Možnosti použití syntetických polymerů při vývoji léčiv: od protinádorové ke genové terapii.

Možnosti použití syntetických polymerů při vývoji léčiv: od protinádorové ke genové terapii. Projekt je řešen ve spolupráci ÚMH AV ČR s MBÚ AV ČR, University of Oxford a Krebsforschunginstitut Heidelberg

Obsah přednášky Úvod do problematiky polymerních nosičů biologicky aktivních molekul Polymerní konjugáty nízkomolekulárních léčiv Polymery pro diagnostiku Polymery při přípravě vektorů pro genové terapie Závěr a výhledy

Základní výzkum: Studium vztahu mezi strukturou, fyzikálně-chemickými a biologickými vlastnostmi makromolekul tvoří teoretický základ, ze kterého vycházíme při výběru konkrétní aplikace polymerů ve farmacii - návrhu struktur a syntéze nových generací léčiv (lékových forem) o jsou makromolekuly, syntetické polymery, jejich fyzikální a chemická struktura

Fyzikální a chemická struktura syntetických polymerů Lineární a větvená struktura Roubovaná struktura, polymerní síť a hvězdicová struktura makromolekul Kopolymery a terpolymery

Proč polymery? o umožní použití syntetických polymerů při přípravě léčiv a lékových forem? Klasické nízkomolekulární léčivo Polymerní formy léčiv řízené uvolňování Konc protrahovaný účinek 0 4 8 čas [ hod] dny - rok řízené uvolňování cílený transport

Požadavky na ideální léčivo Biologicky aktivní látka (BAL, léčivo) je v lékové formě neaktivní, bez jakéhokoliv vlivu na organizmus (buňky imunitního systému, neukládá se v játrech, není vyloučeno ledvinami) v této formě je specificky dopraveno do místa požadovaného účinku (orgán, tkáň, buňka) aktivuje se pouze v místě požadovaného účinku, působí v požadované koncentraci působí po dobu optimální pro dosažení maximálního léčebného účinku léčivo, metabolity a všechny komponenty nosičového systému jsou po dosažení efektu eliminovány z organizmu

Vodorozpustné polymerní konjugáty s léčivy, polymerní diagnostika

Obecné schéma polymerního léčiva (H. Ringsdorf, Angewandte Macromoleculare hemie, 1975)

Schéma klasického polymerního léčiva (konkretizovaná struktura navržená J. Kopečkem) Léčivo (model Nap) Biodegradovatelná spojka (fosfát, cukr, oligopeptid, hydrolyticky štěpitelná spojka) Směrující struktura: sacharid, lektin, protilátka (IgG a fragmenty), hormon, specifický oligopeptid

Možnosti uvolňování léčiva z polymerního nosiče (b) (a) (c) évy a) Uvolnění v krevním řečišti b) Uvolnění ve tkáni po extravazaci c) Specifické uvolnění v cílových buňkách po endocytose évy

Hlavní požadavky kladené na polymerní nosiče léčiv Stabilita v průběhu transportu = chemická vazba léčiva na nosič Řízené uvolnění léčiva z nosiče (chemická hydrolýza, enzymolýza) ílený transport k nádoru, nádorovým buňkám (pasivní směrování pomocí EPR efektu, aktivní směrování směrující strukturou Eliminace nosiče z organizmu (degradovatelný nosič, micelární nosič)

Schéma klasického konjugátu poly(hpma) s kancerostatikem doxorubicin (enzymatická aktivace léčiva) H2 O x O a H OH HO O O OH O O HO HO O OH O Enzymaticky degradovatelný oligopeptid: -GlyPheLeuGly- Místo enzymatického štěpení

Schéma hydrazonového konjugátu poly(hpma) s kancerostatikem doxorubicin (ph závislá hydrolytická aktivace léčiva) H2 O x O a H OH N H O OH N O H OH O H O OH H O 3 O O H H 3 2. Hl Jednoduchá vazba nebo spacer Místo hydrolytického štěpení

Hlavní požadavky kladené na polymerní nosiče léčiv Stabilita v průběhu transportu (chemická vazba léčiva na nosič) Řízené uvolnění léčiva z nosiče (chemická hydrolýza, enzymolýza) ílený transport k nádoru, nádorovým buňkám (pasivní směrování pomocí EPR efektu, aktivní směrování směrující strukturou Eliminace nosiče z organizmu (degradovatelný nosič, micelární nosič)

Princip enzymaticky řízeného uvolňování léčiva z polymerního nosiče polymer Gly-Phe-Leu-Gly--- Spojka (oligopeptid) NAp Model léčiva, léčivo (DOX) P 4 P 3 P 2 P 1 P 1 P 1 P 2 P 3 Substrát (oligopeptid) S 4 S 2 S 1 S 2 S 3 S 3 S 1 Aktivní místo enzymu (proteázy) ENZYM

Uvolňování DOX z polymerů při inkubaci PHPMA-X-DOX konjugátů se směsí lysosomálních enzymů -tritosomů 70 60 50 GLFG GFLG GLG GFG GG % v o ln é h o DOX 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 60 č as, h STRUKTURA % UVOLNĚNÉHO DOXORUBIINU V SÉRU 3 h 6 h 24 h -GFLG- 0.7 0.8 1.9 -GLFG- 0.5 0.5 1.5 -GG- 0 0.1 0.2

Uvolňování DOX z hydrazonových polymerů inkubovaných ve fosfátových pufrech o různém ph 100 90 ph 5.5 80 70 DOX releas ed, % 60 50 40 30 GFLG GLG Gly-Gly Gly Aminobenzoic Acap 20 ph 7.4 10 0 0 10 20 30 40 50 Time, h

Hlavní požadavky kladené na polymerní nosiče léčiv Stabilita v průběhu transportu (chemická vazba léčiva na nosič) Řízené uvolnění léčiva z nosiče (chemická hydrolýza, enzymolýza) ílený transport k nádoru, nádorovým buňkám (pasivní směrování pomocí EPR efektu, aktivní směrování směrující strukturou) Eliminace nosiče z organizmu (degradovatelný nosič, micelární nosič)

Princip pasivního směrování akumulace polymerů v pevných nádorech (EPR efekt) (H. Maeda a kol.) Normální tkáň Nádorová tkáň Málo propustný endothel Porézní kapilární systém Fungující lymfatický systém Těsné kapiláry nebo chybějící lymfatický systém

Distribuce poly(hpma) v myších (EPR efekt), Sarkom 180 (melanom B16F10) (i.v. injekce polymeru) 20 18 Accumulated Polymer, %/g of mice 16 14 12 10 8 6 556 000 148 000 78 000 40 000 22 000 4 2 0 Tumour Spleen Kidney Mus cle Liver Skin Blood

Biodistribuce poly(hpma) nosiče v kryse (EPR) s prostatickým AT1 nádorem (h 0,5 24 72 120 168 M w = 27 300 HPMA-131 I : 27300 D (h) 0,5 24 72 120 168 M w = 60 100 HPMA-131 I : 60100 D

Konjugáty umožňující pasivní směrování do nádorů Nedegradovatelné polymerní nosiče (limit Mw ~ 50 000 g/mol) Micelární nosiče léčiv PEG PEG PEG Multiblokové biodegradovatelné nosiče Biodegradovatelné vysokomolekulární polymerní nosiče

Struktura micel tvořených konjugátem PHPMA- DOX-oleyl ve vodě H 3 x H OH N y OH z* 5 5 M w (pol) = 32 kda I = 1.8 M w (mic) = 170 kda [DOX] = 7 wt% [oleyl] = 3.5 %mol d mic = 22 nm O O HO O OH OH O H O H H 7 7 O O 5 Hydrofobní substituent; oleyl, cholesteryl, etc. OH 3 + l

Polymerní micela na bázi kopolymeru poly(ethylenglykol-b-allylglycidylether) Vodorozpustný polymer vyloučitelný z organizmu, blokový kopolymer (hydrazid) (4-5 nm) DOX, ph ~7.4 ph ~ 5 Supramolekulární polymerní micela s hydrazonovou vazbou vázaným DOX (~ 20-30 nm) O H 3 O n O O m OH S 2 H 3 O O n O OH m OH H O S H N N O OH ph senzitivní vazba O O OH O O OH 2

Syntéza roubovaných konjugátů s řízeným uvolňováním Dox a řízenou biodegradací x H OH y 5 N S S + x H OH Boc y 5 Gly Phe Leu Gly z A) G FL G Dox=N 2 G G FL Dox=N N=Dox N=Dox G FL G N=Dox Boc 2 x H OH S y 5 S N + x H OH Boc y 5 Gly Phe Leu Gly z B) 2 S S N=Dox S S N=Dox 2 N=Dox S S N=Dox Boc Dox=N Dox=N + 2 + l SH 3

Eliminace polymerních léčiv z krevního řečiště a akumulace do nádoru u B/6 myší nesoucích myší lymfom EL4. Porovnání s volným léčivem. Eliminace z oběhu Akumulace v nádoru 20 Dox z injekované dávky (%) 18 16 Dox 14 lineární 12 roubovaný 10 micela (chol) 8 6 4 2 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ug Dox / g nadoru 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Dox lineární roubovaný micela (chol) 0 20 40 60 80 100 čas (h) čas (h)

Fluorescenční microscopie buněk myšího EL4 lymphomu inkubovaných s micelami HPMA-hydrazone-DOX, PEG- PAGE-DOX a roubovanými konjugáty, 10 μg DOX equiv/ml, 24 h, 37 º Micela, oleyl Micela, cholest Micela, PEG-AGE Lineární hydrazon Graft, Roub, S-S Roub, GFLG Micelle, PEG-AGE, Hoechst 33342

Aktivní směrování internalizace polymerních léčiv v buňkách Uvolnění léčiva (a) hydrolýza v endosomech, (b) enzymolýza v sekundárních lysosomech lysosom primární endosom ph 5-6 Jádro sekundární lysosom, ph 5, enzymy

Schéma klasického protilátkou směrovaného konjugátu doxorubicinu (enzymatická aktivace) H2 O x O a O b H OH HO O O OH O O HO HO O OH O Oligopeptid -GlyPheLeuGly-

Schéma hvězdicového protilátkou směrovaného konjugátu doxorubicinu (enzymatická aktivace) S- --- H OH Gly Phe Le u Gly DOX X

FAS analýza protilátkou směrovaných konjugátů Směrování (a) Nespecifickou protilátkou (b) Specifickou protilátkou BL1 cells + higg-p-dox BL1 cells + B1 mab-p-dox classic structure BL1 cells + B1mAb-P-Dox star structure 3813 cells + higg-p-dox 3813 + RL34 mab-p-dox classic structure 3813 cells + RL34 mab-p-dox star structure

Hlavní požadavky kladené na polymerní nosiče léčiv Stabilita v průběhu transportu (chemická vazba léčiva na nosič) Řízené uvolnění léčiva z nosiče (chemická hydrolýza, enzymolýza) ílený transport k nádoru, nádorovým buňkám (pasivní směrování pomocí EPR efektu, aktivní směrování směrující strukturou Eliminace nosiče z organizmu (degradovatelný nosič, micelární nosič)

Schéma degradace roubovaného konjugátu (degradace v reduktivním prostředí buňky) 2 DOX= N S S S S 2 N S S =DOX Degradace v cílové buňce DOX DOX N =DOX N =DOX DOX DOX =N HN H 2 N Vysokomolekulární léčivo s akumulací v pevném nádoru Nížemolekulární fragmenty vyloučitelné z organizmu

Degradace roubovaného PHPMA konjugátu se spojkou GFLG po inkubaci s kathepsinem B c(kathepsin B) = 5.10-7 mol/l Degradace roubovaného PHPMA konjugátu se spojkou -S-S- po inkubaci s glutathionem c(glutathion) = 3.10-6 mol/l M w (x10-3 ) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 Vylučovací mez polymeru ledvinami Mw (x10-3 ) 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 10 0 0 10 20 30 40 50 time (h) 0 10 20 30 40 50 time (h)

In vivo aktivita polymerních léčiv studovaná na modelových nádorech u myší (růst nádoru, doba přežití, váha) (a) ochranný režim aplikace léčiva (aplikace 1,3,5,7,9 den po inokulaci nádoru) (b) terapeutický režim aplikace léčiva ( první aplikace po vytvoření nádoru, nejčastěji po 8 11 dnech od inokulace)

Směrované PHPMA-DOX konjugáty, výsledky in vivo testů (Balb/c myši, BL1 leukemie i.p., léčba i.v.), terapeutický režim podání a) jedna dávka 5mg/kg, (hv 11 den) b) dvě dávky 11 a 14 den, 2x5mg/kg (kl) Therapeutický režim, doba přežití 100 % přežívajících m yší 80 60 Kontrola 40 PHPMA-Dox-IgG 20 PHPMA-DOX-mAb kl PHPMA-Dox-mAb hv 0 0 30 60 90 120 DEN

Léčba 3H/HeN myší s 3813 lymfomem (1x10 5, s.c.) doxorubicinem (5x2.5 mg/kg) nebo polymer-dox konjugáty (ekvivalent 5 mg/kg DOX) aplikovanými 8 a 11 den (terapeutický režim podání) 600 Tumor size [mm sq.] 500 400 300 200 100 ontrol Dox P-Dox lassical ad71 [2mAb] Surviving of experimental mice (%) 120 100 80 60 40 20 ontrol Dox P-Dox lassical ad71 [2mAb] 0 8 13 18 23 28 Days 0 0 10 20 30 40 50 60 Days

Lineární konjugáty PHPMA-DOX s hydrazonovou vazbou: výsledky in vivo testů, nesměrovaný lineární konjugát - terapeutický režim podání Myší T-buněčný lymfom EL4, myši 57BL/6, léčba i.p. 10 nebo 10 a 20 den Hydrolyticky štěpitelná vazba, ph závislá rychlost štěpení veliko st n ád o ru ( mm2) 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 Růst nádoru 10 15 20 25 30 35 40 dny % přežívajících myší 120 100 80 60 40 20 0 Přežívání myší 0 20 dny 40 60 80 Kontrola B531-25mgDox/kg x1 B531-25 mgdox/kg x2 B531-75 mgdox/kg x1

Vysokomolekulární roubované polymerní konjugáty DOX (Hydrazon) In vivo protinádorová aktivita 10 5 buněk T-buněčného lymfomu EL4 inokulovaných myším B/6 v den 0. Léčba: den 11. i.v., jednoduchá dávka 15 mg DOX ekv./kg přežívání myší, % 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 onjugate A onjugate B linear ontrol 0 10 20 30 40 50 60 70 dny A konjugát s enzymatickou degradací B konjugát s reduktivní degradací

Vysokomolekulární micelární konjugáty PHPMA-DOX Doba přežití B/6 myší s inokulovaným EL-4 T-buněčnýmlymfomem(s.c.) léčených 8 (a příp. 12) den po inokulaci jednou nebo dvěma dávkami léčiva Přežití B/6 myší 120 100 80 počet myší % 60 40 20 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Dny Oleyl 1x10 Oleyl 2x5 holesteryl 1x10 holesteryl 2x5 linear 1x15 ontrols 0

Přežití 57BL/6 myší s retransplanovanými buňkami (10 5 ) myšího lymfomu EL-4, bez následné léčby Původní léčba: hydrazonový konjugát 120 % přežívajících myší 100 80 60 40 20 0 ontrol 25 mg/kg 2 x 25 mg/kg 75 mg/kg 0 10 20 30 40 50 60 70 Dny

Kombinovaná radio a chemoterapie

Kombinovaná radio a chemoterapie Dunningova AT1 nádoru prostaty u krys. Podání volného Dox, polymerního Dox (PK1) a protilátkou (IgG) směrovného polymerního konjugátu Dox bylo kombinováno s radioterapií (2 Gray/dávka) Samotná chemoterapie Kombinovaná radiochemoterapie

Kombinovaná radio a chemoterapie Dunningova AT1 nádoru prostaty u krys. Podání volného Dox, polymerního Dox (PK1) a protilátkou (IgG) směrovného polymerního konjugátu Dox bylo kombinováno s radioterapií (2 Gray/dávka) Kombinovaná terapie Váha krys v průběhu terapie

Využití rozpustných polymerních konjugátů v diagnostice

Konjugát gadolinia pro diagnostiku (angiografii) magnetickou resonancí Hmotová spektroskopie: H OH (5.19±0.28) %váh. Gd Kontrastní látka: MW: 24.8 kda H H OH 0.5 M (78 mg/ml Gd) M w /M n : 1.92 H OH OH OH Gd Komplex je stabilní (neuvolňuje Gd) minimálně po dobu 2 měsíců inkubace

ytotoxicita konjugátů gadolinia (lidské fibroblasty, trypan blue, kontrola Gd-DTPA (Magnevist) od firmy Schering) Doba inkubace 50,00 Dead human fibroblast cells (MSU) [%] 45,00 40,00 24 hodin 48 hodin 35,00 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 1 Kontrola PHPMA-Gd Gd-DTPA (1mM) (0.1mM) 0,00 Kontrola PHPMA-Gd Gd-DTPA (1mM) (0.1mM) 1

MR-Angiografie, komplex poly(hpma)-gd Krysa, 1.5 T MR scanner: 0.02 mmol/kg HE45

MR-Angiografie u krysy, porovnání komplexu poly(hpma)-gd s Gd-DTPA, 1.5 T MR scanner: 0.02 mmol/kg poly(hpma)-gd Magnevist firmy Schering *

ZÁVĚRY I. Vodorozpustné polymerní nosiče léčiv mohou najít významné uplatnění při přípravě na nádor směrovaných kancerostatik. Polymerní cytostatika mají minimální vedlejší účinky, nepoškozují imunitní systém jako klasická cytostatika a vykazují, na rozdíl od klasické chemoterapie, kromě výrazně zlepšeného chemoterapeutického efektu i efekt imunostimulační. Tento efekt se uplatňuje u různých typů nádorů (u myší i u lidských pacientů). Kombinací chemoterapie s radioterapií je možné terapeutický účinek polymerních léčiv zvýšit. Polymerní nosičové systémy mají širokou škálu použití i v jiných oblastech medicíny, např. v diagnostice (MR zobrazení).

Syntetické polymery jako součást vektorů pro genovou terapii

Požadavky na systém pro dopravu genu účinný v in vivo podmínkách 1. Stabilita v krevním řečišti, minimální interakce s buňkami imunitního systému 2. Extravazace do cílové tkáně 3. Interakce s receptory cílových buněk 4. Endocytoza 5. Únik z endosomu do cytoplasmy 6. Transport k buněčnému jádru 7. Účinná transfekce a produkce aktivního proteinu

Systémy pro in vivo dopravu genu Biodegradovatelné nanočástice Kationtové liposomy Kationtové lipidy (lipoplexy) Interpolyelektrolytové (polykationtové) komplexy DNA (polyplexy) Virální systémy: retroviry, polymerem modifikované rekombinantní adenoviry

Interpolyelektrolytové komplexy (IPE) polykationtů s DNA plasmidy (polyplexy)

Tvorba komplexu polykation-dna + + + +/- = 1 : 1 + + + + + + + + + + + + + +/- > 1 + + + + + + + + + + + + + + + + +/- >> 1 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Agregace částic Izolované komplexy + + + + + + Směs polymeru s komplexem +

Polykationty použité pro přípravu IPE a) Primární amíny b) Terciární amíny c) Kvarterní ammoniové soli O O ( ) 2 ( ) 2 ( ) 2 ( ) 2 N N H 3 N H 3 N 2 H 3 H 3 l - l - MAEDA 2 DMAEM DMAEMam TMAEM TMAEMam ( ) 6 HN H MAGEDA 2 MAGGHMDA 2 PLL

Multifunkční polykationtový vektor pro dopravu genu připravený kondensací DNA s blokovými kopolymery polykationtů a hydrofilních polymerů + + + + + + + + + + plasmid ph 7,4 stabilní při dopravě Fusogení molekula (peptid) Směrující jednotka Hydrolyticky labilní vazba (při ph < 6) Uvnitř buňky při ph < 6 se plasmid uvolní z endosomu

Stabilizace komplexů DNA/PLL hydrofilním polymerem Blokový nebo roubovaný kopolymer + +/- = 1 : 1 DNA plamid + + + + + + + + + + + + + + + poly(tmaem-b-hpma) Biodegradovatelná spojka: oligopeptid, hydrazon, disulfid

Stabilita polykationtového komplexu DNA stabilizovaného hydrofilním PHPMA kopolymerem při inkubaci s DNAzou (fosfátový pufr, ph 7.4, 37 ) 0,08 změna absorbance (260 nm) 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 0 5 10 15 20 25 30 35 čas, min DNA DNA/roub DNA/blok

Asociace polymerem (phpma) modifikovaného komplexu pll/plasmid DNA s myšími peritoneálními makrofágy v 50% telecím séru Fluorescence 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0,5 1,5 3 Doba inkubace (h) DNA/PLL DNA/PLL/pHPMA1 DNA/PLL/pHPMA2

Povrchová úprava IPE pomocí HPMA kopolymeru, využití pro cílenou dopravu IPE pomocí aktivních proteinů nebo oligopeptidů 2 2 ONp 2 2 2 + ONp ONp ONp ONp ONp 2 2 ONp 2 2 ONp ONp 2 + ONp 2 protein (IgG, transferin) oligopeptid

Průnik do buněk K562 (lidská leukemie) a účinnost transfekce komplexů pll/dna (gen kódující ß-Gal). Směrování transferinem. Průnik PL/DNA komplexu do buněk, vliv směrování Účinnost přenosu genu v in vitro podmínkách 100 8000000 90 7000000 80 průnik do buněk, % 70 60 50 40 30 20 10 svět. jednotky 6000000 5000000 4000000 3000000 0 0 50 100 150 200 250 300 350 2000000 čas, min 1000000 pll/dna phpma-pll/dna phpma-tf-pll/dna 0 pll/dna phpma-pll/dna phpma-tf-pll/dna

Virální systémy, rekombinantní adenoviry

Adenovir: Potenciální vektor pro nádorovou genovou terapii Požadavky na intravenozní aplikaci: Virus se nesmí vázat na erythrocyty a neutrofily Nesmí napadat makrofágy a buňky RES Nesmí docházet k neutralizaci protilátkami a komplementem Nesmí docházet k záchytu viru v jaterních buňkách Musí být schopen specifického směrování k vybraným buňkám (retargeting) Receptory: coxsackie a adenovirus receptory (AR), receptory pro fibre knob ligandy

Povrchová modifikace viru hydrofilním polymerem Aminoskupina Reaktivní esterová skupina + Semitelechelický monovalentní polymer Virus + Klasický multivalentní polymer se směrující skupinou Modifikovaný virus

Osud povrchově modifikovaného viru v cílové buňce Extracelární prostředí Přesměrovaný virus Ochranný polymer Prostředí v buňce endosom adenovirová kapsida ph < 6 GSH Směrující struktura Degradovatelné vazby Buněčná membrána Uvolnění DNA

Příklad HPMA kopolymerů určených pro povrchovou úpravu virálních nosičů genu O O ( ) 2 ( ) 2 ( ) 2 ( ) 2 ( ) 2 H OH N H OH N l l ( ) 2 ( ) 2 ( ) 2 S S Reduktivně štěpitelná vazba (v cytoplasmě) S S S S ( ) 2 ( ) 2 ( ) 2 N S S N S S EGF

Modifikace virů kopolymerem HPMA obsahujícím směrující skupinu Nemodifikovaný virus Polymerem modifikovaný virus

Množství nemodifikovaných a polymerem modifikovaných virů v krvi po 30 min od aplikace (% vstupní dávky, myši BALB/) 60 50 40 30 20 % Input Dose 10 0 1x10E9 Virus 1x10E10 Virus 1x10E11 Virus 4x10E11 Virus 6x10E11 Virus 1x10E9 pcvirus 1x10E10 pcvirus 1x10E11 pcvirus 4x10E11 pcvirus 6x10E11 pcvirus Modifikace viru polymerem a vhodná dávka vede ke snížení poměru počtu virů v játrech vers. krev z poměru >2000 na <1.

Polymerem modifikovaný nesměrovaný adenovirus Ad5-GFP ztrácí schopnost účinně infikovat buňky (A549 plicní nádor), připojením směrující struktury se aktivita specificky obnoví Nemodifikovaný virus Polymerem modifikovaný virus Virus retargetovaný pomocí bfgf Asociace s buňkami (FAS) Transgenní exprese genu Ad5-GFP

Retargeting adenoviru (Ad5-luc) pomocí EGF (epidermální růstový faktor) 1000000 Vaginální nádor A431 Ovariální nádor SKOV 3 1000000 100000 100000 Luciferase (RLU) 10000 Luciferase (RLU) 10000 1000 1000 100 virus pc-virus EGF-pc-virus 100 virus pc-virus EGF-pc-virus

Exprese polymerem modifikovaného viru Ad5-GFP směrovaného humanizovanou protilátkou herceptinem Buňky Virus PHPMA modifikovaný virus Herceptinem retargetovaný virus SKOV3 Ovariální nádor K562 Lidská leukemie

Závěry II Polykationty tvoří dostatečně malé a stabilní komplexy s DNA a plasmidy Stabilitu polykationt/dna komplexu je možné ovlivňovat strukturou polykationtu a modifikací povrchu komplexu hydrofilním polymerem Účinnost transfekce IPE komplexů může být ovlivňována změnami struktury komplexu a zavedením funkčních molekul (směrování) Modifikace adenoviru hydrofilním HPMA kopolymerem vede k prodloužené cirkulaci viru v krvi a až k 1000 násobné redukci exprese genu (poklesu nespecificke infektivity). Expresi genu je možné obnovit specifickým směrováním polymerem modifikovaného viru pomocí specifických oligopeptidů i proteinů (transferin, herceptin). Specifita směrování virálního vektoru je výrazně závislá na struktuře směrující molekuly IPE i polymerem modifikované viry jsou slibnými vektory s potenciálním využitím v genové terapii

Poděkování Všem spolupracovníkům Oddělení biolékařských polymerů, ÚMH AV ČR (návrhy struktur, syntéza všech konjugátů a jejich fyzikálně chemická charakterizace) MBÚ AV ČR, kolektivu vedenému prof. RNDr. B. Říhovou, DrSc., (biologické vlastnosti polymerních směrovaných léčiv) Krebsforschunginstitut Heidelberg, kolektivu Dr. P. Peschkeho (biologické hodnocení polymerních diagnostik a terapeutik) University of Oxford, kolektivu prof.l.w. Seymoura (virální a nevirální vektory pro genovou terapii) Poděkování GA ČR, AV ČR, grantu EU a firmě ZENTIVA a.s. za finanční podporu výzkumu