Vztah mutace genu TP53 a přežití pacientů s chronickou lymfocytární leukémií

ROČNÍK 3 ČÍSLO 2 11. března 211 P Ů V O D N Í S D Ě L E N Í Vztah mutace genu TP53 a přežití pacientů s chronickou lymfocytární leukémií Thorsten Zenz, Barbara Eichhorst, Raymonde Busch, Tina Denzel, Sonja Häbe, Dirk Winkler, Andreas Bühler, Jennifer Edelmann, Manuela Bergmann, Georg Hopfinger, Manfred Hensel, Michael Hallek, Hartmut Döhner a Stephan Stilgenbauer Viz související článek na str. 64 University of Ulm, Ulm; University of Cologne, Cologne; Technical University of Munich; Ludwig Maximilians University, Munich; University of Heidelberg, Heidelberg, Germany; Hanusch Hospital, Vienna, Austria. Podáno 23. prosince 29; přijato 28. května 21; publikováno online před tiskem na www.jco.org 9. srpna 21. Psáno pro German Chronic Lymphocytic Leukemia Study Group. Podpořeno German José Carreras Leukemia Foundation (Grant No. R6/28v), Deutsche Krebshilfe (Grants No. 18355, 15142 a 7 2353), Global CLL Research Foundation, Competence Network Lymphoma Bundesministerium für Bildung und Forschung, Cologne, a Medac Schering Onkologie, Munich. Prohlášení autorů o možném střetu zájmů a podíl jednotlivých autorů na přípravě článku se nacházejí na jeho konci. Odkaz na databázi klinických studií je dostupný na JCO.org. Adresa pro korespondenci: Stephan Stilgenbauer, MD, Department of Internal Medicine III, University of Ulm, Albert Einstein Allee 23, 8981 Ulm, Germany; e mail: stephan.stilgenbauer@uniklinik ulm.de. 21 by American Society of Clinical Oncology 732-183X/1/2829-4473/$2. DOI: 1.12/JCO.29.27.8762 S O U H R N Cíl Přesný prognostický význam mutace genu TP53 je stále nejasný, stejně tak jako její začlenění do léčebných schémat pro chronickou lymfocytární leukémii (chronic lymphocytic leukemia, CLL). Rozhodli jsme se definovat význam mutace TP53 u CLL. Pacienti a metody Pomocí vysokovýkonné kapalinové chromatografie (high performance liquid chromatography, HPLC) jsme hodnotili mutace TP53 (exony 2 až 11) u pacientů zařazených do prospektivní randomizované studie (n = 375), s dobou sledování 52,8 měsíce (German CLL Study Group CLL4 trial; fludarabin [F] vs. F + cyklofosfamid [FC]). Výsledky Nalezli jsme mutaci TP53 u 8,5 % pacientů (28 z 328 pacientů). Žádný pacient s mutací TP53 nedosáhl léčbou kompletní remise. Pacienti s mutací TP53 měli ve srovnání s pacienty bez mutace TP53 statisticky signifikantně zkrácenou (p <,1) dobu do progrese (progression free survival, PFS; 23,3 vs. 62,2 měsíce) i celkové přežití (overall survival, OS; 29,2 vs. 84,6 měsíce). Mutace TP53 byla nalezena v případě absence delece 17p u 4,5 % pacientů. PFS a OS byly obdobné u pacientů s delecí 17p i u pacientů s mutací TP53 bez delece 17p. Dle mnohorozměrné analýzy byla mutace TP53 nejsilnějším prognostickým faktorem ovlivňujícím PFS (poměr rizik [hazard ratio, HR] = 3,8; p <,1) a OS (HR = 7,2; p <,1). Ostatními nezávislými prediktory pro OS byly stav mutace IGHV (HR = 1,9), delece 11q (HR = 7,2), delece 17p (HR = 2,3) a léčba kombinací FC (HR = ). Závěr Pacienti s CLL s mutací TP53, nezávisle na přítomnosti delece 17p, mají špatnou prognózu, pokud jsou léčeni chemoterapií založenou na fludarabinu. Proto by měla být zahrnuta analýza mutace TP53 do celkového zhodnocení před zahájením léčby pacientů s CLL. U pacientů s mutací TP53 byly měly být zvažovány jiné možnosti léčby. J Clin Oncol 28:4473 4479. 21 by American Society of Clinical Oncology ÚVOD Molekulární prognostické markery jako nemutovaný gen IGHV, exprese ZAP7, delece 11q a především delece 17p se zdají být důležitější pro výsledek léčby pacientů s chronickou lymfocytární leukémií (chronic lymphocytic leukemia, CLL) než vlastní volba iniciální léčby. 1 7 Na základě genomických aberací byl ustanoven hierarchický prognostický model a byl potvrzen v prospektivních studiích. 2,6,8,9 Opakovaně se prokázalo, že delece 17p predikuje špatnou odpověď na chemoterapii a je spojena s nejkratším celkovým přežitím (overall survival, OS). 1,3,6,1 Rezistence na léčbu CLL s delecí 17p byla přisouzena faktu, že zbývající alela TP53 na úseku 17p13 je mutovaná. 1,11 Ačkoli je většina současných léčebných protokolů postavena na účinku konvenčních cytostatik, toto poslední zjištění je z praktického hlediska velmi zajímavé, protože začínají být dostupné nové látky, které mohou účinkovat nezávisle na poškození DNA a/nebo p53. 12,13 Současné studie začínají vyhodnocovat léčbu (specifickou pro genotyp) u pacientů s delecí 17p. Nicméně tato podskupina představuje pouze 5 7 % všech pacientů před zahájením chemoterapie první linie. Počet pacientů, jejichž nemoc neodpovídá na režimy založené na fludarabinu, je ale výrazně vyšší a delece 17p vysvětluje pouze část těchto rezistencí na fludarabin. 14,15 Proto je potřeba hledat další markery pro špatnou prognózu a pro selhání standardní léčby. Prognostický vliv mutace TP53 u CLL byl již mnohokrát naznačen. 1,16 2 Bohužel nedosta, Vol 28, No 29 (October 1), 21: pp 4473 4479 21 by American Society of Clinical Oncology 57

Zenz et al. tek podrobných genetických analýz, malé skupiny vzorků a heterogenita jednotlivých kohort komplikovaly přesné definování role mutace TP53 ve vztahu k deleci 17p. Ve většině studií byla zjištěna mutace TP53 při absenci delece 17p (prostá mutace TP53) u zhruba 5 % pacientů. S ohledem na jiné známé prognostické faktory jsou zapotřebí velké prospektivní studie, aby byl potvrzen prognostický vliv mutace TP53. 11,21 Doposud jediná prospektivní studie plně publikovaná, která byla zaměřena na prognostický význam mutace TP53 a deleci 17p, byla US Eastern Cooperative Oncology Group 2997 trial. V ní nebyl prokázán prognostický význam mutace TP53. Nicméně nepotvrzené mutace a polymorfismy v zárodečných liniích byly spojeny se skutečnými mutacemi ve stejné skupině, což výrazně ztěžuje interpretaci. 6 Ve snaze zhodnotit prognostický význam mutace TP53 ve vztahu k deleci 17p jsme analyzovali velkou CLL studiovou populaci (German CLL Study Group CLL4 trial; randomizace fludarabin [F] vs. F + cyklofosfamid [FC] v první linii léčby). 22 Naše poznatky pevně ustanovují mutaci TP53 jako ústřední prognostický faktor u CLL, který je nezávislý na deleci 17p. Stanovení mutace TP53 by mělo být začleněno do prognostických modelů pro CLL, aby skupině pacientů s primárně špatnou prognózou léčených konvenční chemoterapií mohla být nabídnuta léčba specifická pro určitý genotyp nemoci. PACIENTI A METODY Pacienti, materiál, metody Do studie CLL4 byli zařazeni pacienti s CLL, kteří vyžadovali léčbu. Podrobnosti týkající se vedené studie byly již dříve publikovány. 22 Diagnostika, požadavky na léčbu a vyhodnocování léčebných odpovědí bylo založeno na doporučeních pracovní skupiny, která se opírala o doporučení National Cancer Institute (NCI). 23 Pacienti byli zařazeni do studie v případě, že měli nemoc ve stadiu Binet C, anebo A či B, a to jen v případě, že nemoc rychle progredovala, nebo se zhoršovaly symptomy podmíněné zvětšením lymfatických orgánů, nebo pacienti měli závažné symptomy B (pozn. překl.: standardní důvody pro zahájení léčby CLL). Léčba ve studii byla umožněna všem nepředléčeným pacientům s CLL ve věku 18 65 let. Léčebný protokol byl schválen revizní radou mnichovské univerzity. Před vstupem do studie všichni pacienti podepsali informovaný souhlas. Randomizace a léčebné schéma Studie byla zahájena v červenci 1999 a nábor byl dokončen v červenci 23. Dohromady bylo zařazeno 375 pacientů. Celkem 13 pacientů nesplnilo vstupní či vylučovací kritéria, a proto byli vyřazeni z analýzy. Podle ramena randomizace dostávali pacienti buď fludarabin (F 25 mg/m 2 ) aplikovaný intravenózně 5 dní, nebo fludarabin a cyklofosfamid (F 3 mg/m 2 ; FC 25 mg/m 2 ) aplikované intravenózně po dobu 3 dnů. Oba režimy byly opakovány v intervalu 28 dní, v maximálním počtu šesti sérií. Genetická analýza Analýza pomocí fluorescenční hybridizace in situ (fluorescence in situ hybridization, FISH) a sekvenování IGHV byly prováděny stejně, jako bylo již v minulosti publikováno. 2,24 Shoda zárodečných linií 98 % byla určena jako cut off (hraniční bod) mezi IGHV mutovanými a IGHV nemutovanými vzorky. Genomická nerovnováha a chromosomální disomie (pozn. překl.: zdvojení stejného chromosomu) byly analyzovány ve skupině 13 vzorků s prostou mutací TP53, a to pomocí Affymetrix 5k SNP array (Affymetrix, Santa Clara, CA). Data byla analyzována pomocí Copy Number Analyzer for GeneChip (Cancer Genomics Project, http://www.genome.umin.jp/). TP53 denaturing High Performance Liquid Chromatography a sekvenování Metoda vysokovýkonné kapalinové chromatografie (Denaturing High Performance Liquid Chromatography, DHPLC) byla užita k identifikaci vzorků obsahující mutace v exonech 2 až 11 (kódující gen TP53; n = 328 s dostupnou DNA). DHPLC analýza je založena na teplotně závislých rozdílech retenčních časů v chromatografické koloně u produktů polymerázové řetězové reakce (polymerase chain reaction, PCR), které jsou rozdílné pro homoduplexní (wild type) a heteroduplexní (mutovanou) DNA. Pro detekování homozygotní mutace byl každý vzorek smíšen se známou wild type DNA kontrolou (2 %). Stejně tak byly přímo sekvenovány ty vzorky s delecí 17p, ve kterých nebyla mutace TP53. Všechny vzorky byly denaturovány a pomalu zchlazeny na pokojovou teplotu před provedením DHPLC, aby byla umožněna maximální heteroduplexní formace (95 C 2 min, následně pokles o 1 C každých 4 s do dosažení teploty 45 C [3 min]). Oligonukleotidové primery stejně jako podmínky DHPLC byly zvoleny stejné, jaké byly již dříve publikovány (dostupné na vyžádání). 1,25 Ukázalo se již dříve, že tato metoda je lepší než single strand conformation polymorphism a spolu s přímým sekvenováním je metodou volby v mnoha centrech, kde se provádějí analýzy mutace TP53. 26,27 Všechny vzorky byly podrobeny automatickému fluorescenčnímu sekvenování pomocí Big Dye Terminator Kit a sekvenátoru ABI 31 (Applied Biosystems, Darmstadt, Germany). Sekvence primeru jsou dostupné na požádání. Primery byly navrženy tak, aby zahrnuly všechny kódující exony a hranice mezi introny a exony. Statistická analýza založená na principu intent to treat zahrnovala všechny zařazené pacienty s dostupnou DNA. Čas do události (time to event) byl odhadnutý pomocí Kaplanových Meierových diagramů a výsledky léčby byly porovnávány pomocí log rank testu. Celkové přežití bylo stanoveno jako doba od randomizace do úmrtí a doba do progrese (progression free survival, PFS) byla stanovena jako doba od randomizace do zjištění progrese nemoci nebo do úmrtí. Doba přežití bez léčby (treat ment free survival) byla počítána jako čas od ukončení léčby do zahájení léčby druhé linie nebo do úmrtí. Odpovědi na léčbu byly stanovovány pro všechny pacienty, kteří absolvovali alespoň jednu sérii chemoterapie. Medián doby sledování přežívajících pacientů byl 52,8 měsíce. Statistická významnost byla stanovena hodnotou p <,5. Analýza byla provedena s použitím SPSS, verze 17. (SPSS, Chicago, IL). Srovnání jednotlivých skupin podle klinických, laboratorních a genetických dat bylo provedeno pomocí Fisherova exaktního testu (skupinové parametry). Prognostické faktory pro OS a PFS byly analyzovány pomocí Coxových regresních modelů. Kromě mutace TP53 zahrnovaly modely věk, rameno léčby, stadium nemoci dle Bineta, genomické aberace a přítomnost/nepřítomnost mutace IGHV. VÝSLEDKY Incidence Celkově jsme nalezli mutaci TP53 u 8,5 % pacientů (28 z 328 pacientů). Čtrnáct z 16 pacientů s delecí 17p mělo mutaci TP53 (87,5 %). U těch dvou pacientů s delecí 17p, u kterých nebyla nalezena mutace TP53, bylo dle FISH malé zastoupení buněk 17p (19 21 %), což by mohlo být vysvětleno určitými limity této techniky. Nepřítomnost mutace u zmíněných dvou pacientů byla potvrzena i jinými metodami (přímé sekvenování a resekvenování [Amplichip, Roche Molecular Diagnostics, Pleasanton, CA]). Mutaci TP53 bez přítomnosti delece 17p jsme nalezli u 4,5 % pacientů (14 z 291 pacientů). U pacientů s prostou mutací TP53 jsme potvrdili nepřítomnost delece 17p pomocí metody single nucleotid polymorphism array (n = 13). Nicméně 3 ze 13 pacientů (23 %) měli disomii v oblasti 17p včetně lokusu pro TP53. 58 21 by American Society of Clinical Oncology

Mutace genu TP53 a přežití u chronické lymfocytární leukémie Srovnání genomického profilu CLL s mutací či bez mutace TP53 ukazuje tab. 1. I když nebyly signifikantní rozdíly u pacientů s mutací či bez mutace TP53 ve vztahu ke stavu genu IGHV byly i tak v obou skupinách genomické rozdíly. Ve skupině s mutací TP53 byla vyšší incidence delece 17p (p <,1) a nízká incidence trisomie 12. chromosomu (podle pořadí; 13,9 % vs. %; p =,3). Pacienti s mutací TP53 byli starší, měli vyšší koncentraci laktátdehydrogenázy a častěji měli lymfadenopatii (> 5 cm; tab. 1). Podle typu mutace TP53 jsme pozorovali 3 splice site mutace, tři delece, jednu inzerci a 24 missens mutací v exonech 5 až 8. Missens a posuvné (frameshift) mutace byly výhradně lokalizovány v DNA vazebné doméně. Tři pacienti měli dvě odlišné mutace (Dodatek). Jedenáct z 24 missense mutací byly tranzice, kdežto trans verze byly u 13 z 24 mutací (Dodatek). Výsledky u pacientů s mutací TP53 Pro zhodnocení celkového vlivu mutace TP53 u CLL jsme nejdříve hodnotili léčebnou odpověď, PFS a OS s ohledem na přítomnost/chybění mutace TP53. Odpověď na léčbu byla signifikantně horší u pacientů, kteří měli mutaci TP53 nebo deleci 17p (tab. 2). Deset pacientů (4 %) z 25 s mutací TP53 nedosáhlo ani kompletní (complete response, CR) ani parciální remise (partial response, PR) na rozdíl od 25 (8,9 %) z 282 pacientů bez mutace TP53 (p <,1). Nikdo z pacientů s mutací TP53 nedospěl do kompletní remise ( z 25 pacientů), kdežto 39 (13,8 %) z 282 pacientů bez mutace kompletní remise dosáhlo (p =,55). Pacienti s CLL bez mutace TP53 (n = 281) měli PFS 62,2 měsíce, a to při mediánu sledování (follow-up) 52,8 měsíce. Naproti tomu pacienti s mutací TP53 (n = 26) měli PFS 23,3 měsíce (p <,1; obr. 1A). Medián OS byl u pacientů s mutací TP53 výrazně kratší (29,2 měsíce; n = 28) ve srovnání s pacienty bez mutace TP53 (84,6 měsíce; n = 3; p <,1; obr. 1B). Výsledky pacientů s mutací TP53 bez delece 17p Špatná prognóza pacientů s mutací TP53 by mohla být způsobena vysokou konkordancí s delecí 17p, která je spojena se špatnou odpovědí na chemoterapii a krátkými PFS a OS. K posouzení, zda je samotná mutace TP53 prognosticky významná, byla skupina pacientů s mutací TP53 bez delece 17 p (prostá mutace TP53) hodnocena samostatně proti skupině pacientů s delecí 17p. V tab. 2 jsou léčebné remise výsledných tří skupin pacientů. Celková odpověď na léčbu (overall response rate, ORR) byla signifikantně lepší u pacientů bez prosté mutace TP53, nebo delece 17p (ORR: 91 % vs. 6 % pro 17p mutaci a 67 % pro prostou mutaci TP53; p <,1; Genetika a charakteristika Tabulka 1. Genetický profil a klinické charakteristiky pacientů s CLL stratifikovaných dle mutace TP53 Absence mutace TP53 Přítomnost mutace TP53 Počet pacientů % Počet pacientů % Cytogenetika (FISH) 29 27* 17p 2 14 51,9 <,1 11q 62 22,7 3 11,1 6 trisomie 12 38 13,9,3 normální 72 26,4 5 18,5 9 13q prostá 99 36,3 5 18,5,9 Gen IGHV 294 27 nemutovaný 188 63,9 21 77,8 mutovaný 16 36,1 6 22,2,2 Klinické charakteristiky stadium dle Bineta A 26 8,9 2 7,1 B 166 56,8 15 53,6 C 1 34,2 11 39,3 5 B symptomy 119 41,5 14 5 3 pohlaví,25 muž 23 72 23 82,1 žena 79 28 5 17,8 splenomegalie 24 83,6 24 85,7 lymfadenopatie > 5 cm 49 18,7 9 37,5,36 počet leukocytů, medián, /μl 71,75 65,2 2 hemoglobin, medián, g/l 13 125,5 6,5 počet trombocytů, medián, /μl 145, 136, 1 medián LDH, U/l 219,5 282,5,34 věk, medián, roky 58 61,1 terapie fludarabin 153 51 11 39,3 fludarabin + cyklofosfamid 147 49 17 6,32 Zkratky: CLL (chronic lymphocytic leukemia), chronická lymfocytární leukémie; FISH (fluorescence in situ hybridization), fluorescenční hybridizace in situ; LDH (lactate dehydrogenase), laktátdehydrogenáza. * Výsledky FISH byly dostupné u 27 z 28 pacientů. Absence delece 17p u pacienta s chybějícím výsledkem FISH byla potvrzena pomocí single nucleotide polymorphism array. p www.jco.org 21 by American Society of Clinical Oncology 59

Zenz et al. Odpověď Tabulka 2. Odpověď na léčbu u pacientů s CLL po první linii s F nebo FC podle genetiky Bez mutace TP53/bez 17p (n = 261) 17p (n = 15) Mutace TP53/bez 17p (n = 12) Celkem (N = 288) Počet pacientů % Počet pacientů % Počet pacientů % Počet pacientů % Refrakterní 23 8,8 6 4 4 33,3 33 11,5,1 CR 37 14,2 1 6,7 38 13,2 7 Zkratky: CLL (chronic lymphocytic leukemia), chronická lymfocytární leukémie; F (fludarabine), fludarabin; FC (fludarabine and cyclophosphamide), fludarabin a cyklofosfamid; CR (complete response), kompletní remise. * Dle kritérií National Cancer Institute (nedosažení parciální nebo kompletní remise alespoň na 6 měsíců). 23 p tab. 2). Nikdo z pacientů s prostou mutací TP53 nedospěl do kompletní remise, kdežto 6,7 % (n = 1) pacientů s delecí 17p (pozn překl.: bez mutace TP53) a 14,2 % pacientů bez mutace TP53 a bez delece 17p kompletní remise dosáhlo (p = 7). Tyto výsledky naznačují, že pacienti s prostou mutací TP53 mají obdobně špatnou prognózu jako pacienti s CLL s delecí 17p. Medián PFS byl také obdobný u pacientů s delecí 17p (19,2 měsíce) a u pacientů s prostou mutací TP53 (23,3 měsíce). Obě skupiny měly kratší PFS ve srovnání se zbývajícími pacienty, kteří A Část pacientů bez progrese B Část pacientů přežívajících,3,2,3,2 bez mutace TP53 (n = 281) mutace TP53 (n = 26) bez mutace TP53 (n = 3) mutace TP53 (n = 28) Obrázek 1. Mutace TP53 je spojena se špatnými výsledky léčby chronické lymfocytární leukémie (chronic lymphocytic leukemia, CLL). (A) Při mediánu sledování (follow up) 52,8 měsíců měli pacienti s CLL bez mutace TP53 medián doby do progrese (progression free survival, PFS) 62,2 měsíců (n = 281; modrá křivka). Pacienti s CLL s mutací TP53 měli PFS 23,3 měsíců (n = 26; zlatá křivka; p <,1). (B) Celkové přežití pacientů s mutací TP53 bylo špatné, s mediánem 29,2 měsíců (n = 28; zlatá křivka) proti 84,6 měsícům u pacientů bez mutace TP53 (n = 3; modrá křivka; p <,1). neměli žádnou z výše uvedených genetických abnormalit (61,8 měsíce; p <,1; obr. 2A). Negativní prognostický vliv prosté mutace TP53 nebo delece 17p byl ještě výraznější, pokud se mezi jednotlivými skupinami porovnávalo celkové přežití. Po dobu sledování nebylo u pacientů bez žádné z výše uvedených genetických abnormalit dosaženo mediánu OS. Medián OS byl 3,2 měsíce A Část pacientů bez progrese B Část pacientů přežívajících,3,2,3,2 Obrázek 2. Pacienti s chronickou lymfocytární leukémií (chronic lymphocytic leukemia, CLL) s mutací TP53 bez delece 17p měli podobné výsledky jako pacienti s CLL s delecí 17p. (A) Doba do progrese (progression free survival, PFS) pacientů s delecí 17p (n = 15; šedá křivka), pacientů s prostou mutací TP53 (bez delece 17p; n = 13; zlatá křivka) a zbývajících pacientů (n = 26; modrá křivka). Medián PFS byl signifikantně kratší u pacientů s delecí 17p (19,2 měsíců) a s prostou mutací TP53 (23,3 měsíců) ve srovnání s pacienty bez žádné z uvedených abnormalit (61,8 měsíců; p <,1). (B) Celkové přežití (overall survival, OS) pacientů s delecí 17p (n = 16; šedá křivka), pacientů s prostou mutací TP53 (n = 14; zlatá křivka) a zbývajících pacientů (n = 277; modrá křivka). Medián OS byl signifikantně kratší u pacientů s delecí 17p (19,2 měsíců) a s prostou mutací TP53 (3,2 měsíců) ve srovnání s pacienty bez žádné z uvedených abnormalit (medián OS nebyl dosažen; p <,1). 6 21 by American Society of Clinical Oncology

Mutace genu TP53 a přežití u chronické lymfocytární leukémie u pacientů s prostou mutací TP53 a 19,2 měsíce u pacientů s delecí 17p (p <,1, obr. 2B). Mutace TP53 a účinek léčby Ke zhodnocení potenciálního léčebného účinku v jednotlivých ramenech studie (F vs. FC) dle stavu TP53 (ztráta nebo mutace) jsme sledovali účinek léčby v jednotlivých genetických podskupinách (obr. 3). Výsledky léčby pacientů s delecí 17p a prostou mutací TP53 byly v obou ramenech léčby obdobné (data nejsou k dispozici). Bez mutace TP53 dosáhlo 5,6 % pacientů CR v rameni F (8 ze 142 pacientů) a 22,1 % v rameni FC (31 ze 14 pacientů). U žádného pacienta s mutací TP53 nebylo ani v jednom z léčebných ramen dosaženo CR (F z 1 pacientů; p = ; FC z 15 pacientů; p =,43). U pacientů bez mutace TP53 bylo ORR 84,5 % v rameni F (12 ze 142 pacientů) a 97,9 % v rameni FC (137 z 14 pacientů). U pacientů s mutací TP53 bylo ORR 6 % v obou ramenech léčby (F 6 z 1 pacientů; p =,69; FC 9 z 15 pacientů; p <,1). Druh léčby neměl u pacientů s mutací TP53 vliv na časem definované A Část pacientů bez progrese B Část pacientů přežívajících,3,2,3,2 Obrázek 3. Léčebný účinek (fludarabin [fludarabine, F] vs. F + cyklofosfamid [fludarabine and cyclophosphamide, FC]) u jednotlivých podskupin pacientů s chronickou lymfocytární leukémií (chronic lymphocytic leukemia, CLL) podle mutace TP53 (A) Doba do progrese (progression free survival, PFS) skupiny s mutací TP53 podle léčebného ramene. PFS byl identický u pacientů s CLL s mutací TP53, kteří dostávali F (23,3 měsíců; n = 1; modrá křivka) či FC (19,2 měsíců; n = 16; zlatá křivka; p = 6). (B) Celkové přežití (overall survival, OS) skupiny s mutací TP53 podle léčebného ramene. OS byl identický u pacientů s CLL s mutací TP53, kteří dostávali F (medián OS 31,2 měsíců; n = 11; modrá křivka) či FC (medián OS 29,2 měsíců; n = 17; zlatá křivka; p = 2). sledované parametry (PFS 23,3 měsíce pro F vs. 19,2 měsíce pro FC; OS 31,2 měsíce pro F vs. 29,2 měsíce pro FC; obr. 3A a 3B). Mnohorozměrný model prognostických faktorů Pro zhodnocení, zda je mutace TP53 nezávislý prognostický faktor, jsme vytvořili mnohorozměrný model, který zahrnoval následující parametry: věk, stadium dle Bineta, genomické aberace (delece 17p a delece 11q), stav mutace IGHV a stav mutace TP53. Nezávislými předpovědními faktory pro PFS byla léčba v rameni FC (poměr rizik [hazard ratio, HR] = ), delece 11q (HR = 1,7) a mutace TP53 (HR = 3,8), kdežto delece 17p prediktivním faktorem nebyla (tab. 3). Pro OS byly nezávislými předpovědními faktory mutace TP53 (HR = 7,2), nemutovaný stav genu IGHV (HR = 1,9), delece 11q (HR = 1,9), delece 17p (HR = 2,3) a léčba FC (HR = ; tab. 3). Model, který zahrnoval deleci 17p s mutací TP53, měl výsledky podobné. DISKUSE Genomické aberace hodnocené metodou FISH umožňují rozdělení jednotlivých skupin CLL dle délky přežití. 2,3,9,12 Mezi ostatní prognostické faktory u CLL patří koncentrace sérových markerů, stav genu IGHV a exprese ZAP7. 4,5,7,28,29 I když existuje velké množství markerů, studie zaměřené na genotypické podskupiny CLL byly uskutečněny teprve nedávno, a to na skupině pacientů s CLL s delecí 17p, kteří mají špatnou prognózu. Přes uvedené pokroky je ale zřejmé, že delece 17p vysvětluje jen u části pacientů jejich špatnou prognózu. 15 Tato současná studie zaměřená na nalezení dalších podskupin pacientů s CLL s vysokým rizikem zkoumala vliv mutace TP53 u pacientů zařazených do randomizované studie CLL4 srovnávající F s FC v první linii léčby. Bez selekčního zkreslení (bias) jsme byli schopni analyzovat 328 ze 362 zařazených pacientů. Dostatečně dlouhá doba sledování (follow-up) je velmi důležitá, aby byly správně zhodnoceny prognostické faktory u chronických onemocnění. Objevili jsme nezávislý prognostický vliv mutace TP53 na PFS a hlavně na OS. Jako klíčový nález můžeme označit to, že skupina pacientů s mutací TP53 bez delece 17p má podobné početní zastoupení i léčebné výsledky jako skupina pacientů s delecí 17p. Ačkoli jsou tyto výsledky podobné těm z předchozích studií retrospektivních kohort, předchozí prospektivní studie zaměřená na vliv mutace TP53 (US Eastern Cooperative Oncology Group 2997) neprokázala prognostický význam této mutace na léčebnou odpověď či PFS. Nicméně ve srovnání s naší prací měla výše uvedená studie relativně krátké sledování a nepotvrzené mutace byly sloučeny do stejné skupiny se skutečnými mutacemi TP53, což výrazně komplikuje interpretaci výsledků. 6 Naše výsledky jasně ukazují souvislost mezi špatnými klinickými výstupy a přítomností mutace TP53, zároveň ale nasvědčují tomu, že abnormality p53 vysvětlují špatnou prognózu jen části pacientů s refrakterní CLL. Odhadovalo se, že část pacientů s CLL refrakterní k chemoterapii, která má ztrátu nebo mutaci TP53, tvoří 4 5 %. 15,3 Naše data ale naznačují, že 29 % pacientů s F refrakterní CLL léčených v první linii může mít mutaci TP53 a/nebo deleci 17p. Mutace TP53 je spojena se špatnou prognózou u celé řady maligních nádorů (např. karcinom prsu, karcinomy hlavy a krku, vysoce maligní lymfomy). 31,32 Klinický význam mutace TP53 je www.jco.org 21 by American Society of Clinical Oncology 61

Zenz et al. PFS randomizace: F vs. FC 11q : ano vs. ne Tabulka 3. Coxova regresní analýza PFS (n = 28, * 147 událostí) a OS (n = 293, * 79 událostí) Parametry Poměr rizik pro progresi 95% CI p mutovaný TP53: ano vs. ne OS stav genu IGHV: mutovaný vs. nemutovaný randomizace: F vs. FC 17p : ano vs. ne 11q : ano vs. ne mutovaný TP53: ano vs. ne 16 1,735 3,784 1,92 2,31 1,91 7,24 4 5 1,2 2,48 2,38 6,1 1,1 3,34,38 4 9 4,91 1,16 3,15 3,86 13,56 POZNÁMKA: Mnohorozměrný model zahrnoval věk, stadium dle Bineta, genomické aberace (delece 17p a delece 11q), mutace genu IGHV a mutace TP53. Zkratky: PFS (progression free survival), čas do progrese; OS (overall survival), celkové přežití; F (fludarabine), fludarabin; FC (fludarabine and cyclophosphamide), fludarabin a cyklofosfamid. * Počet analyzovaných pacientů (se všemi dostupnými parametry). Následující parametry nebyly signifikantní: věk (< 6 let vs. 6 let), stadium dle Bineta (A, B vs. C), status IGHV a 17p. Následující parametry nebyly signifikantní: věk (< 6 let vs. 6 let), stadium dle Bineta (A, B vs. C).,4,2 <,1,21,27,29,11 <,1 zvláště významný u CLL, což může být také vysvětleno relativně indolentním průběhem nemoci u pacientů bez mutace. Zájem o prognostické faktory je způsoben i tím, že máme pro pacienty s CLL stále se rozšiřující možnosti léčby, které se výrazně navzájem odlišují v intenzitě i mechanismu účinku. 33 35 Určení skupiny pacientů s odlišnou prognózou je proto velmi důležité. Současná studie umísťuje podskupinu pacientů s mutací TP53 (bez ohledu na deleci 17p) do stejné kategorie s pacienty s CLL s delecí 17p. Tyto nálezy mohou mít okamžité důsledky, protože se zkoumají různé alternativní protokoly v léčbě CLL v první linii, včetně časné alogenní transplantace u zmíněné podskupiny pacientů. Na tyto současné výsledky je ale potřeba nahlížet v kontextu změny v první linii léčby zahrnující chemoterapii/imunoterapii s režimy jako FC plus rituximab (FCR). Analýza studie CLL8 naznačuje, že léčebné remise a výsledky se u pacientů s delecí 17p přidáním rituximabu příliš nevylepšují. 9 Časné výsledky studie CLL8 (FC vs. FCR) publikované ve formě abstraktu také ukazují špatnou prognózu pacientů s mutací TP53, což znamená, že pacienti s mutací TP53 jsou kandidáty pro klinické studie a alogenní transplantace i v éře režimu FCR. 36 Uvedené výsledky také naznačují, že by měla být analýza TP53 začleněna do diagnostických laboratorních vyšetření u pacientů s CLL vyžadujících léčbu. V současných postupech (guidelines) je doporučeno zhodnocení cytogenetiky metodou FISH v klinických studiích i mimo ně, kdežto zhodnocení mutace IGHV, CD38 a ZAP7 je doporučeno jen v klinických studiích. 37 Na základě našich výsledků byl měla být mutace TP53 zařazena na seznam genetických testů u CLL. Závěrem lze tvrdit, že CLL s mutací TP53 má špatnou prognózu nezávisle na přítomnosti delece 17p. Proto by mělo být testování mutace TP53 začleněno do genetického vyšetření pacientů s CLL a výsledky by měly být zohledněny v léčebných indikacích. Začleněním mutace TP53 do laboratorních vyšetření by se pravděpodobně zdvojnásobil počet pacientů se špatnou prognózou, kteří by optimálně měli být léčeni odlišnými protokoly. Závěrem lze konstatovat, že léčebné výsledky by měly být u CLL hodnoceny v kontextu typických genetických změn, stejně jako u ostatních typů leukémií. PROHLÁŠENÍ AUTORŮ O MOŽNÉM STŘETU ZÁJMŮ Všichni autoři vyplnili toto prohlášení; následující autoři udali finanční nebo jiný zájem, který je relevantní pro látku posuzovanou v tomto článku. Určité vztahy označené písmenem U jsou ty, za něž nebyla obdržena žádná kompenzace; vztahy označené písmenem C byly kompenzovány. Pro detailní popis kategorií prohlášení nebo pro více informací o politice střetu zájmů ASCO odkazujeme čtenáře na Author Disclosure Declaration a kapitolu Disclosures of Potential Conflicts of Interest v informacích pro autory. Zaměstnání nebo vedoucí pozice: Nikdo Funkce konzultanta nebo poradce: Stephan Stilgenbauer, Bayer Schering Pharma (C)Vlastnictví akcií: Nikdo Honoráře: Thorsten Zenz, Bayer Schering Pharma Financování výzkumu: Stephan Stilgenbauer, Bayer Schering Pharma Znalecký posudek: Nikdo Jiné odměny: Nikdo PODÍL AUTORŮ NA ČLÁNKU Koncepce a návrh: Thorsten Zenz, Barbara Eichhorst, Michael Hallek, Hartmut DÖhner, Stephan Stilgenbauer Administrativní pomoc: Barbara Eichhorst Poskytnutí studijních materiálů nebo pacientů: Barbara Eichhorst, Manuela Bergmann, Georg Hopfinger, Manfred Hensel, Michael Hallek, Hartmut Döhner, Stephan Stilgenbauer Sběr a kompletace údajů: Thorsten Zenz, Barbara Eichhorst, Raymonde Busch, Tina Denzel, Sonja Häbe, Dirk Winkler, Andreas Bühler, Jennifer Edelmann, Michael Hallek, Stephan Stilgenbauer Analýza a interpretace údajů: Thorsten Zenz, Barbara Eichhorst, Raymonde Busch, Tina Denzel, Sonja Häbe, Dirk Winkler, Andreas Bühler, Jennifer Edelmann, Michael Hallek, Hartmut Döhner, Stephan Stilgenbauer Psaní rukopisu: Thorsten Zenz, Barbara Eichhorst, Hartmut Döhner, Stephan Stilgenbauer Konečné schválení rukopisu: Thorsten Zenz, Barbara Eichhorst, Raymonde Busch, Tina Denzel, Sonja Häbe, Dirk Winkler, Andreas Bühler, Jennifer Edelmann, Manuela Bergmann, Georg Hopfinger, Manfred Hensel, Michael Hallek, Hartmut Döhner, Stephan Stilgenbauer 62 21 by American Society of Clinical Oncology

Mutace genu TP53 a přežití u chronické lymfocytární leukémie LITERATURA 1. Döhner H, Fischer K, Bentz M, et al: p53 gene deletion predicts for poor survival and non response to therapy with purine analogs in chronic B cell leukemias. Blood 85:158 1589, 1995 2. Döhner H, Stilgenbauer S, Benner A, et al: Genomic aberrations and survival in chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med 343:191 1916, 2 3. Catovsky D, Richards S, Matutes E, et al: Assessment of fludarabine plus cyclophosphamide for patients with chronic lymphocytic leukaemia (the LRF CLL4 Trial): A randomised controlled trial. Lancet 37:23 239, 27 4. Crespo M, Bosch F, Villamor N, et al: ZAP 7 expression as a surrogate for immunoglobulinvariable region mutations in chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med 348:1764 1775, 23 5. Damle RN, Wasil T, Fais F, et al: Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia. Blood 94:184 1847, 1999 6. Grever MR, Lucas DM, Dewald GW, et al: Comprehensive assessment of genetic and molecular features predicting outcome in patients with chronic lymphocytic leukemia: Results from the US Intergroup phase III trial E2997. J Clin Oncol 25:799 84, 27 7. Hamblin TJ, Davis Z, Gardiner A, et al: Unmutated Ig V(H) genes are associated with a more aggressive form of chronic lymphocytic leukemia. Blood 94:1848 1854, 1999 8. Stilgenbauer S, Eichhorst BF, Busch R, et al: Biologic and clinical markers for outcome after fludarabine (F) or F plus cyclophosphamide (FC): Comprehensive analysis of the CLL4 trial of the GCLLSG. Blood 112:289, 28 (abstr) 9. Stilgenbauer S, Zenz T, Winkler D, et al: Genomic aberrations, VH mutation status and outcome after fludarabine and cyclophosphamide (FC) or FC plus rituximab (FCR) in the CLL8 trial. Blood 112:781, 28 (abstr) 1. Zenz T, Kröber A, Scherer K, et al: Monoallelic TP53 inactivation is associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia: Results from a detailed genetic characterization with long term follow up. Blood 112:3322 3329, 28 11. Dicker F, Herholz H, Schnittger S, et al: The detection of TP53 mutations in chronic lymphocytic leukemia independently predicts rapid disease progression and is highly correlated with a complex aberrant karyotype. Leukemia 23:117 124, 29 12. Grever MR, Lucas DM, Johnson AJ, et al: Novel agents and strategies for treatment of p53 defective chronic lymphocytic leukemia. Best Pract Res Clin Haematol 2:545 556, 27 13. Pettitt AR, Matutes E, Oscier D: Alemtuzumab in combination with high dose methylprednisolone is a logical, feasible and highly active therapeutic regimen in chronic lymphocytic leukaemia patients with p53 defects. Leukemia 2:1441 1445, 26 14. Zenz T, Mohr J, Edelmann J, et al: Treatment resistance in chronic lymphocytic leukemia: The role of the p53 pathway. Leuk Lymphoma 5:51 513, 29 15. Zenz T, Häbe S, Denzel T, et al: Detailed analysis of p53 pathway defects in fludarabine-refractory chronic lymphocytic leukemia (CLL): Dissecting the contribution of 17p deletion, TP53 mutation, p53 p21 dysfunction, and mir34a in a prospective clinical trial. Blood 114:2589 2597, 29 16. el Rouby S, Thomas A, Costin D, et al: p53 gene mutation in B cell chronic lymphocytic leukemia is associated with drug resistance and is independent of MDR1/MDR3 gene expression. Blood 82:3452 3459, 1993 17. Fenaux P, Preudhomme C, Laï JL, et al: Mutations of the p53 gene in B cell chronic lymphocytic leukemia: A report on 39 cases with cytogenetic analysis. Leukemia 6:246 25, 1992 18. Newcomb EW: P53 gene mutations in lymphoid diseases and their possible relevance to drug resistance. Leuk Lymphoma 17:211 221, 1995 19. Sturm I, Bosanquet AG, Hermann S, et al: Mutation of p53 and consecutive selective drug resistance in B CLL occurs as a consequence of prior DNA damaging chemotherapy. Cell Death Differ 1:477 484, 23 2. Trbusek M, Malcikova J, Smardova J, et al: Inactivation of p53 and deletion of ATM in B CLL patients in relation to IgVH mutation status and previous treatment. Leukemia 2:1159 1161, 26 21. Rossi D, Cerri M, Deambrogi C, et al: The prognostic value of TP53 mutations in chronic lymphocytic leukemia is independent of Del17p13: Implications for overall survival and chemorefractoriness. Clin Cancer Res 15:995 14, 29 22. Eichhorst BF, Busch R, Hopfinger G, et al: Fludarabine plus cyclophosphamide versus fludarabine alone in first line therapy of younger patients with chronic lymphocytic leukemia. Blood 17:885 891, 26 23. Cheson BD, Bennett JM, Grever M, et al: National Cancer Institute sponsored Working Group guidelines for chronic lymphocytic leukemia: Revised guidelines for diagnosis and treatment. Blood 87:499 4997, 1996 24. Kröber A, Seiler T, Benner A, et al: V(H) mutation status, CD38 expression level, genomic aberrations, and survival in chronic lymphocytic leukemia. Blood 1:141 1416, 22 25. Zenz T, Häbe S, Denzel T, et al: How little is too much? p53 inactivation: From laboratory cutoff to biological basis of chemotherapy resistance. Leukemia 22:2257 2258, 28 26. International Agency for Research on Cancer: TP53 sequencing methods. http://www p53.iarc.fr/ p53sequencing.html 27. Yamanoshita O, Kubota T, Hou J, et al: DHPLC is superior to SSCP in screening p53 mutations in esophageal cancer tissues. Int J Cancer 114:74 79, 25 28. Hallek M, Langenmayer I, Nerl C, et al: Elevated serum thymidine kinase levels identify a subgroup at high risk of disease progression in early, nonsmoldering chronic lymphocytic leukemia. Blood 93:1732 1737, 1999 29. Wierda WG, O Brien S, Wang X, et al: Characteristics associated with important clinical end points in patients with chronic lymphocytic leukemia at initial treatment. J Clin Oncol 27:1637 1643, 29 3. Lozanski G, Heerema NA, Flinn IW, et al: Alemtuzumab is an effective therapy for chronic lymphocytic leukemia with p53 mutations and deletions. Blood 13:3278 3281, 24 31. Young KH, Leroy K, Møller MB, et al: Structural profiles of TP53 gene mutations predict clinical outcome in diffuse large B cell lymphoma: An international collaborative study. Blood 112:388 398, 28 32. Poeta ML, Manola J, Goldwasser MA, et al: TP53 mutations and survival in squamous cell carcinoma of the head and neck. N Engl J Med 357:2552 2561, 27 33. Keating MJ, Flinn I, Jain V, et al: Therapeutic role of alemtuzumab (Campath 1H) in patients who have failed fludarabine: Results of a large international study. Blood 99:3554 3561, 22 34. Hillmen P, Skotnicki AB, Robak T, et al: Alemtuzumab compared with chlorambucil as first line therapy for chronic lymphocytic leukemia. J Clin Oncol 25:5616 5623, 27 35. Montserrat E, Moreno C, Esteve J, et al: How I treat refractory CLL. Blood 17:1276 1283, 26 36. Zenz T, Hoth P, Busch R, et al: TP53 mutations and outcome after fludarabine and cyclophosphamide (FC) or FC plus rituximab (FCR) in the CLL8 trial of the GCLLSG. Blood 114:1267, 29 (abstr) 37. Hallek M, Cheson BD, Catovsky D, et al: Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia: A report from the International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia updating the National Cancer Institute Working Group 1996 guidelines. Blood 111:5446 5456, 28 www.jco.org 21 by American Society of Clinical Oncology 63