umíte-li používat jeden přístroj, umíte pracovat i se všemi dalšími a doba potřebná pro zaškolení obsluhy při instalaci dalšího analyzátoru je tak významně minimalizována. Základem software je Windows XP, který nabízí již osvědčené uživatelské rozhraní. Jednoduchý software lze ovládat pomocí ikon prostřednictvím dotykové obrazovky nebo klávesnice. Uživateli usnadňuje práci i definování si vlastního uživatelského menu. Interaktivní funkce nápovědy zajišťuje správné použití systému ve všech situacích. Podporu při údržbě a péči o systém nebo odstraňování závad lze získat také propojením se servisním centrem. Analyzátory AU jsou známé i vysokou kvalitou a výkonem ISE modulů. Nová řada analyzátorů rovněž používá stejný osvědčený systém. Vysoce výkonné jednotky ISE jsou v analyzátoru snadno přístupné. Dlouhodobá životnost elektrod potvrzuje jejich výjimečnou kvalitu. Jednotky ISE se vyznačují také nízkými nároky na údržbu a nabízejí pohodlný a úsporný provoz. Analyzátor AU680 nabízí i další unikátní výhody, které zpříjemňují a zkvalitňují proces zpracování vzorků: měření HbA1c z plné krve bez nutnosti manuálního předzpracování manipulace s 3-činidlovými reagenciemi přímé vložení reagencie pyridoxal-5-fosfátu a tím zvýšení stability reagencií ALT a AST on-board master kalibrace, která se využívá u vícebodových kalibrací, kdy je master kalibrační křivka nahrána do analyzátoru pomocí 2D čárového kódu a upravuje se uživatelskou kalibrací pomocí 1 bodu Analyzátory AU480, AU680 a AU2700Plus jsou kompatibilní, vzájemně zastupitelné. Vzhledem k různým rychlostem zpracování vzorků jsou vhodné do všech velikostí laboratoří, od malých velikosti S až po velké laboratoře velikosti XL. Věříme, že nová řada analyzátorů AU zaujme nejenom naše stávající uživatele, ale osloví i ty z Vás, kteří jste se s těmito přístroji dosud nesetkali. Zvolit do laboratoře AU analyzátor = zvolit jistotu, spolehlivost, preciznost... Pro laboratoře velkosti XL a XXL nabízí naše společnost speciální řešení = modulární vysokokapacitní systém. Informace k němu Vám přineseme v příštím čísle. informační magazín číslo 14-2010 7 VĚRA VEJVODOVÁ E-MAIL: VVEJVODOVA@BECKMAN.COM

Analyzátory UniCel DxC klinická biochemie Jak to všechno začalo... Produktová řada UniCel DxC je pokračovatelem dlouholeté tradice, kterou biochemické analyzátory Beckman Coulter představují. Skutečnost, že se jedná o vskutku letitou tradici, ukazují první analyzátory pro statimová vyšetření glukózy, kreatininu a urey, které spatřily světlo světa v roce 1970. Za zmínku jistě stojí, že druhá verze analyzátoru glukózy Glucose Analyzer 2 (rok výroby 1975) je pro svou robustnost a provozní nenáročnost v mnoha laboratořích využíván ještě dnes. Prvními opravdovými automaty byly analyzátory CX3, CX4, resp. CX5 a jejich integrace v analyzátory CX7, resp. CX9, které odstartovaly celosvětově úspěšnou a rozšířenou produktovou řadu Synchron. Později byla tato produktová řada doplněna o systém, který disponoval především vyšším výkonem, o Synchron LX20. Po třiceti letech od prvních instalací malých statimových analyzátorů byla v roce 2006 na trh uvedena produktová řada DxC ve dvou verzích DxC600 a DxC800. Tradice ve výrobě a vývoji biochemických analyzátorů původně firmy Beckman, později Beckman Coulter, je u analyzátorů DxC více než patrná osvědčené principy byly zachovány a doplněny o moderní technologie. Pojďme se tedy DxCéčkům podívat pod kapotu! Technické řešení analyzátorů Technický popis analyzátorů začnu vysvětlením rozdílu mezi DxC600 a DxC800. Oba analyzátory se skládají ze dvou modulů MC modulu (modular chemistry, angl.) a CC modulu (cartridge chemistry, angl.). MC modul je složený z jednotlivých sektorů vymezených pro měření pouze jedné konkrétní metody. Princip měření a optimalizace těchto metod jsou nastaveny tak, aby doba analýzy byla co nejkratší. Výsledky jsou proto dosaženy již do 40 sekund od aspirace vzorku! Varianta DxC600 má MC modul vybavený sektory pro stanovení glukózy a ISE (nepřímé stanovení). V rámci ISE je kromě běžných iontů (K, Cl, Na) stanovován také vápník. Výkonnější varianta DxC800 obsahuje vedle výše zmíněných také sektory pro stanovení kreatininu, celkové bílkoviny, urey, fosforu a albuminu. CC modul je klasický fotometr, který je u obou analyzátorů totožný. Pokud vyjádříme rozdíl v číslech, pak DxC600 disponuje teoretickým výkonem 990 testů/hod a DxC800 1440 testů/hod. Rychlý MC modul je často také nazývaný STATIM modulem. Toto označení vystihuje další vlastnost analyzátorů DxC, kterou je jejich nepřetržitý pohotovostní režim. Analyzátory není nutné vypínat, a to ani v laboratořích, kde neprobíhá víkendový provoz. Před započetím se nespouští žádné zahřívání (warm up) či promývání analyzátoru. V průběhu provozu lze vkládat reagencie za chodu analyzátoru. Tyto technické vlastnosti umožňují rychlou odezvu, která je potřeba nejenom pro měření STATIM vzorků. Unikátní vlastností DxCéček je volitelný upgrade na verzi DxCPRO, která umožňuje měření z uzavřených primárních zkumavek. Na vstupu zkumavek do systému je gumové septum ve víčku propíchnuto tenkým nožem tak, aby víčkem bez problémů prošla aspirační jehla. Zkumavky proto není nutné před analýzou odvíčkovat a po analýze před uskladněním opět zavírat. Analýza z uzavřené zkumavky představuje nejen vyšší bezpečnost práce pro laboratorní personál, ale také díky zamezení odparu vzorku nesporně vyšší kvalitu stanovení. Dalším prvkem, kterým se analyzátory DxC liší od jiných systémů běžně dostupných na trhu, je použitý zdroj záření ve fotometru xenonová pulzní lampa. Díky tomu, že nesvítí nepřetržitě, ale pouze v okamžiku odečtu absorbance, lze její životnost garantovat na dobu pěti let. Kyvetový prostor (materiál křemenné sklo) i reagenční karusel jsou temperovány pomocí peltierova článku. Odpadá 8 informační magazín číslo 14-2010

(jako např. celková bílkovina, amyláza, digoxin, vancomycin) docházet s přibývající dobou ke snižování analytické citlivosti. Důvodem může být odpar reagencie nebo sorpce CO 2 a O 2 ze vzduchu. Beckman Coulter nabízí pro tyto případy řešení v podobě perforovaných gumových víček, které se nasadí na otvory otevřené cartridge před jejich vložením do analyzátoru. Reagenční jehly při aspiraci reagencie těmito víčky projdou bez problémů a reagencie přitom zůstávají uzavřené. Kvalita stanovení vzorku je spolu s kvalitou reagencií dána mnoha dalšími faktory. Jedním z nich jsou i kontrolní mechanismy ovládacího SW analyzátorů. Systémy DxC informují uživatele v případě špatné kvality reagencie (abs blanku, nízká citlivost reakční křivky), stejně tak i špatné kalibrace (limitní rozsah absorbance pro hodnoty kalibračních bodů, citlivost kalibrační křivky a rozptyl kalibračních bodů). DxCéčka jsou vybavena funkcí ORDAC (Automatic Range Detection and Correction, angl.). Pokud je směrnice reakční křivky na počátku reakce příliš strmá (v čase odečtu reakčního okna by absorbance překročila horní mez detekce analyzátoru), analyzátor reakci zastaví a provede automatické předředění vzorku. tak údržba či riziko znečištění analyzátoru, které představuje řešení temperace kapalnou lázní. Kvalita aspirace vzorku je hlídána senzorem hladiny a detektorem sraženiny. Analyzátor v případě detekce sraženiny (snímání tlakového profilu v průběhu aspirace) provede opakovanou aspiraci. Teprve pokud i v tomto případě detekuje sraženinu, označí vzorek jako nevyhovující a neprovede analýzu. Tím je minimalizován počet nevyhovujících vzorků. Reagencie kvalita stanovení Analyzátory DxC disponují on-board kapacitou 65 metod v případě DxC600 resp. 70 metod v případě DxC800. Kapacita CC modulu je 59 metod a je pro obě verze analyzátoru shodná. MC modul DxC600 má kapacitu 6 metod, DxC800 11 metod. Z důvodu obecně vyššího počtu stanovení u metod umístěných v MC modulu jsou příslušné reagencie ve 2 litrových kanystrech, ze kterých lze změřit až tisíce stanovení. Tím je redukována častá výměna reagenčních zásobníků. Cartridge pro CC modul (fotometr) jsou uvnitř dělené do tří sektorů. To umožňuje u metod vyžadujících vícesložkové reagencie, které jsou smíchány až při samotné reakci, zachovat jednu cartridge na jednu metodu. Beckman Coulter nabízí široké spektrum originálních reagencií (přes 90 metod) určených pro diagnostiku in vitro (označených CE značkou). Tyto metody jsou ze zákona validované a jejich kvalita je garantována výrobcem. Analyzátory DxC jsou otevřené systémy, tzn. v případě potřeby je možná definice až 100 uživatelských metod. Pro stanovení těchto metod je použito pět analytických principů ISE, měření vodivosti, spektrofotometrie, turbidimetrie, NIPIA (pro stanovení vysocesenzitivního CRP). Stabilita reagencií je obecně vysoká. Je běžné i u jiných výrobců, že v případě nižšího počtu vyšetření (reagencie jsou v analyzátoru dlouho otevřeny než jsou spotřebovány) může u některých metod Možnost automatizace Analyzátory DxC jsou součástí skupiny analytických systémů nesoucí společný název UniCel (Unified Workcel, jednotná pracovní stanice, angl.). Vedle biochemických analyzátorů spadají do této rodiny také imunochemické analyzátory DxI 600/800 a hematologické analyzátory DxH 800. Analyzátory DxC a DxI spojuje zdánlivě banální záležitost, kterou je jednotný stojánek na vzorky. Společně s centrifugou Spinchron DLX, která umožňuje centrifugovat vzorky umístěné přímo v těchto stojáncích, představuje toto řešení nejjednoduší úroveň automatizace v klinické laboratoři. Další stupeň automatizace, který je také nazýván diskrétní automatizací, představují integrované systémy UniCel DxCi. Prostřednictvím propojovacího členu UCTA (UniCel Closed Tube Aliquoter UniCel alikvoter z uzavřené zkumavky, angl.) lze získat čtyři možné kombinace integrovaných systémů DxC880i, DxC860i, DxC680i a DxC660i. V těchto konsolidovaných pracovních stanicích lze z jedné zkumavky provést drtivou většinu biochemických vyšetření. Více se o těchto analyzátorech zmiňuji v předchozích číslech časopisu IVD (8-2008, 12-2009). Pro doplnění celkového přehledu o diskrétním stupni automatizace je potřeba uvést také systémy AutoMate, které plně automatizují preanalytickou fázi laboratorního procesu. Nejvyšším stupněm automatizace Beckman Coulter je plná automatizace, tzn. fyzické propojení automatů, které zpracovávají preanalytickou, analytickou a postanalytickou fázi laboratorního procesu. Mluvíme o automatické lince Power Processor, kde mohou být po třídění vzorků, centrifugaci a alikvotaci zapojeny nejen analyzátory DxC a DxI, ale také AU systémy (viz. předchozí článek Analyzátory řady AU Family Concept ). Linka je na výstupu zakončena chlazeným skladem vzorků. Vyšší efektivity, kvality a kontroly nad laboratorním procesem lze dosáhnout pomocí SW Remisol Advanced. Více o tomto firmware si můžete přečíst v předchozích číslech časopisu IVD (8-2008-, 13-2009). LUKÁŠ PALIVEC E-MAIL: LPALIVEC@BECKMAN.COM informační magazín číslo 14-2010 9

Programovaná buněčná smrt aneb fenomén apoptózy Úvod V minulém století byl nastolen a rozpracován fenomén apoptózy neboli programované buněčné smrti (PCD). Lze říci, že jak buňka vzniká, tak také zaniká. K jejímu zániku je vytvořen dokonalý biochemický mechanismus. Tato likvidační kaskáda zahrnuje celý komplex nejrůznějších návazných jevů, který se označuje pojmem apoptóza (z řeckého apoptosis = opadávání), nebo-li programovaná buněčná smrt. V tomto smyslu byl uvedený termín použit J. F. Metrem, A. H. Williem a A. R. Curriem v roce 1972, i když lze tento fenomén najít již ve starověku řečtí filosofové Hipokratés a Galénos jej používali ve smyslu řídnutí kostí, odpadávání strupů a vlasů. V předminulém století němečtí badatelé C. Vogt (1842) a později W. Flemming (1885) vlastně popsali základní principy apoptózy. R. Locshin a C. Williams v roce 1964 zavedli termín programovaná buněčná smrt pro buňku, která umírá na předem určeném místě a v předem určeném čase. Badatelé H. Horowitz, H. Ellis a P. Stenberg (1982) popsali geny, které podmiňují aktivaci programované buněčné smrti u Caenorhabditis elegans. Expresi genů pro buněčnou smrt u lidských buněk popsali H. Zou a spol. v roce 1997. Nobelovu cenu za fyziologii a lékařství za výzkum v oblasti genetické regulace programované buněčné smrti získali v roce 2002 S. Brenner, R. Horvitz a J. Sulston. Apoptóza a programovaná buněčná smrt se v hrubých rysech dají ztotožnit, zatímco nekrózu lze chápat jako patologickou buněčnou smrt vyvolanou ischémií, mokroorganismy, poraněním, termickým úrazem a zářením. Apoptóza probíhá na úrovni jedné buňky, přičemž jsou masivně odstraňovány buněčné populace stejných či různých typů, a to v časových úsecích. Životnost buněk a jejich populací se značně odlišuje. Některé buňky (hematopoetické) mají relativně krátkou životnost vyjádřenou ve dnech, zatímco jiné buňky (např. nervové) mají životnost vyjádřitelnou až v rocích. Je třeba si uvědomit, že ne ve všech případech apoptóza některých buněk vede k zániku celého organismu. V určitých případech se jedná pouze o likvidaci nežádoucích buněk se snahou o vytváření prostoru pro jeho osidlování novými buňkami anebo pouze pro vytváření míst v procesech vývinu mnohobuněčného organismu. Již v embryonálním vývoji vznikají buňky, které po naplnění své funkce postrádají smysl, a tak jsou apoptózou likvidovány. Apoptóza je vlastně interakce specifických proteinů kódovaných fylogeneticky vysoce konzervovanými geny. Jedná se o komplexní geneticky regulovaný systém biochemických buněčných reakcí navozující smrt (odúmrť) buňky. K zániku buňky jako konečného důsledku jejího poškození jsou vytvořeny v podstatě dva hlavní mechanismy, které se označují jako apoptóza a nekróza. K těmto mechanismům přistupují ještě dvě další cesty označované jako aponekróza a paraptóza. Nekróza versus apoptóza Nekróza se definuje jako proces, při kterém dochází k narušení celých buněk začínající od rozrušení buněčných membrán a některých organel (mitochondrií). Tento jev je provázený degradací buněčných systémů až po porušení iontové a osmotické homeostázy. Dochází tak k ovlivňování aerobní respirace, která je nezávislá na enzymech typu kaspáz. Nekróza je chápána jako nefyziologická smrt, která představuje pasivní proces. Při ní dochází ke zvětšování buňky za rozrušení iontové rovnováhy provázené membránovou nestabilitou. Nekróza indukuje destruktivní zánět, kdy buňky odumírají vlivem fyzikálních, chemických nebo biologických změn. V počátcích nekrózy dochází k zástavě syntézy ATP, kdy jeho nedostatek vyvolává ztrátu semipermeability plazmatické membrány. Apoptóza je ztráta fosfolipidové asymetrie, kondenzace chromatinu za štěpení DNA, což vede k úbytku velikosti jádra, svrašťování buňky a pukání buněčné membrány. Rozpad buňky je provázen tvorbou apoptotických tělísek, genomovou integritou, která je závislá na kaspázových enzymech. Apoptóza je aktivní proces, při kterém dochází k postupnému smršťování buňky, až k její likvidaci. Při apoptóze není výrazným způsobem narušena membránová stabilita, ale za to je nápadná fragmentace a kondenzace buněčného jádra. Apoptóza je vymezována jako fyziologická smrt, kde je smršťování buňky provázeno relativní membránovou stabilitou, při které však dochází k fragmentaci a kondenzaci buněčného jádra. Apoptóza neindukuje destruktivní zánět (např. likvidaci nepotřebných buněk v průběhu ontogeneze při hormodependentní involuci). U apoptózy se jedná o aktivní proces, k jeho průběhu je nutný přísun ATP. Rozdíl mezi nekrózou, apoptózou, aponekrózou a paraptózou Během časných stádií nekrózy se buňky a jejich organely zvětšují a dochází k postupnému narušení celistvosti membrán. Nitrobuněčný obsah organel se vyplavuje do okolí buněk, kde navodí zánětlivou reakci, a nakonec dochází k úplnému rozpadu buňky. Naproti tomu při apoptóze buňka ztrácí nejprve asymetrii fosfolipidů v membráně, dochází ke kondenzaci chromatinu, redukci velikosti jádra a ke štěpení internukleosomové DNA. Rozpad buňky je provázen svraštěním a vydouváním buněčné membrány a tvorbou apoptických tělísek, která jsou v konečné fázi fagocytována bez vzniku zánětlivé reakce. Tabulka 1 podává základní charakteristiky dvou hlavní typů buněčné smrti nekrózy a apoptózy. V odborné literatuře se ještě objevují vedle nekrózy a apoptózy dva pojmy, a to aponekróza a paraptóza. Při aponekróze nedochází k dokončení buněčné smrti, jako je tomu u klasické apoptózy, protože se v konečných stadiích objevují známky nekrózy. Zde je pravděpodobně klíčovým momentem intracelulární obsah ATP, protože dostatek metabolické energie je potřebný pro kompletizaci apoptózy. Není-li ATP k dispozici, je zánik buňky dokončen formou nekrózy. Reaktivní formy kyslíku hrají prvotní úlohu při nekróze. Mechanismus nekrózy nastupuje, není-li při stimulaci vytvořena funkční kaspázová dependentní dráha, nebo je-li tato cesta blokována. Zdá se, že u řady buněk je přítomen skrytý jak apoptózový, tak nekrózový mechanismus. Tumor nekrotizující faktor (TNF) může navodit zánik buněk jak apoptózou, tak nekrózou, což závisí jednak na buněčném typu a jednak na obsahu ATP. Ukazuje se, že i membránový receptor Fas (CD95) může navodit nekrózu, kdy pravděpodobně spouští alternativní dráhu vedoucí k zániku buňky. U lymfoidních buňek typu T je tato cesta nezávislá na dráze zprostředkované kaspázou 8 a jako efektorová mole- 10 informační magazín číslo 14-2010

kula se uplatňuje molekula RIP. Tato molekula je klíčová nejen pro nekrózu navozenou FasL, ale též se zapojuje do drah, které jsou iniciované prostřednictvím molekul TNF a TRAIL. U paraptózy je nápadná tvorba vakuol a zvětšování (nabobtnání) mitochondrií. Paraptóza, pozorovaná u některých buněk, nemá nic společného s apoptózou, je charakterizována tvorbou vakuol v buněčné cytoplazmě při nabobtnání mitochondrií. Apoptóza V tomto článku se zaměříme na apoptózu, nebo-li programovanou buněčnou smrt, která je postupně rozpracovávána po dobu více než 40 let. Pojem apoptóza je vymezen na základě řeckého slova apoptosis, což znamená opadávání. V roce 1972 pracovníci Kerries, Wyelie a Curry definovali apoptózu jako soubor specifických morfologických změn vedoucí k fyziologické smrti buněk. Od té doby se apoptóza dostala do popředí výzkumu, což lze doložit tím, že v roce 2005 bylo publikováno více než 100 000 vědeckých článků. Apoptóza se tak dostala pro svoji aktuálnost na samou špičku vědeckého zájmu, protože se jedná o zajímavý fenomén, na kterém se podílí vedle genetické determinace i celá řada nejrůznějších molekul. Apoptóza je tak vymezena jako děj komplexně regulovaných proteinů, ve kterém se uplatňují jednak proapoptické molekuly (celá řada proteinů) a jednak antiapoptické molekuly (např. Bcl-2). Při navození apoptózy přistupují některé specifické proteiny, tzv. proapoptické cytokiny (např. TNFα, TGFβ) a další molekuly (betulinová kyselina, ceramid, perforin, granzym B). Základní cesty indukce apoptózy K navození apoptózy v podstatě existují dvě základní cesty: 1) vnější cesta indukce apoptózy a 2) vnitřní cesta indukce apoptózy. Komplexní regulovaný systém biochemických buněčných reakcí (geneticky determinovaných) vedoucích ke smrti buňky je indukován pomocí těchto dvou zcela nezávislých metabolických cest. Vnější a vnitřní cesta indukce apoptózy jsou probrány následovně. 1) Vnější cesta indukce apoptózy Vnější prostředí dodává proapoptotické signály, které zachycují specifické membránové receptory, čímž se spouštějí vlastní apoptotické procesy. Apoptóza probíhající touto cestou může být navozena pronikáním některých spouštěcích enzymů přímo do intraceulárního prostoru buňky. Na vnější cestě indukce apoptózy se podílejí serinové proteinázy zvané granzymy. Do buněčné membrány vnikají otvory, které jsou tvořeny perforiny. Perforiny a granzymy (granzym B) se uplatňují hlavně při indukci apoptózy buněk NK, které jsou schopny aktivovat kaspázovou kaskádu. Tabulka 1: Charakteristiky dvou hlavních typů buněčné smrti nekrózy a apoptózy Nekróza Pasivní proces Nefyziologická smrt Apoptóza Aktivní proces Fyziologická smrt indukuje destruktivní zánět * neindukuje destruktivní zánět ** zvětšování buňky, prasknutí smršťování buňky membránová nestabilita membránová stabilita rozrušení iontové rovnováhy fragmentace a kondenzace jádra zástava syntézy ATP přísun energie ve formě ATP ztráta polopropustnosti membrány exprese nových genů zastavení proteosyntézy vznik apoptotických tělísek zvýšení pasivního transportu aktivace proteolytického aparátu převládnutí katabolizmu fragmentace DNA Poznámka: * = buňky odumírají vlivem fyzikálních, chemických nebo biologických změn ** = likvidace nepotřebných buněk v průběhu hormodependentní involuce Tabulka 2: Základní stupně kaskády vnější cesty apoptózy Kroky Navazující postupy Poznámky 1 Vazba ligandu na receptor (TNFR-1, Fas) CD261,CD262, TRAMP 2 Trimerizace receptorových molekul APO-1 (FAS) 3 Signální transdukce, smrtící domény DISC ( death inducing signal ) 4 Nahromadění adaptorových molekul TRADD, FADD 5 Uvolnění cytochromu c z mitochondrií Amplifikace 6 Aktivace kaspázové kaskády Kaspázy (3,6,7,9) 7 Aktivace transkripčních faktorů Bcl-2, Bax, BH-3 8 Štěpení cytoskeletárních proteinů 9 Degradace jaderného materiálu, karyolýza Kolaps buněčného jádra 10 Fragmentace internukleozomální DNA V podobě pravidelných úseků 11 R Rozpad buňky a vznik apoptotických tělísek 12 Likvidace tělísek makrofágy Účast CD36, CD47 antigenů Vnější cesta indukce apoptózy představuje celou kaskádu jevů, které na sebe navazují. Jako hlavní molekuly této cesty jsou membránové receptory, které spouštějí vlastní apoptické procesy. Při indukci apoptózy vnější cestou nejprve dochází k navázání ligandu na receptory, které jsou označovány jako spouštěcí smrtící receptory. U těchto transmembránových molekul dochází pod vlivem ligandů k jejich trimerizaci, což vede k zesílení přenosu signálu. Vznik triméru vyvolává silnou signální transdukci, při níž se uplatňují intracelulární receptorové DD domény (DD = death domain ). Tyto smrtící domény, označované jako FADD u Fas/CD95 transmembránové molekuly a TRADD u TNFR-1/CD120 receptoru, podmiňují vazbu adaptorových molekul na intracelulární část jejich molekul, což se označuje jako amplifikace. Fas receptor (CD95) se vazbou na Fas ligand změní na signalizační komplex, který přes adaptorové molekuly aktivuje kaspázu 8 a kaspázu 10. Kaspáza 8 spouští aktivace dalších kaspáz, které vyvolávají nenávratně smrt buňky. Adaptorové molekuly způsobují uvolnění cytochromu C z mitochondrií, přičemž dochází nejen k aktivaci kaspázové kaskády, ale také k aktivaci transkripčních faktorů. Kaspázová kaskáda navozuje štěpení cytoskeletárních proteinů a vyúsťuje v degradaci jaderného materiálu provázenou fragmentací DNA. V této konečné fázi se objevují apoptózová tělíska, která mohou být zlikvidována makrofágy. Tabulka 2 schematicky podává představu návaznosti těchto jevů. informační magazín číslo 14-2010 11

Poměrně dobře je známo navození apoptózy přes CD95 membránový receptor, k čemuž jsou vytvořeny tři známé intracelulární cesty: 1) cesta využívající intercelulárního proteinu FADD a proenzymu kaspázy 8, 2) cesta využívající intracelulární proteiny RIP a RAIDD, které aktivují kaspázu 2, 3) cesta využívající intracelulární proteiny RIP a RAIDD, které aktivují amplifikační kaspázu 10. Kaspázy jsou tak hlavní enzymy v regulaci apoptózy. Tyto enzymy se přirozeně vyskytují v cytoplazmě buňky ve formě neaktivních prokaspáz, a tak jsou označovány jako latentní cysteinové proteázy. Je známo celkem 14 kaspáz (kaspázy 1 14), u lidí je pak popsáno 11 kaspáz, které mají vztah k ultrastrukturálním změnám buněk. Kaspázy jsou členy ICE rodiny cysteinových proteinas a mají hlavní úlohu v efektorové fázi. Kaspázy 2, 8, 9, 10 jsou tzv. signalizační, protože se mohou vázat na intracelulární část CD95/FAS receptoru. Tyto signalizační kaspázy aktivují další kaspázy 3 a 7 zahrnuté do vnější apoptotické cesty. Obrázek 1 podává vnější cestu apoptotického procesu. Lidské kaspázy lze rozdělit do tří skupin. Do skupiny 1 lze zahrnout kaspázy 1, 4, 5 a 12, které se přímo podílí na zánětlivém procesu. Do skupiny 2 lze začlenit kaspázy 2, 3, 7 mající hlavní podíl v poslední fázi apoptózy. Skupina 3 sdružuje kaspázy 6, 8, 9, 10 s velkou prodoménou, které jsou aktivovány jinými enzymy než kaspázami. Vnější cesta indukce apoptózy představuje jeden ze dvou hlavních klasických způsobů, jakými dochází k aktivaci apoptotických procesů, a to na základě interakce povrchových receptorových systémů buňky s příslušnými ligandy, event. průnikem spouštěcích enzymů přímo do cytoplazmy buňky. Proapoptickými signály jsou tedy faktory z vnějšího prostředí. Prvním z nich jsou enzymy (serinové proteinázy), které vnikají do cytoplazmy otvory tvořenými perforiny. Tyto otvory jsou vytvářeny v cytoplazmatické membráně mechanismy analogickými jako při aktivaci komplementu při ovlivňování buněčné homeostázy. Protein-kinázy jsou enzymy odpovědné za katalytický přenos fosfátové skupiny z ATP na příslušný protein. Ve většině případů se jedná o fosforylaci serinu nebo threoninu, a proto se označují jako serinobrázek 1: Základní představa indukce vnější cesty apoptózy threonin kinázy. Tyrozin kinázy způsobují také přenos fosfátové skupiny z ATP na proteinový tyrozin. Perforiny a granzymy (granzym B) jsou hlavní složkou granulí buněk NK a působí na buňku v průběhu cytotoxické reakce. Granzymy jsou následovně schopny aktivovat kaspázovou kaskádu prostřednictvím kaspázy 3 a kaspázy 7. Při indukci apoptózy vnější cestou je několik receptorů, které umožňují přenos signálu z vnějšího do vnitřního prostředí buňky. Buňka tak má k navázání ligandu různé membránové receptory označované jako Apo/Fas-1/CD95/, TNFR-1/CD120/, TRAILR1/CD261/, TRAIL-R2/CD262/ a TRAMP. Poměrně detailně je popsán proces aktivace receptorů Apo/Fas-1 a TNFR-1, které mají v intracelulární části molekuly smrtící domény. Po navázání ligandu dochází ke konformační změně C-konců těchto receptorů, které s cytoplazmatickými proteiny FADD a TRADD a jejich komplementárními doménami následně přímo vázají iniciační proteinázu kaspázové kaskády. Nejprve se do této dráhy zapojuje kaspáza 8, označovaná jako enzym FLICE, a to opět na principu vzájemné komplementarity. Doména TRADD spouští proteolytickou kaskádu stejným mechanismem až po další oligomerizaci za vzniku složitějšího komplexu: TNFαR-1 TRADD FADD. Proteiny FADD a TRADD jsou adapterovými proteiny vnější cesty indukce apoptózy. Klíčové spojení aktivovaných oligomerizovaných C-konců molekul Fas a TNFαR s kaspázou 8 a eventuelně kaspázou 10 vede k samoštěpení a tím i k aktivaci zmíněných proteináz a je nověji označováno jako DISC. Další děje zahrnují aktivaci amplifikační kaspázy 1 a výkonných proteináz (kaspáza 3, 6, 7, 9), štěpení cytoplazmatického regulačního proteinu Bid (člen rodiny proteinů Bcl-2, dále viz. regulace apoptózy) s následným uvolňováním proapototických působků z mitochondrií (viz. vnitřní cesta indukce apoptózy) a v neposlední řadě i aktivaci sfingomyelinázy štěpící membránové sfingomyeliny za vzniku ceramidu. Ceramid se mimo jiné patrně podílí na chemické degradaci mitochondriální membrány a na aktivaci proteináz. Těmito mechanismy jsou schopny působit zejména buňky NK a cytotoxické lymfocyty T, zvláště ty, které jsou aktivované IL2 a hojně syntetizují FasL a TNFα. Na vyvolání apoptózy se mohou podílet i steroidy prostřednictvím steroidních receptorů a extracelulární matrix pomocí rozpustných integrinů. Indukce apoptózy je relativně složitý mechanismu, na kterém se podílejí nejrůznější buňky a jejich molekuly. Také jejich koncentrace jsou nezanedbatelné, což je podstatné i pro navození apoptózy některými farmaky. Molekula AIF vyvolává apoptózu nezávislou na kaspázách. 2) Vnitřní cesta indukce apoptózy Vnitřní cesta apoptózy je zaměřena na vnitřní prostředí buňky, to znamená, že při indukci apoptózy touto cestou nedochází k navázání ligandu na smr- 12 informační magazín číslo 14-2010

Obrázek 2: Mitochondriální mechanizmus navození programované smrti buněk tící receptory, jako je tomu u vnější cesty indukce apoptózy. Vnitřní cesta indukce apoptózy je vázaná na mitochondrie, kde probíhá buněčné dýchání. Aktivátory této cesty jsou signály z vnitřního prostředí buňky, což mohou být různé buněčné metabolické změny, nedostatek živin, volné radikály, anoxie, působení cytostatik nebo zvýšený obsah vápníkových iontů. Vnitřní cesta indukce apoptózy nastává, jestliže se buňka dostává do stresových podmínek třeba při zvýšené radiaci, teplu či infekci virovými partikulemi. Buňka tak má na základě vlastního rozhodnutí mechanismus, který jí umožní provést apoptózu. Nejčastěji však na počátku vnitřní cesty stojí poškození DNA a následná aktivace proteinu p53, která může probíhat třemi hlavními způsoby. Společným rysem všech tří mechanismů je narušení rovnováhy mezi produkcí a degradací proteinu p53 vedoucí k jeho kumulaci v buněčném jádře a transkripční aktivitě. U klidové buňky je konstitutivní produkce proteinu p53 následována jeho degradací za vytvoření rovnovážného stavu s velmi krátkým biologickým poločasem proteinu p53. Degradace probíhá za normálních okolností prostřednictvím degradačního aparátu buňky pro proteiny, tj. proteazomem. Pro rozpoznání nepotřebné bílkoviny určené k degradaci proteolytickým aparátem je nutné, aby byla označena krátkým peptidem tzv. ubikvitinem, který se váže na protein p53 díky svému hlavnímu regulačnímu enzymu (proteinu MDM2). Inhibice enzymu MDM2 je prvním ze zmiňovaných aktivačních dějů. Další dva děje pak zahrnují aktivaci kináz (kasein-kináza II a kinázy Chk2) vedoucí k fosforylaci proteinu p53. Aktivovaný protein p53 se oblastí přiléhající k C-konci, bohatou na bázické aminokyseliny, váže na DNA ve specifických regulačních oblastech a indukuje transkripci příslušných genů. Zároveň je schopen katalyzovat renaturaci DNA a prostřednictvím protein-proteinových interakcí ovlivňovat syntézu DNA a její reparaci. Zároveň způsobuje, že jsou v buňce prokazatelně zvýšené hladiny jím indukovaných transkriptů proteinu p21, proteinů Bax a tzv. PIGs proteinů, přepisovaných prostřednictvím asi 10 genů indukovaných proteinem p53. PIGs proteiny jsou produkovány v buněčných mitochondriích. Účastní se oxidativní degradace širokého spektra cytosolových a strukturních molekul, zejména mitochondriálních membrán, a také se uplatňují při tvorbě oxidativního stresu. Jejich aktivita je detekovatelná měřením poklesu koncentrace intaktních mitochondriálních membránových fosfolipidů, zejména kardiolipidů v buňce. Obrázek 2 podává velmi zjednodušujícím způsobem představu vnitřní apoptotické cesty. V souvislosti s poškozením mitochondrií je v současné době diskutován další problém, a to redukce mitochondriálního membránového potenciálu ψm, což je vlastně první ireverzibilní krok v nastartování apoptózy vnitřní cestou. K vyjasnění těchto problémů může napomoci pochopení aktivace porinů, tvorba homopolymerů mitochondriálních molekul, působení kaspáz, ceramidu, volných radikálů a rozštěpeného proteinu Bid, které se nepochybně podílejí na utváření vnitřní cesty. Zde nelze opomenout i zvýšení permeability mitochondriálních membrán, zejména vnější, které je spojeno s únikem aktivních složek z mitochondriální matrix, resp. z intermembránového prostoru. Jedná se o faktor AIF, cytochrom C, další volné kyslíkové radikály, kalciové ionty a regulační protein Smac/DIABLO. Jejich vliv na děje v buňce je široký. Např. AIF je spojován s kondenzací jaderného chromatinu a s fragmentací DNA a zřejmě i s aktivací kaspáz. Aktivovaná kaspáza 9 je iniciační proteinázou vnitřní cesty a za adapterový protein je považován Apaf-1. Aktivace kaspázy 9 nespočívá v jejím samoštěpení (jako u kaspázy 8) či štěpení jiným enzymem, ale probíhají při tom různé konformační změny celého následujícího komplexu apoptozómu složeného z cytochromu C, Apaf-1, datp a kaspázy 9. Vnitřní cesta se někdy dělí zvlášť na cestu mitochondriální (na počátku dochází k poškození mitochondriálních membrán) a na samotnou cestu proteinu p53. Je zřejmé, že role mitochondrií je klíčová nejen pro vnitřní, ale i vnější cestu apoptózy. Morfologické změny u apoptózy Průběh apoptózy lze pozorovat nejlépe pod elektronovým mikroskopem na vhodném materiálu, což mohou být i buňky buněčných linií, které mají definované vlastnosti. Morfologické změny u apoptózy jsou provázené změnami v buněčném jádře, kdy se jádro svrašťuje a chromatin zhušťuje a shlukuje do chomáčků a poté se usazuje v tlustých pruzích na obalu jádra. Tyto změny jsou provázeny fragmentací DNA v podobě velkého množství pravidelných úseků. Mnohočetná přerušení dvoušroubovice DNA, která nelze opravit, tak vedou k zamezení transkripce. Nápadné změny nacházíme i v cytoplazmě, kde se objem buňky zmenší. Buněčná membrána se tak scvrkává a vytvoří se na ní výběžky. Tento jev, který je u apoptózy mnohem nápadnější než u nekrózy, se nazývá zeosis. Při apoptóze se organely nikterak morfologicky nemění a také buněčný osmotický gradient je udržován. Buňka v apoptóze zesiluje membránu, aby zabránila nebezpečí lýzy aktivací vlastních enzymů (např. transglutaminázy). Při těchto procesech tak dochází k hlubokým změnám v cytoskeletu buňky, včetně nabobtnání cisteren endoplazmatického retikula. Buňka nemá žádnou zánětlivou reakci, jako je tomu u nekrózy, a tak lze v konečné fázi pozorovat kolaps buněčného jádra a fragmentaci buňky vytvářením apoptózových informační magazín číslo 14-2010 13

tělísek. Odstranění apoptózových buněk nebo jejich tělísek se děje pomocí makrofágů, i když i jiné buňky (epitelové, nádorové) se na likvidaci mohou podílet. Zřejmě jsou tyto jevy velmi efektivní, avšak velmi obtížně pozorovatelné pod mikroskopem. Uvádí se, že fagocytující buňka může různými způsoby zprostředkovávat odstranění nežádoucích buněk, a to pomocí celé řady molekul a u různých buňek. Transmembránový glykoprotein (CD36), vázající trombospondin a kolagen I, IV, a V, se podílí na fagocytóze apoptotických buněk zahrnujících různé typy normálních (třeba buňky ve vnějších segmentech oka, pankreatické β buňky) a infikovaných buněk (např. Plasmodium falciparum). CD47 antigen se může podílet na kaspáze nezávislé buněčné smrti u celé řady buněk zahrnující aktivované T buňky, makrofágy, dendritické buňky a i různé nádorové buňky. Receptor se váže na signální regulační protein α (SIRPα) a zabraňuje fagocytóze vlastních krevních buněk. Na utváření buněčné morfologie, cytoskeletární organizace, jako i vytvoření apoptotických drah se podílí celá řada rozpustných molekul, z nichž některé ještě nejsou známé. Regulace apoptózy Studium regulačních mechanismů apoptotických procesů je zásadním krokem k dalším možnostem jejich praktického využití. Tady se nejedná o pouhé snahy vedoucí k prodloužení lidského života, ale o poznání jednoho ze základních mechanismů, který je pro rovnováhu všeho živého na této zemi vytvořen. Životnost organismů v dlouhém evolučním vývoji byla vzájemně utvářena, což se promítalo i do jejich genetického programu. Je třeba si uvědomit, že kdyby jednotlivé organismy na naší planetě přežívaly neskutečně dlouho, vedlo by to k závažným důsledkům. Někteří jedinci by na této planetě žili nekonečně dlouho, zatímco jiní by zde byli velmi krátce, tudíž by ani nemohli být využitelní v potravním řetězci. Na apoptózu se lze dívat i z hlediska jejího mezidruhového evolučního utváření. Vlastně se jedná o křehký mechanismus umožňující sounáležitost všeho živého. V poslední době má člověk snahu do těchto mechanismů zasahovat, ať už v pozitívním či negativním slova smyslu. Apoptózu by chtěl využít k likvidaci nežádoucích nádorových buněk a také k zastavení fyziologické likvidace buněk, které jsou pro život stále žádoucí. Proto se uvažuje o regulaci jak vnější cesty, tak regulace vnitřní cesty na bázi regulačních proteinů, které ve svých mechanismech působí jednak přímo (kaspázy, Bcl-2) a jednak nepřímo (p53, Bcl-2). Snaha využít apoptitických mechanismů je tak pozitivní, ale i negativní. I když se jedná o relativně složitý vzájemně provázaný mechanismus, cesty navozující apoptózu či cesty naopak zabraňující apoptóze jsou relativně známé. Kromě řady faktorů indukujících apoptózu byly identifikovány také faktory, které naopak apoptóze zabraňují. Anti-apoptické ligandy jsou např. některé růstové faktory, které působí přímo na inhibici kaspáz nebo brání jejich aktivaci. V těchto případech může být uvedena Akt serin/threonin-proteinová kináza, která inhibuje pro-apoptické členy Bcl-2 rodiny, dále faktor Bad nebo přímo kaspáza 9. Je zajímavé, že TNFα má i kromě pro-apoptického efektu za určitých okolností účinek anti-apoptózový tím, že aktivuje transkripční faktor NF-κB, který indukuje expresi IAP, což je inhibitor kaspázy 3, 7 a 9. Jsou popsány tři hlavní proteinové rodiny, které nejkomplexněji regulují apoptózu: 1) Bcl-2, 2) Bax (Bax, Bak, Bok, Bik, Hrk, Bad), 3) BH-3. Regulace apoptózy pomocí Bcl-2 rodiny je poměrně známá. Do této rodiny se zahrnují zástupci jako Bcl-2 protein, Bcl-Xl, Bcl-W, kteří vytváří nefunkční heterodiméry s adaptorovými proteiny (Apaf-1, TRADD, FADD). Tyto molekuly regulují hladinu intracelulárního kalcia, regulují membránový potenciál u mitochondrií a inhibují únik cytochromu C. Předpokládá se, že program přirozeného zániku buněk je zakódován v určitých genech. Kandidátem tohoto genu může být kupříkladu protoonkogen c-myc, který reguluje možnost diferenciace buňky anebo její apoptózu. Předpokládá se, že exprese onkogenu c-myc (z protoonkogenu) je nemorální a nepřítomností dalších mitogenních stimulů dochází k aktivaci sebevražedného programu buňky. Tumorový supresorový gen p53 je také dáván ve vztah s apoptózou. Genový produkt zastavuje proliferaci buňky a udržuje ji v G1-fázi buněčného cyklu, aby mohlo být eventuální poškození genetického materiálu buňky při mutaci odstraněno. Nedojde-li k nápravě, nastoupí sebevražedný program. Dalšími geny, jejichž alternace může spustit apoptózu, jsou gen Fas a onkogen Bcl-2. Apoptóza se také výrazným způsobem uplatňuje při udržování kvantitativních poměrů hematopoetických buněk, pro které v obvodové krvi a kostní dřeni existují diferenciální hodnoty. Tato regulace normálních fyziologických pochodů je nezbytná pro vyváženost jednotlivých buněčných populací, a tak se na jejím udržení podílí několik mechanismů. Intracelulární degradace proteinů K odstranění poškozených či degradovaných nebo vadně uspořádaných proteinů, stejně jako k likvidaci regulačních proteinů s krátkou životností jsou vytvořeny dva hlavní proteolytické systémy: a) Degradace intracelulárních proteinů pomocí kalpainů Kalpainy jsou cysteinové proteázy aktivované Ca 2+, které mají společnou podjednotku o 30 kda a isoformně specifickou katalytickou podjednotku o 80 kda. Velká podjednotka kalpainu I (m-isoforma) je aktivována mikromolární (mmol/l) koncentrací Ca 2+, zatímco kalpain II (m-isoforma) je aktivována milimolární (mmol/l) koncentrací Ca 2+. Navození buněčného stresu vede k více nebo méně výraznému vzestupu intracelulárního Ca 2+, a tím k trvalé aktivaci kaplainů. Konečné stadium dráhy buněčného zániku, navozené excitotoxickými sloučeninami v nervovém systému, vede k jejich proteolýze zprostředkované kalpainy. b) Degradace intracelulárních proteinů prostřednictvím ubikvitin-proteázomové dráhy Tento systém působí u řady buněk při metabolickém obratu intracelulárních proteinů. Má hlavní roli při degradaci regulačních a krátkodobých proteinů, což je důležité pro regulaci řady základních buněčných procesů, jako je cyklus dělení, modulace membránových receptorů nebo iontových kanálů, prezentace a příprava antigenu. V tomto proteolytickém systému se uplatňuje enzymová kaskáda, která je tvořená mnohočetnými molekulami ubikvitinu kovalentně vázaných k proteinovému substrátu. Tato ubikvitinová modifikace směruje proteiny připravené k destrukci za 26S-proteázomovém komplexu, kde dochází k vlastní degradaci. Některé choroby, u nichž dochází k apoptóze specifických buněk Fenomén apoptózy se promítl do patofyziologie a patogeneze některých chorob, a to ve snaze o jeho využití v podstatě dvěma způsoby: 1) zamezení apoptotického procesu při likvidaci 14 informační magazín číslo 14-2010

specifických buněk nutných k přežívání organismu, 2) likvidace nežádoucích (nádorových) buněk apoptotickým procesem k prodloužení života. První přístup se týká neurodegenerativních chorob (např. Huntingtonovy choroby, Alzheimerovy choroby, Parkinsonovy choroby) a prionových chorob, druhý přístup se týká širokého spektra nádorových chorob ve snaze zamezit nekoordinovanému bujení. Apoptóza u různých chorob V literatuře jsou popsány různé choroby, které jsou dávány do souvislosti s apoptózou. Tato onemocnění by se dala vymezit jako choroby, které jsou zapříčiněny nedostatečnou apoptózou, a choroby, u nichž je naopak vyvinuta nadměrná apoptóza. Dále pak lze vyčlenit nemoci, u kterých se více uplatňuje vnější cesta nebo naopak vnitřní apoptotická cesta. Nedostatečná apoptóza může zamenat, že v organismu dochází ke vzniku nádorového bujení nebo ke vzniku autoimunitních chorob, jako je revmatoidní artritida. Z literárních poznatků vyplývá, že nedostatečné projevy apoptózy se mohou uplatňovat u autoimunitního lymfoproliferativního syndromu (Canele-Smithův syndrom), diabetu mellitu typu 1, Gravesově chorobě, hypereosinofilním syndromu, Hashimotově strumě, leukemie, lupus erythrematodes, u různých lymfomů, osteoporóze, některých solidních nádorů a také u vývojových vad. Nadměrná apoptóza může být dána do souvislosti také s celou řadou chorob. Příkladem může být AIDS, aplastická anémie, Hashimotova struma, diabetes mellitus typu 1, chronická neutropenie, ischemie, lupus erythematodes, myelodysplastický syndrom, roztroušená skleróza, některá selhání jater, spinální svalová atrofie, ulcerózní kolitis a široké spektrum vývojových vad jako např. Wilsonova choroba. V patofyziologii různých krevních malignit (MDS, různé typy leukemií) je apoptóza natolik závažná, že je enormní snaha ji využít k zbavení leukemických buněk a nastolení normálních fyziologických hodnot. Za zvláštní zmínku stojí průběh apoptózy u různých degenerativních neurologických poruch, a proto jim budou věnovány následující poznámky. Apoptóza u neurodegenerativních chorob Při hledání nových přístupů pro léčení neurodegenerativních chorob je identifikace antiapoptotických faktorů pro přežívání nervových buněk logickým předpokladem. Mezi tyto transkripční faktory patří CREB (camp-dependentní vazebný protein) a CREM (camp-response modulátory protein), které podporují přežívání nervových buněk během vývoje a přetrvávají i v dospělosti. U Huntingtonovy choroby dochází k dysregulaci signální dráhy, která aktivuje rodinu CREB transkripčních faktorů (CREB, CREM a aktivačního transkripčního faktoru 1-ATF1), což u neuronů vede až k jejich zániku. Přežívání nervových buněk je tak pod vlivem transkripčních faktorů uplatňujících se v signálních cestách Ras/MAPK, Ca 2+ /CaMK, PI3/Akt a camp/pak. Jejich narušení ovlivňuje zásadním způsobem životnost funkčních pochodů mozkových buněk v příslušných segmentech u nemocných s Huntingtonovou chorobou. Alzheimerova choroba patří do skupiny progresivních demencí začínající častěji u žen než u mužů, a to zhruba po jejich šedesátém roce života. U této choroby se nejdříve projevuje charakteristická porucha kongitivních funkcí mozku (zapomínání, postupná ztráta paměti, ztráta osobní i sociální závislosti) bez postižení motorických a senzorických projevů. Jde o degenerativní proces zasahující populaci neuronů korových oblastí mozku (entorhinálního kortexu, hippokampusu), především pak temporálního, frontálního a parietálního laloku. Motorický a primární senzorický kortex, stejně jako bazální ganglia a mozeček, zůstávají zpočátku nedotčeny. Histologicky postižené neurony obsahují v cytoplazmě neurofibrilární smotky složené z párových helikálních fibril viditelných při specifickém barvení. Nejvýraznější anatomickou změnou jsou však amyloidové pláty, složené z fragmentů neuronů obklopující malé denzní jádro amyloidového materiálu. Na patogenezi Alzheimerovy choroby se podílejí jak genetické, tak envirometrální faktory. Je zajímavé, že u pacientů s izoformou apoliproteinu E Apo-4, je častější výskyt, podobně jako je tomu u nemocných s Downovým syndromem. U některých pacientů s familiárním výskytem byl identifikován gen pro presenilin-1(ps-1) na chromozomu 14 a také gen pro presenilin 2 (PS-2) na chromozomu 1. Mutace v PS-1 byly specificky sdruženy se zvýšenou produkcí peptidu Aβ(42), který velmi podporuje apoptózu postižených neuronů tím, že destabilizuje β-katein, tj. složku signálního komplexu PS-proteinu. Další gen označovaný jako APP byl nalezen na chromozomu 21. U těchto genů se uvádí autozomálně dominantní přenos. Mimoto jsou popsány i další geny, které zvyšují riziko výskytu (ε4 varianta Apo E, dále mutace genu pro α 2 -makroglobulin, gen pro komponentu 2-oxoglutarátdehydrogenázy, k-varianta butytylcholinesterázy a několik mitochondriálních genů). Vlastní patogeneze Alzheimerovy choroby nebyla dosud plně objasněna, a tak přistupují 2 hlavní hypotézy: a) hypotéza amyloidové kaskády, jež zvyšuje postupné neurodegenerativní změny, které vedou k abnormální degeneraci prekurzového proteinu amyloidu b (APP), b) hypotéza degenerace cytoskeletu neuronů, kdy fibrilární depozity narušují mikrotubuly cytoskeletu nervových buněk (agregace abnormálně). Parkinsonova choroba je nejčastější forma degenerace motorického systému a druhá nejčastější forma neurodegenerativních chorob. V klinickém obraze je akinéze, rigidita a klidový třes. Histopatologický nález je charakterizován degenerací neuronů obsahujících neuromelanin v mozkovém kmeni, zvláště v pars compacta substantia nigra, a přítomností eosinofilních inkluzí (Lewyho tělísko). Klinické příznaky se objeví, až když vymizí asi 80 % dopaminu v corpus striatum. Etiologie Parkinsonovy choroby je multifaktorální s genetickou predispozicí. Účinek toxických látek v prostředí a vyšší věk jsou faktory navozující začátek onemocnění i jeho progresi jak pro hereditární, tak pro sporadickou formu. Hereditární forma může mít charakter autozomálně dominantní. Je kódovaná mutacemi v α-synukleinovém genu nebo autozomálně recesivní, způsobená mutacemi v Parkin genu na chromozomu 6, jiné autozomálně genetické formy se odvozují od mutací genu pro ubikvitin-karboxyterminální hydrolázu L-1 nebo od mutací na chromozomech 2 a 4. U sporadické formy může být spouštěcím mechanizmem úraz, virová infekce, expozice vůči manganu nebo neurotoxinům. Prionové choroby Prionové choroby jsou v podstatě neurodegenerativní choroby známé také jako přenosné spongiformní encefalopatie, do kterých lze zahrnout u lidí Creutzfeldt- informační magazín číslo 14-2010 15

Jacobsova chorobu, Gerstmann-Staussler-Schenkerův syndrom, fatální familiá r- ní izomnie, u hovězího dobytka bovinní spongiformní encefalopatie, u ovcí scrapii (klusavku) a u jelenů onemocnění chronickou sešlostí. V historickém nálezu se popisuje, že spongiformní degenerace, astrocytóza, úbytek neuronů a progresivní akumulace amyloidových plátů obsahujících prionový protein jsou ve vztahu k rezistenci vůči proteázám. Také se uvádí, že tyto choroby mohou mít hereditární, sporadický nebo infekční charakter. Název priony je zkratka pro proteinaceous infectious particle. Endogenní (normální) prionový protein se označuje jako PrP C (neboli PrP sen senzitivní na degenerační účinek proteáz), jeho modifikovaná (patologická) forma PrP Sc (neboli PrP res resistentní vůči degeneraci proteázami) je infekční agens; PrP geny jsou odpovědné za dědičné projevy. Prionový protein je přirozený protein, který je po syntéze transportován do buněčné membrány, kde je zakotven prostřednictvím glykosylfosfatidylinositolu. Prionový protein je exprimován v mozkových buňkách a je přítomen ve vysokém množství na synapsích. Funkce PrP není ještě plně objasněna, ale uvažuje se, že se uplatňuje při utilizaci Cu do presynapsí, protože PrP-Cu komplex hraje svojí antioxidační aktivitou klíčovou úlohu v homeostáze synapsí. Patogenéze prionového proteinu, tj. rozdíl mezi PrP c a PrP Sc nespočívá ve změnách v sekvenci aminokyselin nebo v odlišné glykosylaci, ale v konformační změně sekundární struktury. PrP c je tvořena ze 40 % α-helixem se dvěma velmi krátkými úseky s uspořádáním β-formy skládaného listu, naproti tomu PrP c je uspořádána ze 45 % jako β-forma skládaného listu, čímž dostává roztažený tvar, který je stabilní, nerozpustný. Agregáty prionových proteinů se nalézají často (nikoliv vždy) v mozku jedinců s prionovými chorobami. Prionové plaky se objevují ve 3 typech jako unicentrické (jedno kompaktní jádro), multicentrické (dvě nebo více jader) a difúzní (bez ohraničeného centrálního jádra). Priony mají jedinečnou vlastnost a to takovou, že jsou schopny replikace bez nukleových kyselin. Při infekci (naočkování) hostitele PrP Sc dochází ke specifické interakci PrP C, který získává charakter patologického PrP S. Tato konverze se vykládá dvěma mechanizmy. Jedna z hypotéz konverze za asistence templátu to vysvětluje termodynamicky mnohem stabilnější molekulovou formu PrP Sc, než je hostitelský PrP C ; je zde však kinetická bariéra pro tvorbu PrP C. PrP C ale existuje v ekvilibru s přechodným konformačním stavem (označovaným jako PrP*), který musí interagovat s celulárním chaperonem (protein X) předtím, než dojde k heterodimerizaci s PrP Sc. Po této interakci dochází v dimeru ke spontánní přeměně PrP C na PrP Sc. Nově vytvořený homodimer disociuje na 2 PrP Sc -proteiny schopné působit jako templáty, a to exponenciální rychlostí. Identifikace proteinu X je proto středem zájmu při hledání způsobu jak této interakci zabránit. Druhá hypotéza známá jako nukleačně polymerizační model předpokládá, že PrP C a PrP Sc koexistují v roztoku v rovnovážném stavu. Monomer PrP Sc je však nestabilní a stává se stabilním až po interakci s druhým PrP Sc. Touto cestou PrP Sc -agregáty podporují konverzi PrP C na PrP Sc a posunují tak ekvilibrum na stranu PrP Sc. Při hledání možných léků prionových chorob se ukázalo, že konverzi PrP C na PrP Sc brání tricyklická antidepresiva, chinakrin a chlorpromazin, dále ftalocyaniny, deriváty porfyrinů, větvené polyaminy. Jiná možnost jsou specifické protilátky, které by narušily konverzi PrP C na PrP Sc nebo látky blokující β-receptor pro lymfotoxin v lymfonukleárním systému. Stárnutí buněk S postupujícím věkem se u většiny organismů objevují funkční i morfologické změny téměř ve všech orgánech a tkáních. Tyto změny probíhají v intracelulárním prostoru za zvýšené syntézy některých strukturálních proteinů a enzymů a také v mitochondriích, kde se postupně snižuje kapacita oxidační fosforylace. V buňce se zvyšuje počet mutací v genetickém materiálu. Stárnoucí buňky mají sníženou potřebu množství živin, protože jejich proliferace a metabolismus již nejsou tak dynamické. Stárnoucí buňky vykazují také sníženou schopnost opravovat poškozené chromozomy. U těchto buněk lze pozorovat morfologické změny, kdy se jádro stává abnormálně laločnaté a nepravidelné, dochází k pleomorfní vakuolizaci mitochondrií a ubývá endoplazmatického retikula. Uvádí se, že v buňkách se hromadí lipofuscin, což je produkt lipidové peroxidace. Příčiny stárnutí buněk jsou multifaktoriální, kdy v endogenním molekulovém programu stárnutí narůstá vliv exogenních škodlivých faktorů. Přibývající věk tak snižuje životaschopnost buněk. Dlouhověkost je specificky regulována i na genové úrovni řídící opravný mechanizmus DNA nebo antioxidační obrany. Soudí se, že některé geny podmiňující dlouhověkost mohou souviset s genetickým polymorfismem protektivních alel lipidového metabolismu. U dlouhověkých lidí byla nalezena prevalence genetického polymorfismu genu paraoxonázy na kodónu 192. U některých patologických buněk je počet dělení téměř nekonečný, ale u jiných je přísně limitován. Jako příklad může být uvedena buněčná kultura normálních lidských diploidních fibroblastú, kde se proliferace zhruba po 50-ti buněčných děleních zastavuje. Buňky pacienta s progerií nebo Wernerovým syndromem (způsobující předčasné stárnutí) mají značně omezenou životnost in vitro. Nádorové buňky a některé buňky buněčných linií proliferují neomezeně, jsou tak vlastně nesmrtelné. Vysvětlení tohoto replikačního stárnutí není zatím jasné, ale poukazuje na možnou plastičnost životních pochodů. Uvažuje se, že existuje několik různých mechanizmů od aktivace genů pro stárnutí na chromozomu 1 a 4, přes alteraci nebo ztrátu genů (c-fos nebo Rb-gen) pro regulaci buněčného růstu až po indukci inhibitorů buněčného růstu. Nelze opomenout další příčiny jako je zkracování telomér. Teloméry jsou zásadním stabilizačním faktorem terminální části chromozomu, které jej ukotvují k nukleární matrix. Bylo pozorováno, že délka telomer se zmenšuje po mnohonásobných pasážích in vitro a dále v buněčných kulturách od pacientů v pokročilém věku. Teloméry jsou nejdelší u spermií a většinou jsou u fetálních buněk delší než u buněk dospělých jedinců. Jejich obnovování je katalyzováno enzymem telomerázou, přičemž délka telomér koreluje s obsahem telomeráz. Z toho důvodu se předpokládá, že úbytek DNA od konce chromozomů při zkracovaní telomér, vede k deleci nezbytných genů, což je dáváno do souvislosti s omezením života buněk. Stárnutí buněk z hlediska těchto poznatků je natolik významné, že byla Nobelova cena za lékařství a fyziologii v roce 2009 udělena třem vědcům E. H. Blackburnové společně s C. Greiderovou a J. Szostakem. Autorky popsaly, že enzym telomeráza brání zkracování telomér, což tedy prodlužuje stárnutí buněk. U nádorových buněk je telomeráza aktivní, což vede k pokusům zastavit činnost telomerázy a tím vlastně k eliminaci dělení nádorových buněk. Z poznatků o získaných defektech v průběhu stárnutí vyplývají další teorie. Jedna z nich je teorie progresivního poškozování buněk reaktivními formami kyslíku a dusíku v průběhu života. To se dává do souvislostí s nepříznivými vlivy z okolí, jako je ionizující záření, a se snižující se kapacitou antioxidačního mechanizmu (vitamin E, glutathionreduk- 16 informační magazín číslo 14-2010

táza). Nahromadění lipofuscinu je jedním z projevů lipoperoxidace. Samotný lipofuscin není pro buňku toxický, ale lipoperoxidace poškozuje nukleové kyseliny. Bylo prokázáno, že reaktivní formy kyslíku způsobují denně alteraci 10 000 bází DNA v jedné buňce, což převyšuje možnosti opravného mechanizmu, jehož kapacita se s narůstajícím věkem snižuje. Mutace se hromadí v jaderné DNA, ale také v mitochondriální DNA, a to se zvyšujím se věkem. Poly (ADP-ribosylace) nukleárních proteinů katalyzovaná poly (ADP-ribosa) polymerázou (PARP-1) (s NAD + jako substrátem) je post-translační děj ovlivňující DNA šroubovici, což má vliv na nestabilitu genomu způsobovanou endogenními i exogenními genotoxiny. S věkem stoupají i jiné post-translační modifikace intracelulárních a extracelulárních proteinů, což vede k funkčním i morfologickým změnám. Jednou z nich je neenzymová glykace proteinů a vznik konečných produktů pokročilé glykace (AGE-products). Ty mohou vytvářet příčné spoje se sousedními molekulami. Tyto změny pravděpodobně hrají významnou roli v patogenezi mikrovaskulárních změn u diabetu mellitu. Podstatou stařeckých očních zákalů je také glykace proteinů čočky. Dalším momentem, který se podílí na stárnutí buněk a zkracování jejich životnosti, jsou změny v indukci proteinů tepelného šoku ( heat shock proteins ), zvláště Hsp7O. Tyto proteiny jsou velmi důležitým obranným mechanizmem vůči různým formám nadměrné zátěže. Se stárnutím souvisí i protein sirtuin (Sir2). Byl prokázán ve většině živých buněk, kde se podílí na regulaci získávání energie. Rodina Sir2-proteinů udržuje úseky chromozomů v inaktivním stavu působením na histony obklopující DNA, takže není přístupná mechanismu,,čtení. Restrikce tvorby energie prostřednictvím tvorby acetyl-coa (tedy ze sacharidů a tuků), který aktivuje reakci s citrátem Krebsův oxidační cyklus, prodlužuje u experimentálních zvířat délku života. Ztráta elasticity kůže, pomalé hojení ran a svalová atrofie souvisejí s aktivitou genu FoxM1B umístěného na chromozomu 12. Když tento gen chybí nebo je vyřazen z funkce, DNA buňky se nemůže duplikovat, buněčný cyklus se zastavuje, buňka nemůže proliferovat, vyzrávat a zaniká. Děje se tak pravděpodobně prostřednictvím proteinu p2lcipl, který aktivuje řadu procesů blokujících duplikaci DNA a naopak aktivuje geny spojené s chorobami vyššího věku. Laboratorní přístupy k analýze apoptózy Fenomén apoptózy vstoupil do celé řady oborů, jako jsou imunologie, genetika, onkologie, hematologie, biochemie, morfologie, gerentologie či experimentální biologie a medicína. Pro tyto obory již existuje velké množství poznatků, ale stále je mnoho témat, která vyžadují řešení. Fenomén apoptózy je v základních rysech velmi dobře popsaný, přesto však zůstává řada otázek nezodpovězených, což bude vyžadovat nutně další studie. Je více než dobré, že k řešení přistupují i nabídky jednotlivých firem, takže máme v součastné době k dispozici jednotlivé nástroje a produkty, pomocí nichž lze dále tento geneticky determinovaný fyziologický proces analyzovat. K odlišení apoptózy od nekrózy jsou například k použití laboratorní sety, které umožňují relativní kvantifikaci buněčné smrti. Rozlišení apoptotické buňky od nekrotické je možné provést s vysokou citlivostí, a to až za vyhodnocení 600 buněk v jednom vzorku. Mimo to je možné sledovat také rozštěpení DNA. Děje se tak průkazem fragmentace DNA, a to přímo v apoptických buňkách, která předchází nejméně 4 hodiny před jejich definitívním zánikem. V tomto testu se měří poměr nízkomolekulové cytozolové DNA k vysokomolekulové DNA. Testování je zaměřeno na poznatek, že molekula DNA o nízké hmotnosti se u apoptózy zvyšuje oproti molekule DNA o vysoké hmotnosti, což je princip testu Cell Death Detection ELISA kit. Velmi spolehlivá metoda k detekci apoptózy v analýze fragmentace DNA je pomocí elektronového mikroskopu. Molekul, které je možné prokazovat v apoptotických pochodech, je celá řada, proto je nutné se zaměřit na to, co má být sledováno zda membránové receptory, intracelulární molekuly či analýza DNA u daných buněk. Některé membránově vázané molekuly navozující buněčnou smrt podává tabulka 3. Ke sledování těchto otázek je již také vytvořeno velmi široké laboratorní zázemí. Některé tyto antigeny jsou zařazovány do tz. CD nomenklatury, a tak není opomenuto ani v tomto článku jejich CD označení. Při praktickém studiu apoptózy je snaha se zaměřit na testování DNA. Metoda single cell gel electrophoresis assay (Coment Assay TM ) je založena na skutečnosti, že denaturované naštěpené fragmenty DNA účinkem elektrického proudu migrují ven z apoptotické buňky, zatímco nefragmentovaná DNA v buňce zůstává. Průkaz apoptózy spočívá v detekci specifického tvaru: ocas komety je patrný ve fluorescenčním mikroskopu po obarvení fluorescenčním barvivem. Princip metody TUNEL ( Tdt-mediated dutp-biotin nick end labelling ) využívá enzym terminální deoxynukleotidyl transferázu, který se naváže na 3 OH konce DNA označené biotinylovaným dutp, který se deteguje pomocí streptavidin peroxisasy a vizualizuje DAB (diaminobenzidinem). Tato metoda slouží k detekci začáteční a střední fáze apoptózy, i když deteguje také nekrotické buňky. Metodu ISNTA ( in situ nick translation assay ) lze použít ke stanovení pozdní apoptotické fáze. Pomocí DNA-polymerázy je možné prokazovat zlomy v DNA. Intenzivnější značení buněk znamená více zlomů, pozdější apoptotickou fázi a také zvýšený počet zlomů v molekule DNA. Některé testy (např. GEArray Focused DNA Microarray) se doporučují nejen k ověřování apoptózy u neurodegenerativních chorob, ale mají i širší možnosti využití. Na ÚHKT jsme se také okrajově zaměřili na využití apoptózy při studiu leukemického procesu, protože představa odstranění leukemických buněk tímto způsobem je víc než lákavá. V těchto studiích se podařilo Dr. K. Koubkovi připravit MP proti ceramidu, který je zahrnut do mechanizmů apoptózy (1, 2). Funkce cukerného epitopu (ceramidu), který se vyskytuje jednak na povrchu buněk a jednak v cytoplazmě, není v mechanizmech apoptózy zcela vyjasněna. Předpokládá se, že působí jako druhý poslíček, který může aktivovat určité kinázy. Tato protilátka proti ceramidu, vedle jejiho uplatnění v diagnostice metabolických poruch, tak může přispět i v detailnějším pochopení jednotlivých apoptických drah. Mimo to, Dr. Stockbauer vyvinul MP, která prokazuje antigen na povrchu buněk a může být ve vztahu k mechanizmu navozujícího buněčnou smrt (3). Některé komponenty apoptózy AIF ( Apoptosis Inducing Factor ) AIF, stejně jako cytochrom c, se nalézají v mitochondriích, odkud se při indukci apoptózy dostávají do cytoplazmy, kde aktivují kaspázovou kaskádu. Jeho únik do cytoplazmy inhibuje protein Bcl-2. Apaf-rodina ( Apoptosis protease activating faktor ) Jedná se o homologní proteiny, které jsou zahrnuty do ced-rodiny. Apaf-3 je vlastně kaspáza 9, Apaf-2 je cytochrom c, který aktivuje komplex Apaf-1 s Apaf-3. informační magazín číslo 14-2010 17

Tabulka 3: Některé hlavní CD znaky, které mají vztah k apoptickému procesu CD znaky Ligand Funkce Poznámka CD31 CD36 CD49e CD60 CD95 CD99 CD110 CD120a CD134 CD168 CD174 CD178 CD253 CD256 CD257 CD258 CD261 CD262 CD263 CD31, CD36 LDH, kolagen typu I, IV, V, trombospondin a další Fibronektin a neurální adhezívní molekula L1 CD178, (CD95L) Trombopoietin (TPO) TNFα a TNFβ Ox40L, gp34 hyaloronan CD34 CD95 (FAS) TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, TRAIL-R4, OPG CD269, CD267 CD269, CD267, CD268 HVEM/TR2, LTbR TRAIL ( TNF-related apoptosis inducing ligand ), TNFSF10, CD253 TRAIL ( TNF-related apoptosis inducing ligand ), TNFSF10, CD253 CD253 (TRAIL) Adhezivní molekula vytvářející homofilní a heterofilní vazby mezi buňkami kde se uplatňuje ve vaskulární intergritě a buněčné permeabilitě Uplatnění při fagocytóze apoptických buněk, CD36 je zahrnutý v adhezi a agregaci destiček CD49e má roli v buněčném přežívání a apoptóze CD60a je zahrnut v regulačních procesech Znak apoptických buněk, cytoplazmatická oblast obsahuje smrtící doménu, CD95 molekuly formují triméry Uplatňuje se při pozitívní selekci tymocytů a jejich schopnosti navozovat adhezi a indukovat apoptózu Vazba CD110 s TPO podmiňuje proliferaci a diferenciaci buněk destičkové řady a také zabraňuje apoptóze. CD120a je asociován s intracelulárními proteiny TRADD, RAIDD, RIP, FAN, BRE, SODD, MADD, PIP5K, p60trak, Grb2 při přenosu signálu. CD134 je integrální membránový protein typu I, člen TNF/NGF receptorové rodiny a způsobuje s ligandem inhibici apoptózy CD168 se uplatňuje při buněčném cyklu a zprostředkovává pomocí PDGF aktivaci erk kinázy. Uvažuje se na roli v ras transformaci, progresi nádorů a jejich metastází CD134 se zřejmě uplatňuje jako kofaktor při koagulační aktivitě a také může mít roli v časné apoptóze CD178 indukuje apoptózu u buněk vyjadřující CD95 antigen. A má tak uplatnění nejen při homeostáze ale také při patologii virem infikovaných buněk CD253 (TRAIL) navozuje apoptózu CD256 se podílí také na indukci apoptózy v interakci s ostatními TNFRSF členy CD256 se aktivační a diferenciační faktor B buněk. Způsobuje rezistenci k apoptóze u některých B buněčných proliferací (CLL) CD258 může zprostředkovávat apoptózu a i aktivaci buněk pomocí TRAF3 molekuly CD261 je transmembránový protein typu I, který obsahuje DR4 smrtící doménu a tak je označován jako smrtící receptor 4. FADD se váže na DR4 smrtící doménu a přes kaspázu 8 navozuje buněčnou smrt CD262 je transmembránový protein typu I, který obsahuje DR5 smrtící doménu a tak je označován jako smrtící receptor 5. FADD se váže na DR5 smrtící doménu a přes kaspázu 8 navozuje buněčnou smrt CD263 je GPI kotvený membránový receptor a je členem TNF-R superrodiny. CD263 vazbou na CD253 inhibuje TRAILem navozovanou apoptózu v kompetenci s ostatními TRAIL receptory, které mají funkční smrtící domény CD31 reguluje přežívání buněk a apoptózu kde svou cytoplazmatickou oblastí váže β, γ katenin, SHP-2, STAT3 a STAT5 CD36 má také roli při navození apoptózy v segmentech u oka zahrnující fotoreceptory CD49e zprostředkovává kostimulační signal T buňkám k zprostředkované fagocytóze CD60a navozuje mitochondriální permeabilitu u apoptózy Vazba CD95 se svým ligandem dává signál k aktivaci FADD proteinu se smrtící doménou a k formaci signálního komplexu (DISC) CD99 pomocí své domény T buňkám navozuje T buňkám na kaspázách nezávislou buněčnou smrt a je silnější navozovač apoptózy než molekuly CD95 nebo TRAIL Asociace CD120a s TRADD a RAID může iniciovat apoptózu. CD120a může také navodit antiapoptickou signalizaci, když TRADD interaguje s TNF asociovaným faktorem 2 (TRAF) CD134 interaguje s některými adaptorpvými proteiny (TRAF-2,TRAF-3 a TRAF 5 vedoucí k aktivaci NF-κB CD168 je onkogen s extracelulární a intracelulární funkcí CD134 (Lewis Y krevní skupina) je vyjádřen také na nádorových buňkách a váže membránové receptory ErbB rodiny CD178 indukuje aktivaci u CD95 dendritických buněk, které na rozdíl od T lymfocytů neprodělávají buněčnou smrt Zablokování funkce TRAIL antigenu vede prostřednictvím interferonu γ u buněk NK k zabíjení nádorových a virem infikovaných buněk CD256 se může kontrolovat růst nádorových buněk a buněk nervového systému CD256 má kritickou roli v aktivaci a přežívání B buněk a také v jejich patogenézi a patofysiologii CD258 má hlavní roli v utváření selekčního tymového repertoáru a v cytokinové sekreci formující TH1 buňky CD261 je silně vyjádřen na buňkách lymfoidních tkání a jeho polymorfismus je asociován s nádory močového měchýře CD262 je silně vyjádřen na buňkách lymfoidních tkání a je asociován s nádory hlavy a šije. CD262. CD262 je indukován proteinem p53 vnitřní apoptotické cesty Význam CD263 je u maligních tkání studována a uvažováno, že by se mohl uplatňovat při likvidaci TRAILem zprostředkovávané buněčné smrti u nádorových buněk 18 informační magazín číslo 14-2010

CD znaky Ligand Funkce Poznámka CD264 CD271 CD325 CD253 (TRAIL) CD271 váže extracelulární ligandy (neurotrofiny, NGF, pro-ngf, BDNF, NT3, NT4/5, β amyloid, CD230) a je asociován s různými intracelelárními signálními molekulami CD325 zprostředkovává homofilní vazby CD264 je transmembránový protein typu I, který obsahuje nefunkční smrtící doménu. CD264 na rozdíl od CD261 a CD262 nemůže tak po vazbě s TRAIL přenášet do buňky apoptický signál. a tak je označován jako smrtící receptor 5. FADD se váže na DR5 smrtící doménu a přes kaspázu 8 navozuje buněčnou smrt. CD271 je transmembránový protein typu I, je členem TNFR superrodiny a obsahuje smrtící doménu. CD271 má řadu funkcí v přežívání buněk, v migraci vaskulárního systému až po utváření a plasticitě nervového systému. CD371 je nízkoafinitní neurotrofinový receptor. CD325 je transmembránový protein typu I, je členem klasické kadherinové rodiny a má důležité role ve vývoji, strukturální a funkční plasticitě neuronů. Normální tkáně vyjadřující CD263 a CD264 jsou rezistentní k TRAILem indukované apoptóze i když jsou přítomny signalizační receptory CD261 a CD262. Význam CD264 je u maligních tkání studován a uvažováno, že by se mohl uplatňovat při likvidaci TRAILem zprostředkovávané buněčné smrti u nádorových buněk Ligandami pro CD271 jsou β amyloid a agregovaný prionový protein, které navozují in vitro buněčnou smrt u nervových buněk. Uvádi se také,.že CD271 je asociován u nemocných s invazívním ductal karcinomem CD325 se uplatňuje při neurogenerativních chorob. Preselinin 1 proteolyticky štěpící CD325, který se uplatňuje při zhoršení paměťových schopností u Alzheimerovy choroby. Poznámka: Při apoptóze různých buněk se mohou uplatňovat některé další membránové molekuly a to v různých souvislostech. Např. molekula CD136 se může se podílet na přenosu signálu pod vlivem růstových faktorů a navozovat zprostředkovávání apoptózy. Molekula CDw198 se uplatňuje při apoptóze tymocytů, Další molekula CD221 se uplatňuje antiapoptickým efektem v signalizačních kaskádách vyvolávající apoptózu. Dále vazba ligandu na molekulu CD329 zprostředkovává aktivaci signalizační cesty podmiňující apoptózu u neutrofilů. Na interakci apoptické buňky v posledních stadiích zániku se mohou podílet různé receptory fagocytů (CD14,CD36, DOCK180, SR-A a jiné). Na fagocytóze apoptické buňky se podílejí hlavně adhezivní molekuly (vitronektinové a skavengerové receptory). APO-1 Označení pro apoptózový antigen 1, který má další synonyma Fas, TNFRSF6, APT1. Dle CD nomenklatury je APO-1 zařazen jako CD95, což je transmembránový protein typu I. APO-3 (DR3) Člen rodiny TNF-receptorů. Podobně jako THR-R1 příslušný ligand navodí apoptózu a aktivaci nukleárního faktoru NF-κ prostřednictvím dalších proteinů jako TRADD, TRAF2, FADD a kaspázy 8. APP-gen ( Amyloid precursor gen ) Gen byl nalezen na chromozomu 21 a syntetizuje amyloidový prekurzorový protein (APP). APRIL ( a proliferation-inducing ligand ) Membránový glykoprotein označovaný jako CD256, člen TNF rodiny. Může navozovat apoptózu pomocí interakce s TNFRSF molekulami. amyloid β = β amyloid, amyloidový prekurzorový protein (APP) Amyloidový a agregovaný prionový protein navozují in vitro buněčnou smrt neuronů. Tyto molekuly jsou ligandy pro receptor CD271. Bax Označení pro cytoplazmatický protein z rodiny Bcl-2 vytvářející kanál v mitochondriální membráně pro cytochrom c. Bcl-2, Bcl-x L, Bax, Bcl-x S, Bak Bcl-2 byl původně nalezen u pacientů s folikulárním lymfomem jako důsledek chromozomální translokace. Jde o prototyp člena velké rodiny genů, které kódují proteiny, které mohou apoptózu inhibovat (Bcl-2, Bcl-x L ) nebo naopak podporovat (Bax, Bcl-x L ). Poměr mezi těmito apoptickými a proapoptickými proteiny určuje, zda apoptóza proběhne či nikoli. Např. je-li koncentrace Bcl-2 vyšší než Bax, je apoptóza potlačena a obráceně. Nadměrná exprese Bcl-2 (jako výsledek translokace do jiné oblasti chromozomu) může učinit buňky rezistentní vůči apoptóze, tzn. že je tím podpořen nádorový růst. Některá karcinostatika účinkují tak, že navozují apoptózu, proto nadměrná exprese Bcl-2 nebo Bcl-x L může navodit rezistenci vůči protinádorové terapii. Proteiny rodiny Bcl hrají centrální úlohu při zahájení klíčového kroku apoptózy, kterým je uvolnění cytochromu c a AIF z intermembránových prostor mitochondrií do cytoplazmy. BDNF ( Brain-derived neurotrophic factor ) BMP ( Bone morphogenetic proteins ) V průběhu embryogeneze vznikají při vytváření embryonálních tkání různé signální molekuly, které jsou zahrnuty do apoptotických procesů. BMP proteiny se u ptáků podílejí na výstavbě prstů. CD36 ( Scavenger receptor for oxidized low density protein, LDH) Receptor se podílí na apoptóze u celé řady buněk a vyvolává různé defekty. CD47 ( Integrin-associated protein, IAP ) Receptor váže trombospondin a zprostředkovává u některých buněk na kaspázách nezávislou buněčnou smrt pomocí heterotrimerické Gi-proteinocé cesty. CD95 = Fas = APO-1 ( Apoptosis antigen 1 ) Membránový protein o 320 AK. Extracelulární doména o 157 AK má tři cysteinové oblasti a dvě glykozylační místa. Intracelulární cytoplazmatická oblast obsahuje smrtící doménu tvořenou sekvencí AK v pozici 214 a 295. Tři Fas molekuly formují trimér, který se podílí na přenosu apoptického signálu do buňky. CD172a = SIRPα, SHPS-1 ( Signal regulatory protein α ) Transmembránový glykoproteid, člen rodiny signálních regulačních proteinů (SIRP) a člen Ig genové superrodiny. CD172b = SIRPβ1, ( Signal regulatory protein β1 ) Transmembránový glykoproteid, člen rodiny signálních regulačních proteinů (SIRP) a člen Ig genové superrodiny. CD172g = SIRPγ, SIRPβ2 ( Signal regulatory protein β2 ) Transmembránový glykoproteid, člen rodiny signálních regulačních proteinů (SIRP) a člen Ig genové superrodiny. CD172g vazbou na CD47 indukuje apoptózu na buňkách T-buněčných linií, která není tak účinná, jako když je vazba prostřednictvím CD172 antigenu. CD178 = CD95L ligand (fasl) Membránový protein typu II, exprimovaný na přirozených zabíječských buňkách (NK) a na aktivovaných T-lymfocytech, monocytech a neutrofilech jako informační magazín číslo 14-2010 19

trimér. CD178, jako monomér má 40kD a obsahuje 281 AK. CD178 je člen TNF rodiny, protože jeho C doména představuje oblast homologní TNF. Jsou popsány rozpustné štěpené produkty CD178 antigenu. Vazba CD95L na CD95 způsobuje oligomerizaci, kde cytoplazmatická receptorová smrtící doména formuje death inducing signal complex (DISC). Apoptóza indukovaná CD95-ligandem se účastní antivirové a protinádorové imunitní odpovědi. Ceramid Ceramid je komplex lipidů v cytoplazmě a plazmatické membráně. Vzniká rozpadem sfingomyelinu působením sfingomyelinázy, což je proces provázející zánik buňky navozený ligandem TNF a CD95. Zdá se, že ceramid působí jako poslíček, který může zprostředkovat apoptózu aktivací určitých kináz. CREB (camp-dependentní vazebný protein) U některých neurodegeneratívních chorob se jedná o camp-dependentní vazebný protein spadající do rodiny CREB transkripčních faktorů. CREM ( camp-response modulátory protein ) U některých neurodegeneratívních chorob se jedná o camp- response modulátor protein, který podporuje přežívání nervových buněk během vývoje. Cytochrom c Cytochrom c je znám jako součást mitochondriálního respiračního řetězce (komplex III = koenzym Q-cytochrom c-reduktáza), je lokalizován na intermembránové straně vnitřní mitochondriální membrány. V časné fázi apoptózy dochází ke zvýšení propustnosti mitochondriální membrány a některé mitochondriální proteiny, včetně cytochromu c a AIF, se dostávají do cytoplazmy, kde aktivují kaspázovou kaskádu. Uvolnění do cytoplazmy je regulováno proteiny rodiny Bcl-2. Daxx ( Fas death domain associated protein ) Zkratka je pro Fas death domain associated protein a písmena xx jsou vymezena pro eventuelní doplnění nomenklatury pro další proteiny této třídy. Daxx neobsahuje vlastní smrtící doménu, ale váže se přímo na smrtící doménu CD95, čímž je aktivována kaspázová kaskáda cestou NJK. Tato cesta může být blokována Bcl-2. DD ( Death domain ) Intracelulární receptorová smrtící DD doména podmíňují amplifikaci adaptorových molekul. DISC ( Death Inducing Signaling Complex ) Je to akronym pro Death Inducing Signaling Complex, což je někdy označení pro všechny komplexy navozující apoptózu. Fas receptor a CD95 se po navázání na Fas ligand změní na tzv. DISC, který pak aktivuje kaspázu 8 a kaspázu 10. DR ( Death receptor ), smrtící receptor DR3 ( Death receptor 3 ) DR3 se vyskytuje v různých tkáních (tymus, slezina) bohatých na lymfocyty. Při navození apoptózy dochází k aktivaci NF-kappa/beta molekuly. DR4 ( Death receptor 4 ) Označení pro transmembránový protein typu I, který je členem TNFR rodiny. Molekula má jednu smrtící doménu a je také označována jako TRAL-nebo TNFRSF10A. FADD ( Fas Associated Death Domain Protein ), (MORT-1) Cytoplazmatický protein zprostředkovávající vnější cestu apoptózy prostřednictvím vazby na komplementární smrtící doménu, která je na C konci transmebránových receptorů (Fas, TRAIL). FLICE = inhibiční protein (FLIP) Aktivace proenzymů kaspázy 8 prostřednictvím komplexu CD95/FADD nebo komplexu TNFR/TRADD/FADD vyžaduje vazbu proenzymu na receptorový komplex homotypovou interakcí mezi efektory smrtících domén (DED) navozujících apoptózu. Bylo identifikováno několik virových proteinů, které obsahují dva aminokyselinové motivy (sekvence), které jsou velmi podobné DED molekulám. Tyto virové proteiny, označované jako v-flip, inhibují apoptózu vazbou na receptorový komplex místo proenzymu kaspazy 8. Byl též objeven buněčný homolog virového FLIP se stejným inhibičním účinkem, má akronym c-flip. Fosfatidylserin V živých buňkách je fosfatidylserin umístěn pouze v buněčné membráně na vnitřní cytoplazmatické straně lipido-proteinové dvojvrstvy. Při apoptóze dochází velmi záhy k translokaci fosfatidylserinu i na vnější stranu (povrch). Průkaz tohoto jevu je možné využít pro časnou detekci apoptózy. Používá se k tomu detekce anexinu. Granzym B (CTL-proteináza 1, fragmentin-2, RNKP-1) Granzym B je serin-proteináza, která se uvolňuje (jako součást cytotoxických granul) z cytotoxických T-lymfocytů a přirozených zabíječů (NKbuňky) při interakci se zasaženými buňkami. Sekrece granzymu B do cytoplazmy zasažené buňky, což je usnadňováno vytvářením pórů perforinem, navodí apoptózu, tj. hlavní účinek cytotoxických lymfocytů. Granzym B má stejnou substrátovou specifitu jako kaspázy. Spekuluje se o tom, že granzym B buď napodobuje účinek kaspáz, nebo konvertuje kaspázy z jejich inaktivní formy na aktivní. Granzym B aktivuje proenzym kaspázy 3 (CPP32). IAP ( Iinhibitor of apoptosis protein ), inhibitor apoptozových proteinů Inhibitory apoptických proteinů vazbou na SMACs zabraňují v pokračování apoptotické kaskádě ISNTA ( In situ nick translation assay ) Metoda používaná ke stanovení pozdní apoptotické fáze. Pomocí DNA-polymerázy je možné prokazovat zlomy v DNA ICE ( Interleukin-1β converting enzyme ) ICE se vyskytují v cytoplazmě, kde specificky štěpí IL1b v pozici alaninu. ICE jsou zahrnuty do rodiny cysteinových proteinas, kde jejich inaktivní formou jsou prokaspázy. JNK (c-jun N-terminální kináza) JNK je prolinkináza náležící do velké rodiny MAP-kináz. Je známo, že buněčný stres (např. ozáření) může navodit apoptózu, pravděpodobně fosforylací proteinů regulujících transkripci nebo buněčnou proliferaci buď přímo, nebo aktivací kaspázové kaskády. Bylo prokázáno, že existuje další cesta, a to pomocí JNK, která realizuje apoptózu navozenou interakcí Daxx a CD95. JNK cesta je senzitivní na Bcl 2. Kalpain Je intracelulární cysteinová proteáza, přítomná jako inaktivní proenzym, který je aktivován autokatalyticky vysokými koncentracemi Ca ++. Kalpin je součástí intracelulárního proteolytického systému, odstraňujícího degradované proteiny. Kaspázy (CASPASE Cytosolic Aspartate Specific Cystein Proteases ) Jde o rodinu cysteinových proteáz (dříve nazývaných ICE-like proteázy ), které štěpí proteinovou molekulu v místě aspartánu. ICE je zkratka pro 20 informační magazín číslo 14-2010