Kvantitativní proteomická analýza

Kvantitativní proteomická analýza Martin Hubálek Kvantifikace proteinů Většinou pouze relativní srovnání odezvy mezi dvěma experimenty, případně mezi experimentem a standardem Množství proteinu bývá odvozeno z množství jednoho nebo více peptidů z proteinové sekvence Založené na porovnání výšky nebo plochy píku Peptidu(s) m/z (MS úroveň MS1) Fragmentu peptidu m/z (MS/MS úroveň MS2) Důležitý výběr peptidu Proteotypický peptid

Kvantifikace proteinů Bezznačková (Labelfree) MS1 MS2 Stabilní Izotopové značení ( stable isotope labelling) 2DE Cílená SRM Data Independent Analysis (DIA) SWATH Metabolické SILAC 14 N/ 15 N medium MS1 mtraq Nterm Dimethyl MS2 itraq TMT Chemické Cterm Esterifikace 16 O/ 18 O inkorporace Aminokyselina Lys (itraq) Cys (ICAT) Trp Proteotypický peptid Peptidy, které je možné zaznamenat pomocí LC MS Štěpitelné použitou proteázou (nejčastěji trypsin) Bez možných variabilních modifikaci (Met, Trp) Správná retence na C18 Ionizace v nanoesi Peptidy, které jsou specifické pro stanovovaný protein ve směsi s ostatními proteiny Prohledání sekvence proti všem dostupným proteinovým sekvencím

PEPTIDERANK Predikce proteotypických peptidů http://wlab.ethz.ch/peptiderank/#home MKSINILSFLLLSSTLSLVAFARSFTSENPIVLPTTCHDDDNLVLPEVYDQDGNPLRIGERY IINNPLLGAGAVYLYNIGNLQCPNAVLQHMSIPQFLGEGTPVVFVRKSESDYGDVVRVMTVV YIKFFVKTTKLCVDQTVWKVNDEQLVVTGGKVGNENDIFKIMKTDLVTPGGSKYVYKLLHCP SHLGCKNIGGNFKNGYPRLVTVDDDKDFIPFVFIKA Bezznačkové metody

Kvantifikace proteinů Bezznačková (Labelfree) MS1 MS2 Stabilní Izotopové značení ( stable isotope labelling) 2DE Cílená SRM Data Independent Analysis (DIA) SWATH Metabolické SILAC 14 N/ 15 N medium MS1 mtraq Nterm Dimethyl MS2 itraq TMT Chemické Cterm Esterifikace 16 O/ 18 O inkorporace Aminokyselina Lys (itraq) Cys (ICAT) Trp Selected Reaction Monitoring (SRM) http://www.nature.com/nmeth/journal/v9/n6/images/nmeth.2015f1.jpg

Selected Reaction Monitoring (SRM) Cílený přístup Výběr prekursoru (Peptide m/z) Q1 Fragmentace v kolizní cele Q2 Sken fragmentu (Peptide fragment m/z) Q3 Quantitation MS APLDNDIGVSEATR (Beta-galaktosidáza) 100 729.3654 729.8720 1.53e4 % 0 730.3918 736.4456 737.4578 715 720 725 730 735 740 745 m/z MSMS 100 y1 y3 y5 y6 y7 y8 y9 y10 y11 y12 y13 R TA ES V G I D N D L P A b2 b4 b6 719.3724 18.6 % 169.0914 563.2598 183.1405 326.1555 832.4432 1176.5780 1289.6802 833.4423 1290.7043 Přechody: ID Q1 Q3 CE 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z APLDNDIGVSEATRy8 729,4 832,5 42 APLDNDIGVSEATRy12 729,4 1289,6 42 APLDNDIGVSEATRy11 729,4 1176,6 42

XIC of MRM (80 pairs): 729,4/1176,6 Da ID: APLDNDIGVSEATR from Sample... Max. 1,8e5 cps. 1,8e5 1,6e5 1,4e5 729,4 832,5 1,2e5 1,0e5 8,0e4 6,0e4 4,0e4 2,0e4 0,0 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 Time, min XIC of MRM (80 pairs): 729,4/832,5 Da ID: APLDNDIGVSEATR from Sample... Max. 1,4e5 cps. 1,4e5 1,2e5 1,0e5 8,0e4 6,0e4 4,0e4 2,0e4 729,4 1176,6 XIC of MRM (80 pairs): 729,4/1176,6 Da ID: APLDNDIGVSEATR from Sample... 1,8e5 1,6e5 1,4e5 1,2e5 1,0e5 8,0e4 Max. 1,8e5 cps. 0,0 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 Time, min XIC of MRM (80 pairs): 729,4/1289,6 Da ID: APLDNDIGVSEATR from Sample... 1,28e5 1,20e5 1,00e5 8,00e4 6,00e4 4,00e4 Max. 1,3e5 cps. 729,4 1289,6 6,0e4 4,0e4 2,0e4 0,0 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 Time, min 2,00e4 0,00 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 Time, min Skyline sw pro tvorbu SRM přechodů i vyhodnocení výsledků Selekce nábojového stavu Selekce přechodů Optimalizace kolizní energie Finální metoda

Scheduled MRM maximalizace cyklu monitoruje každý MRM přechod jen očekávaném elučním čase redukuje počet překrývajících se přechodů zvyšuje čas měření pro každý přechod zlepšuje analytickou přesnost lepší LLOQ Cycle Time mnoho MRM málo MRM Intensity (cps) MRM XIC Time (mins)

AQUA Absolutní kvantifikace Stabilně izotopicky značený peptid o stejné sekvenci jakou kvantifikuji Peak ratio Light x Heavy PeptideSequence ProteinName ReplicateName Absolute spike RT RatioToStandard AGPESDGQFQFTGIK sp Q9JJW3 USMG5_RAT 150420_RHD50G50 50 fmol 54.54 4.0401 THSDQFLVSFK tr Q6PCU0 Q6PCU0_RAT 150420_RHD50G50 50 fmol 46.96 4.0608 Absolutní koncetrace proteinu USMG5: 50 * 4,0401 = 202 fmol Q6PCU0: 50* 4,0608 = 203 fmol

Full Dynamic Range Proteome Analysis of S. cerevisiae by Targeted Proteomics Figure 1 Cellular Concentrations of the Set of Measured Proteins Protein abundances are derived from Ghaemmaghami et al. (2003). Proteins detected by SRM assays are sorted by abundance to show the even distribution across the whole range of concentration (blue circles). Proteins for which the absolute abundance was measured using isotopicallylabeled standards are indicated on top of the graph (open circles). http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2009.05.051 SRM (MRM) peptidů Vysoce selektivní Široký dynamický rozsah

SWATH SWATHMS: Sequential Windowed data independent Acquisition of the Total Highresolution Mass Spectra Selekční okno prekurzoru kolem 25 mu (v SRM jednotka m/z) Fragmentacev kolizní cele MS/MS scan pro všechny prekurzory v cele fragmenty ze všech dohromady TripleTOF 5600 SWATHMS Adapted from Gillet et. al., Molecular & Cellular Proteomics, 2012

Příklad Affinity Purification coupled to Mass Spectrometry Cell culture Lysate Affinity purification Cloning Nterminally FLAG Ddi2 ptretight vector Hit verification Identification of hits Quantitative MS analysis Peptide preparation

Plot of Ttest tvalue versus pvalue. Red marks higlight proteins positively enriched in Ddi2 expressing cells Interakční proteiny Accession number Protein Name tvalue pvalue Fold Change sp P62987 RL40_HUMAN Ubiquitin60S ribosomal protein L40 7.50 7.24E06 4.37 sp P54727 RD23B_HUMAN UV excision repair protein RAD23 homolog B 6.52 2.84E05 11.61 sp P11142 HSP7C_HUMAN Heat shock cognate 71 kda protein 3.84 2.34E03 2.02 sp P08107 HSP71_HUMAN Heat shock 70 kda protein 1A/1B 3.37 5.60E03 1.87 sp O95757 HS74L_HUMAN Heat shock 70 kda protein 4L 3.10 9.24E03 1.75 sp P34932 HSP74_HUMAN Heat shock 70 kda protein 4 3.05 1.00E02 1.77 sp Q15424 SAFB1_HUMAN Scaffold attachment factor B1 2.79 1.63E02 1.39 sp P38646 GRP75_HUMAN Stress70 protein, mitochondrial 2.36 3.58E02 1.54 sp P11021 GRP78_HUMAN 78 kda glucoseregulated protein 2.24 4.46E02 1.39

a) b) Fig 5.: example of manual curation of statistical result. Proteins a) UV excision repair protein RAD23 homolog B, and protein b) was assigned significant by Ttest analysis. The manual curation of protein b) disproved the result. Stabilní izotopové značení Stabilní izotopy Těžké (heavy): 13 C, 15 N, 18 O, 2 H Lehké (light): 12 C, 14 N, 16 O, 1 H Zavedení jednoho atomu Trypsinové štěpení v H 2 18 O 15 N značené v buněčné kultuře Zavedení skupiny s několika těžkými izotopy Stable isotope labelling of amino acids in cell culture (SILAC) Isobaric tag for relative and absolute quantitation (itraq) Dimethyl labelling předpoklad Shodné chování v průběhu chromatografie a ionizace odpovídající H/L formy peptidu eluují ve stejný čas obě formy mají stejnou pravděpodobnost ionizace na pozadí danné matrice

Kvantifikace proteinů Bezznačková (Labelfree) MS1 MS2 Stabilní Izotopové značení ( stable isotope labelling) 2DE Cílená SRM Data Independent Analysis (DIA) SWATH Metabolické SILAC 14 N/ 15 N medium MS1 mtraq Nterm Dimethyl MS2 itraq TMT Chemické Cterm Esterifikace 16 O/ 18 O inkorporace Aminokyselina Lys (itraq) Cys (ICAT) Trp DOI: 10.1039/B618553N

Stabilní izotopové značení Metabolické Eg. SILAC Chemické Eg. Dimethyl labeling Značení stabilními izotopy - SILAC o Stable Isotope Labeling with amino ACids in cell culture (SILAC) o Metoda relativní kvantifikace proteinů ve dvou paralelně kultivovaných buněčných kulturách v médiu s lehkými nebo těžkými AK. o V mediu s těžkými AK se používá např.: Arg, Lys 13 C, 15 N o Kvantifikace MS1, ověření identity v MS2 o Nutné dosáhnout vysoké úrovně inkorporace těžkých AK do buněk o Minimálně 5 buněčných cyklů MS spektrum 2x nabitých iontů při SILAC experimentu 37

SILAC Inkorporace Inkorporace těžkých AK ( 13 C 15 N Arg, Lys) do buněčné kultury Protein selection Peptide selection H/L ratio = 35 i.e. incorporation level 97 % SILAC výsledek

SILAC Vzorky jsou smíseny na počátku experimentu Vhodné pro složité postupy přípravy vzorku Je možné použít shotgun i cílený přístup Auxotrofie pro Lys, Arg Snadné pouze v buněčných kulturách Metabolická konverze Arg na Pro Limitovaná multiplicita drahé Kvantifikace proteinů Bezznačková (Labelfree) MS1 MS2 Stabilní Izotopové značení ( stable isotope labelling) 2DE Cílená SRM Data Independent Analysis (DIA) SWATH Metabolické SILAC 14 N/ 15 N medium Nterm MS1 mtraq Dimethyl MS2 itraq TMT Chemické Cterm Esterifikace 16 O/ 18 O inkorporace Aminokyselina Lys (itraq) Cys (ICAT) Trp

Reakce Ntermini a εamino skupiny Lys s formaldehydem následovanou redukcí kyanoborohydridem sodným Dimethyl Labeling Boersema, P. J., et al. Triplex protein quantification based on stable isotope labeling by peptide dimethylation applied to cell and tissue lysates. Proteomics. 8, 2008, pp. 4624 4632. Dimethyl labelling Levné a snadno sehnatelné reagencie Reakce rychlá V roztoku po štěpení ostatní primarní aminy mohou reagovat s formaldehydem vynechat Tris, Am. Bic, použij TEAB Všechny kroky před smísením kriticky důležité pro kvantifikaci optimalizace

Izobarická značka pro rel. a abs. kvantifikaci itraq Isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation (itraq) Současná (relativní) kvantifikace až 4 vzorků. Sada 4 izobarických činidel, která se váží na aminoskupinu peptidů (proteinů). V MS mají stejný poměr m/z, v MS/MS poskytují 4 různé ionty. MS MS/MS Isobarická značka 145 Da itraq značky Relativní kvantifikace podle intenzit iontů m/z 114, 115, 116, 117 Možný i oktaplex 39 itraq Poměry jsou odečteny po peptidové fragmentaci MS/MS (MS2): Reporterové ionty a jejich poměry určují rozdíly v kvantitě

itraq Levnější než SILAC Reakce rychlá V roztoku po štěpení Stejné chování peptidu v průběhu analýzy až na rozdíl v MSMS spektru ostatní primarní aminy mohou reagovat s formaldehydem vynechat Tris, Am. Bic, použij TEAB Všechny kroky před smísením kriticky důležité pro kvantifikaci optimalizace Skutečné rozdíly v kvantitě jsou větší než naměřené Kvantifikace proteinů Bezznačková (Labelfree) MS1 MS2 Stabilní Izotopové značení ( stable isotope labelling) 2DE Cílená SRM Data Independent Analysis (DIA) SWATH Metabolické SILAC 14 N/ 15 N medium Nterm MS1 mtraq Dimethyl MS2 itraq TMT Chemické Cterm Esterifikace 16 O/ 18 O inkorporace Aminokyselina Lys (itraq) Cys (ICAT) Trp

Dvoudimensionální elektroforéza 2DE princip metody První dimense pi 3 pi 10 _ Polyakrylamidový gel Druhá dimense 2DE relativní kvantifikace