HYDRAGEL ISO-CK K20 Ref. 3024 2015/07
POUŽITÍ SADY Sada HYDRAGEL ISO-CK K20 je určena k elektroforetické identifikaci a kvantifikaci tří izoenzymů kreatinkinázy (CK) lidského séra na alkalicky pufrovaných (ph 8.4) agarózových gelech. Výsledné gely lze okamžitě vizuálně prozkoumat a densitometricky určit přesné relativní zastoupení jednotlivých zón. Každý agarózový gel v sadě HYDRAGEL ISO-CK K20 je určen k analýze 7 vzorků. Pro diagnostické použití in vitro. PRINCIP TESTU Izoenzymy kreatinkinázy (CK) se skládají ze dvou podjednotek (dimerů) : M ("muscle") a B ("brain"). Jejich kombinace umožňují vznik tří izoenzymů : MM, převážně obsažený v myokardu a kosterních svalech, MB v myokardu a BB v mozkové tkáni. Každá podjednotka má specifický elektrický náboj, který uděluje charakteristickou mobilitu jednotlivým CK izoenzymům. Na gelech HYDRAGEL 7 ISO CK/LD je BB frakce umístěna nejblíže anodě, MM je nejblíže katodě a MB je uprostřed. Největší význam elektroforézy CK izoenzymů spočívá v diagnostice infarktu myokardu (MI). Koncentrace MB se zvyšuje za 4-8 hodin po začátku infarktu myokardu. Analýza izoenzymů CK se obvykle provádí současně s analýzou izoenzymů LD (laktát dehydrogenáza) nebo jiných časných markerů IM k jeho vyloučení nebo potvrzení, stanovení jeho vážnosti a monitorování pacientova stavu. Všechny izoenzymy CK katalyzují tutéž reverzibilní reakci, která je využita při jejich vizualizaci. Při metodě HYDRAGEL ISO-CK K20 jsou vzorky séra elektroforeticky rozdělena a získané izoenzymy CK vizualizovány pomocí specifického chromogenického substrátu podle následujících reakcí : Kreatin Fosfát + ADP ATP + D-Glukóza Glukóza-6-Fosfát + NADP NADPH + PMS PMSH + TNBT CK HEXOKINÁZA G-6-PDH Kreatin + ATP Glukóza-6-Fosfát + ADP NADPH + 6-Fosfoglukonolakton NADP + PMSH PMS + reduk. TNBT precipitát formazanu Množství výsledného formazanu je přímo úměrné enzymatické aktivitě CK. ZKRATKY : CK : Kreatinkináza HK : Hexokináza G-6-PDH : Glukózo-6-Fosfát Dehydrogenáza ADP : Adenosin 5 Difosfát ATP : Adenosin 5 Trifosfát NADP : Nikotinamid Adenin Dinukleotid Fosfát NADPH : Redukovaný Nikotinamid Adenin Dinukleotid Fosfát PMS : Fenazin Metosulfát PMSH : Redukovaný Fenazin Metosulfát TNBT : Modrý Tetranitro Tetrazolium REAGENTY A MATERIÁLY DODÁVANÉ V SADĚ HYDRAGEL ISO-CK K20 VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. POLOŽKA KAT. Č. 3024 Agarózové gely (připraveno k použití) 10 gelů Pufr HYDRAGEL ISO CK/LD (zásobní roztok) 3 lahvičky, 100 ml každá Aktivační roztok (připraveno k použití) 1 lahvička, 0.75 ml Rozpouštědlo substrátu (připraveno k použití) 1 lahvička, 40 ml Chromogen (zásobní roztok) 1 lahvička, 3 ml Substrát ISO-CK (zmražený, sušený) 10 lahviček Zastavovací roztok ISO CK/LD (připraveno k použití) 1 lahvička, 40 ml Odbarvovací roztok (zásobní roztok) 1 lahvička, 100 ml Aplikátory, 7 zoubků (připraveno k použití) 1 balení po 10 kusech Tenké filtrační papíry 1 balení po 10 kusech Tlusté filtrační papíry 1 balení po 10 kusech Během přepravy může být souprava uchována bez zmražení (15 až 30 C) až po dobu 15 dní bez nepříznivého vlivu na vlastnosti. PRO OPTIMÁLNÍ VÝSLEDKY : Všechny reagenty ze stejné sady musí být vždy používány společně a podle pokynů v příbalovém letáku. PROSÍME, ČTĚTE PEČLIVĚ PŘÍBALOVÝ LETÁK. - 107 - SEBIA NÁVOD - Czech
1. AGARÓZOVÉ GELY HYDRAGEL ISO-CK K20-2015/07 Agarózové gely jsou připraveny k použití. Každý gel obsahuje : agarózu ; tlumicí roztok ph 8.4 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Nosné médium pro elektroforézu izoenzymů kreatinkinázy. Skladujte gely v horizontální poloze v originálních ochranných obalech při pokojové teplotě (15 až 30 C) nebo v chladničce (2 až 8 C). Jsou stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady a na balení gelu (šipka na přední straně krabice musí směřovat nahoru). Neskladovat v blízkosti okna nebo tepelného zdroje. Zamezte prudkým změnám teploty při skladování. NEMRAZIT Nepoužívejte : (i) v případě nálezu krystalů nebo precipitátů na povrchu gelu a pokud struktura změkne (oboje v důsledku zmrazení gelu), (ii) jsou-li přítomny mikroby a plísně, (iii) nadměrné množství tekutiny v obalu gelu (výsledek vypocení pufru z gelu v důsledku nesprávného skladování). 2. PUFR HYDRAGEL ISO CK/LD Každá lahvička zásobního tlumivého roztoku se může zředit destilovanou nebo deionizovanou vodou až na 1 litr. Pracovní roztok po naředění obsahuje : tlumicí roztok s ph 8.4 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Pufr pro elektroforézu. Zásobní roztok pufru skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Roztok je stabilní několik let, nejméně do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky pufru. Zředěný roztok je stabilní jeden rok při skladování při pokojové teplotě v uzavřené láhvi. Zředěný pufr zneškodněte, pokud se změní jeho vzhled, například se stane zakaleným v důsledku bakteriální kontaminace. POZNÁMKA : Během skladování se může barva zásobního pufru změnit na žlutou, což nemá nepříznivý vliv na jeho vlastnosti. 3. AKTIVAČNÍ ROZTOK* Aktivační roztok je připraven k použití. Obsahuje : ß-Merkaptoetanol. Pro úpravu vzorků séra před elektroforetickým dělením. Aktivační roztok skladujte v chladničce. Roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky aktivačního roztoku. Aktivační roztok zneškodněte, pokud se změní jeho vzhled, například se zakalí v důsledku bakteriální kontaminace. Aktivační roztok nesmí obsahovat sraženiny. DŮLEŽITÉ : Po každém použití lahvičku aktivačního roztoku ihned uzavřete, abyste zabránili degradaci v důsledku oxidace. POZNÁMKA : Aktivační roztok ISO-CK normálně vykazuje silný ß-merkaptoetanolový zápach. Jestliže je tento zápach slabý nebo chybí, je to symptom snížení nebo celkové ztráty aktivity. Aktivační roztok můžete regenerovat přidáním čistého ß-merkaptoetanolu. Přidejte 7 % obj. zbývajícího množství aktivačního roztoku. 4. ŘEDICÍ ROZTOK PRO SUBSTRÁT Ředicí roztok pro substrát je připraven k použití. Obsahuje : tlumicí roztok s ph 6.7 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. K přípravě vizualizačního roztoku, jak je popsáno v části 6. Ředicí roztok pro substrát skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky ředicího roztoku pro substrát. Ředicí roztok pro substrát zneškodněte, pokud se změní jeho vzhled, například se zakalí v důsledku bakteriální kontaminace. Ředicí roztok pro substrát nesmí obsahovat sraženiny. - 108 -
5. CHROMOGEN* Chromogen je připraven k použití. Obsahuje TNBT (modrý tetranitro tetrazolium) v DMF (dimetylformamid). K přípravě vyvíjecího roztoku, jak je popsáno v části 6. Chromogen skladujte v chladničce (2 až 8 C). Roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky chromogenu. 6. ISO-CK SUBSTRÁT* Každá lahvička substrátu obsahuje : Hovězí Albumin, Glukózu, ADP (Adenosin 5' Difosfát), NADP (Nikotinamid Adenine Dinukleotid Fosfát), hexokinázu (z pekařského droždí), Glukózo-6-Fosfát Dehydrogenázu (z pekařského droždí), PMS (Fenazin Metosulfát) a přísady neškodné v použité koncentraci, nezbytné pro optimální provedení testu. Vyvíjecí roztok připravte mimo dosah přímého světla 20 minut před použitím (ihned po zahájení migrace). Do lahvičky se substrátem ISO-CK (1/2) přidejte 2 ml rozpouštěcího roztoku pro substrát. Zavřete lahvičku a zlehka promíchejte. Ponechejte při pokojové teplotě. Těsně před použitím přidejte 0.15 ml chromogenu a promíchejte. K vyvolání elektroforeticky rozdělených izoenzymů kreatinkinázy. Substrát skladujte v chladničce. Roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky substrátu. 7. ZASTAVOVACÍ ROZTOK HYDRAGEL ISO CK/LD Blokovací roztok je připraven k použití. Obsahuje kyselý roztok ph 2. K zastavení enzymatické reakce po inkubaci gelů po stanovenou dobu. Zastavovací roztok lze skladovat při pokojové teplotě nebo v chladničce v uzavřené nádobě a je stabilní do doby expirace vyznačené na štítku lahvičky. 8. ODBARVOVACÍ ROZTOK Lahvička zásobního odbarvovacího roztoku může být destilovanou nebo deionizovanou vodou zředěna až na 100 litrů. Je vhodné zředit pouze 1 ml zásobního roztoku na 1 litr. Po zředění vznikne odbarvovací roztok obsahující kyselý roztok ph 2. Omytí gelu po skenování. Zásobní odbarvovací roztok skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu či na štítku lahvičky odbarvovacího roztoku. Pracovní odbarvovací roztok je stabilní jeden týden při skladování při pokojové teplotě v uzavřené láhvi. Pracovní odbarvovací roztok zneškodněte, pokud se změní jeho vzhled, například se stane zakaleným v důsledku bakteriální kontaminace. Nepřidávat azid sodný. Pro zabránění mikrobiální proliferace ve zředěném odbarvovacím roztoku, který má být skladován déle než dva týdny, přidejte 5 μl/dl roztoku ProClin 300 nebo roztoku CLEAN PROTECT (SEBIA, kat. č. 2059, 1 lahvička, 5 ml). Viz příbalový leták s návodem k použití roztoku CLEAN PROTECT. Pracovní odbarvovací roztok s přídavkem roztoku ProClin nebo CLEAN PROTECT je při pokojové teplotě nebo v chladničce v uzavřené nádobě stabilní do doby exspirace vyznačené na obalu sady nebo na štítku lahvičky. 9. APLIKÁTORY Nařezané aplikátory pro jednorázové použití určené k nanášení vzorků. Skladování Aplikátory skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. 10. TENKÉ FILTRAČNÍ PAPÍRY Bločky tenkého absorpčního papíru pro jednorázové použití jsou určeny pro odsání přebytečné vlhkosti z povrchu gelu před nanesením vzorků. Skladování Tenké filtrační papíry skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. 11. TLUSTÉ FILTRAČNÍ PAPÍRY Nařezané bločky tlustého absorpčního papíru pro jednorázové použití jsou určeny pro odsátí přebytečného zastavovacího roztoku z povrchu gelu před sušením. Skladování Tlusté filtrační papíry skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. * POZNÁMKA : Během přepravy je možné aktivační roztok, chromogen a substrát ISO-CK uchovávat bez zmražení (15 až 30 C) po dobu 15 dní bez nepříznivého vlivu na vlastnosti. - 109 -
POTŘEBNÉ REAGENTY NEOBSAŽENÉ V BALENÍ FYZIOLOGICKÝ ROZTOK Připravte roztok NaCl, 0.15 M (0.9 g/dl), v destilované nebo deionizované vodě. Ředění vzorků séra pro dosažení celkové aktivity CK přibližně 750 IU/L, pokud je aktivita > 750 IU/L. Fyziologický roztok skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Zneškodněte po třech měsících nebo pokud se změní jeho vzhled, například se stane zakaleným v důsledku bakteriální kontaminace. Pro delší skladování přidejte azid sodný, 0.1 g/dl. POZNÁMKY : Zkoušky provedené pro ověření reagentů prokázaly, že pro různé roztoky a použití přizpůsobeného vybavení pro rekonstituci objemu, nemají odchylky objemu ± 5 % z konečného objemu vliv na výsledek analýzy. Destilovaná nebo deionizovaná voda používaná k ředění roztoků musí být prostá bakteriální proliferace a plísní (použijte filtr 0,45 µm) a musí mít vodivost nižší než 3 µs/cm, což odpovídá rezistivitě vyšší než 0,33 MΩ x cm. VYBAVENÍ A PŘÍSLUŠENSTVÍ NEOBSAŽENÉ V BALENÍ 1. Zdroj napájení : MG 300 SEBIA, kat. č. 1302 nebo MG 500 SEBIA, kat. č. 1303. 2. APLIKÁTOR HYDRAGEL K20 SEBIA, kat. č. 1409 obsahující držák aplikátoru HYDRAGEL K20. 3. Příslušenství HYDRAGEL ENZ K20 SEBIA, kat. č. 1422 obsahující rámeček šablony K20 a šablonu pro nanášení reagentů R1. 4. Vlhká zásobní komora, kat. č. 1270. 5. Elektroforetická komora, K20 SEBIA, kat. č. 1400. 6. Nádobky a držáky gelů pro zpracování gelových desek : HYDRAGEL K20 příslušenství Kit SEBIA, kat. č. 1420. 7. Pipety : 10 µl, 200 µl a 5 ml. 8. Inkubátor-Sušička IS 80 SEBIA, kat. č. 1430. 9. Denzitometr / skener pro skenování gelových ploten 82 x 51 mm : software pro plochý skener HYRYS SEBIA, DVSE SEBIA nebo PHORESIS. Pro postupy činnosti a kalibrace viz pokyny výrobce. 10.Materiály pro kontrolu kvality (Enzycontrol SEBIA, kat. č. 4790). VZORKY PRO ANALÝZU Odběr a skladování vzorků Pro analýzu se doporučuje používat čerstvé vzorky séra. Odběr vzorků musí být v souladu se zavedenými postupy používanými pro testování v klinických laboratořích. Vzorky uložte v chladničce (2 až 8 C) co nejdříve po odběru ; je možné je uchovávat až jeden týden. vzorků Smíchejte 500 µl séra s 5 µl aktivačního roztoku a inkubujte 10 minut při pokojové teplotě. Pro dosažení celkové aktivity CK okolo 750 IU/L, pokud je aktivita > 750 IU/L, zřeďte vzorek séra fyziologickým roztokem. Vzorky, které není vhodné používat Nepoužívejte hemolyzované vzorky. Erytrocytární enzymy mohou v reakci interferovat. Analýzu nelze provádět ve vzorcích obsahujících inhibitory enzymatické aktivity CK, jako jsou například heparin, EDTA, citrát, fluoridy nebo jodoacetát. POZNÁMKA : Odběrové zkumavky pro biologické vzorky jsou popsány v dostupné dokumentaci k předanalytické fázi pro biomedicínskou analýzu (údaje poskytnuté výrobci zkumavek, návody a doporučení k odběru biologických vzorků ). Nejsou-li v návodu k použití pro typ zkumavek, které mají být použity, uvedeny žádné pokyny, postupujte podle této dokumentace a v případě rozměrů zkumavek, které mají být použity, postupujte podle dokumentu SEBIA "Charakteristiky zkumavek používaných podle přístroje". Předanalytická fáze musí být provedena podle stavu poznání, různých doporučení, mimo jiné doporučení výrobců zkumavek a platných předpisů. POSTUP I. MIGRACE 1. Položte držák aplikátoru HYDRAGEL K20 na rovný povrch (viz Obr. 1) a zdvihněte část držáku aplikátoru s číslovanými zoubky. 2. Naneste 120 µl destilované nebo deionizované vody do dolní třetiny rámečku vyraženého na držáku aplikátoru HYDRAGEL K20. 3. Vybalte agarózovou gelovou desku HYDRAGEL. 4. Odsajte přebytečnou kapalinu tak, že na povrch gelu rychle a rovnoměrně narolujete filtrační papír. Papír ihned odstraňte. POZOR : Neponechávejte tento filtrační papír delší dobu na povrchu, mohlo by dojít k dehydrataci gelu. 5. Opřete gelovou desku (gelem nahoru) dolním okrajem o zarážku na spodní části vyznačeného rámečku na migrační ploše (Obr. 2). 6. Gel ohněte a zavěste dolů na hladinu vody (Obr. 2). Ověřte, zda nedošlo k zachycení vzduchových bublin, že je voda rozprostřena po celém povrchu gelové desky, a že je gel vyrovnán s vyznačeným rámečkem. 7. Sklopte držák aplikátoru s číslovanými zoubky do střední polohy se spínačem v horní pozici. 8. Umístěte jeden aplikátor na rovný povrch s čísly jamek vpravo nahoře (viz Obr. 3). 9. Naneste 10 µl vzorku do jamek aplikátoru. Aplikátor naplňte do 2 minut. - Aplikátor ihned použijte. - Pro pozdější použití (až do 8 hodin) umístěte aplikátor do vlhké zásobní komory zoubky nahoru (aplikátory držte za ochranný rámeček), celou komoru uložte do chladničky a gelovou desku položte na držák aplikátoru HYDRAGEL K20 těšně před použitím. Další informace jsou uvedeny v příbalovém letáku pro vlhkou komoru. 10. Odlomte ochranný rámeček chránicí zuby aplikátoru. - 110 -
11. Položte aplikátor do polohy č. 6 na rámečku aplikátoru. DŮLEŽITÉ : Čísla vyznačená na aplikátorech musí směřovat k operátorovi (viz Obr. 4). 12. Sklopte držák aplikátoru se spínačem tak, aby byl v kontaktu s povrchem gelu. NESTLAČUJTE DRŽÁKY AŽ DOLŮ. 13. Po 10 minutách otočením spínače zdvihněte aplikátor, vyjměte jej a zlikvidujte. 14. Vložte gel do příslušné elektroforézní komory v souladu s polaritou vyznačenou na gelu, s dolní stranou gelu na katodické straně. Při používání komory SEBIA K20 vkládejte HYDRAGEL na můstek tak, aby čelní strana gelu směrovala dolů. Gel by měl být ponořen na každé straně asi 1 cm pod hladinu pufru. Další informace jsou uvedeny v příbalovém letáku komory K20. 15. Připojte komoru k napájení. PODMÍNKY MIGRACE Objem pufru v každé části Celkový objem pufru Doba migrace Konstantní napětí Počáteční proud (jeden gel) SEBIA K20 150 ml 300 ml 20 minut 80 V 10 ± 2 ma 16. Po migraci odpojte komoru a vyjměte gelovou desku. II. VIZUALIZACE DŮLEŽITÉ : Doporučuje se předehřát inkubátor-sušičku na dobu 5 minut při teplotě uvedené níže před vložením držáku šablony K20 a gelu pro inkubaci. 1. Položte rámeček šablony na rovný povrch (viz Obr. 5) a odstraňte kryt. 2. Naneste 120 µl destilované nebo deionizované vody do dolní třetiny rámečku vyraženého na rámečku šablony. 3. Opřete gelovou desku (gelem nahoru) dolním okrajem o zarážku na spodní části vyznačeného rámečku na migrační ploše (Obr. 6). 4. Gel ohněte a zavěste dolů na hladinu vody (Obr. 6). Ověřte, zda nedošlo k zachycení vzduchových bublin, že je voda rozprostřena po celém povrchu gelové desky, a že je gel vyrovnán s vyznačeným rámečkem. 5. Sestavte šablonu pro aplikaci reagentu R1 na rámeček následujícím postupem (viz Obr. 7) : - Umístěte aplikační šablonu na ukotvující trny. - Přidržte držák šablony a položte šablonu na gel. 6. Po smíchání chromogenu a substrátu v lahvičce naneste 2 ml roztoku substrátu ISO-CK, následujícím způsobem (viz Obr. 8) : - Pipetu držte kolmo. - Lehce vtiskněte špičku pipety do otvoru v šabloně. - Opatrně a postupně vstřikujte reagent bez bublin pod šablonu. 7. Zavřete kryt rámečku šablony (viz Obr. 9). 8. Vložte rámeček šablony do inkubátoru-sušičky s teplotou 37 C na 30 minut. III. ODSTRANĚNÍ SUBSTRÁTU A APLIKACE ZASTAVOVACÍHO ROZTOKU 1. Po inkubaci odstraňte rámeček šablony z inkubátoru - sušičky a položte jej na rovný povrch. 2. Otevřete kryt. 3. Odstraňte zbývající roztok substrátu : - Držte pipetu kolmo a lehce vtiskněte špičku pipety do otvoru v šabloně. - Opatrně a postupně odsajte reagent. 4. Odpipetujte 2 ml zastavovacího roztoku. Pozor na vniknutí bublin vzduchu. 5. Zavřete kryt rámečku šablony. 6. Vložte rámeček šablony do inkubátoru - sušičky s teplotou 37 C na 10 minut. IV. ODSTRANĚNÍ ZASTAVOVACÍHO ROZTOKU, APLIKACE FILTRAČNÍHO PAPÍRU A SUŠENÍ GELU 1. Odstraňte rámeček šablony z inkubátoru - sušičky a otevřete kryt. 2. Odstraňte zastavovací roztok (viz ODSTRANĚNÍ SUBSTRÁTU). 3. Vyjměte šablonu : - Uchopte šablonu za držátko. - Zvedněte šablonu a vyjměte ji. 4. Gel ponechejte na místě na desce v rámečku. 5. Položte na gel jeden tlustý filtrační papír : - Nakloňte filtrační papír v úhlu přibližně 45. - Vyrovnejte dolní okraj filtračního papíru s okrajem gelu. - Sklopte filtrační papír na gel. - Přitlačte na celý povrch filtračního papíru k zajištění jeho dokonalého přilnutí ke gelu. 6. Zavřete kryt rámečku šablony. 7. Vložte rámeček šablony do inkubátoru - sušičky s teplotou 37 C na 3 minut. 8. Po 3 minutách odstraňte rámeček šablony z inkubátoru-sušičky a otevřete kryt. 9. Odstraňte filtrační papír a gel vysušte při 51 C. 10. Omyjte šablonu destilovanou vodou nebo alkoholem a důkladně vysušte jemným absorpčním papírem. Před opakovaným použitím ověřte, zda je šablona zcela suchá. V. SKENOVÁNÍ GELU 1. Očistěte zadní stranu (plastovou nosnou stranu) vysušeného filmu vlhkým jemným papírem. 2. V případě potřeby odstraňte z gelu pomocí jemného papíru prach. 3. Nasnímejte denzitometrem / skenerem výběrem vhodného programu snímání. - 111 -
VI. OMYTÍ GELU Po skenování lze gel omýt pro lepší konzervaci elektroforegramů (a prevenci vzniku zbarvení pozadí). 1. Gel ponořte na 10 minut do odbarvovacího roztoku. 2. Usušte gel vzduchem o teplotě 51 C. KONTROLA KVALITY Doporučuje se zařadit na každou sérii vzorků kontrolní sérum (např. Enzycontrol, SEBIA kat. č. 4790). VÝSLEDKY Hodnoty Nejsou-li ve vzorku přítomny frakce MB a BB, elektroforegram není nutné skenovat. Lidská séra mohou vykazovat tři frakce : MM - v lidském séru predominantní s velmi nízkou pohyblivostí (zóna gama), MB - se střední pohyblivostí (v zóně beta), BB - s vysokou mobilitou (v zóně alfa-1). Normální hodnoty (viz LITERATURA : 4, 9 a 20) : CK MM : 97 až 100 % CK-MB : 0 až 3 %, pokud je aktivita CK v rozsahu mezi 15 a 500 IU/L CK-MB : 0 až 4 %, pokud je aktivita CK vyšší než 500 IU/L CK BB : 0 % Doporučuje se, aby každá laboratoř stanovila své vlastní referenční hodnoty. Interpretace SEBIA doporučuje interpretaci gelu ihned po dokončení jeho zpracování. Kvalita gelu se s časem zhoršuje v závislosti na podmínkách skladování, včetně (světla, tepla...). Každá laboratoř musí definovat optimální podmínky mezi dokončením gelu a jeho interpretací na základě těchto podmínek prostředí laboratoře. Delší skladování gelů (na suchém místě a mimo světlo) je možné pouze pro účely archivace. Frakce MB se zvyšuje za 4-8 hodin po začátku infarktu myokardu. Frakce BB je primárně zvýšena u některých onemocnění a traumat nervového systému. Celková kreatinfosfokináza (hlavně MM) je zvýšena v následujících případech : - chirurgické trauma - namáhavé tělesné cvičení - svalová dystrofie - myopatie - polymyositis - hypotyroidismus - léky, intramuskulární injekce. Makro CK (typ 1) je komplex mezi CK a imunoglobuliny. Je detekovatelný mezi MM a MB frakcemi (viz Obr. 10). Mitochondriální CK (typ 2) je detekovatelný na katodické straně MM frakce (viz Obr. 10). Odstraňování problémů Pokud testy při dodržení veškerých instrukcí pro přípravu, skladování a provedení testu uvedených v příbalovém letáku nevycházejí, kontaktujte technickou podporu svého dodavatele. Bezpečnostní datové listy sady reagentů a informace o čištění a likvidaci odpadů, označování a bezpečnostní pravidla používaná společností SEBIA a obaly pro přepravu biologických vzorků a čištění přístrojů jsou k dispozici na DVD s "NÁVODY A BEZPEČNOSTNÍMI DATOVÝMI LISTY". ÚDAJE O VÝKONU Densitometr HYRYS SEBIA byl použit pro veškerá densitometrická měření. Jednotlivé hodnoty, průměr SD a CV jsou uvedeny níže. Celkově výsledky vykazují velmi dobrou reprodukovatelnost pro všechna sledovaná hlediska : střední hodnota CV je 3.2 %. Reprodukovatelnost na gelu Tři různé vzorky séra byly analyzovány elektroforézou pomocí metody HYDRAGEL ISO-CK K20. Vzorky byly následující : A a B - séra se zvýšenou hodnotou MB ; C - normální sérum. Každý vzorek byl nanesen do všech 7 stop gelů ze stejné šarže. Elektroforegramy byly hodnoceny densitometricky a v následující tabulce jsou uvedeny průměrné hodnoty, SD a CV pro každou frakci CK (MB a MM) pro každý vzorek. - 112 -
PARAMETR MB MM Vzorek A PRŮMĚR (%) 14.1 85.9 SD 0.3 0.3 CV (%) 2.2 0.4 Vzorek B PRŮMĚR (%) 11.0 89.0 SD 0.2 0.2 CV (%) 1.4 0.2 Vzorek C PRŮMĚR (%) 2.2 97.8 SD 0.1 0.1 CV (%) 6.5 0.1 HYDRAGEL ISO-CK K20-2015/07 Reprodukovatelnost mezi gely Šest různých vzorků séra a roztok Enzycontrol SEBIA byly analyzovány na 10 gelech ze stejné šarže metodou HYDRAGEL ISO-CK K20. Pro každý vzorek séra a pro frakci CK byly vypočteny průměry CV, SD a CV (n = 10). Výsledky byly v zásadě stejné pro všechny vzorky. Následující tabulka znázorňuje rozsahy SD a CV reprezentující všechny vzorky a průměr CV vypočtený ze zásobní CV pro všechny vzorky (n = 10). FRAKCE CK SD CV (%) PRŮMĚR CV (%) MM 0.3-1.3 0.3-2.4 1.0 MB 0.1-1.1 3.0-10.0 6.5 BB 1.0 3.6 3.6 Přesnost srovnávací studie Třicet (30) různých vzorků séra (normálních i patologických) bylo analyzováno pomocí sady HYDRAGEL ISO-CK K20 SEBIA a jiného, komerčně dostupného elektroforetického systému pro stanovení izoenzymů kreatinkinázy. Hodnoty izoenzymů CK stanovené vizuálně na obou systémech byly v naprosté shodě. Výsledky lineární regresní analýzy densitometrických hodnot MB a MM frakcí (n = 30) jsou uvedeny v následující tabulce. Parametr Korelační koeficient y-úsek Sklon Rozsah % hodnot (test SEBIA) MB frakce 0.988-0.102 0.993 0.0 14.4 MM frakce 0.988 0.749 0.993 85.6 100.0 y = hodnoty SEBIA Citlivost Patologický sérový vzorek s MB frakcí (aktivita 40 IU/L) byl následně ředěn a tato ředění byla elektroforeticky analyzována metodou HYDRAGEL ISO-CK K20. Po densitometrickém zhodnocení byla nejnižší detekovaná aktivita MB frakce 2.5 IU/L. Linearita Byla testována následná ředění vzorku obsahujícího MM a MB frakce, od celkové CK aktivity 750 IU/L až po 20 IU/L. Systém byl lineární v celém studovaném rozsahu. - 113 -
BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAPHY 1. Abbott LB, Van Lente F, 1985. Procedure for characterization of creatine kinase variants on agarose electrophoretograms. Clin Chem, 31, 3 : 445. 2. Anido VA, Conn RB, Mengoli HF, Anido G, 1974. Diagnostic efficacy of myocardial creatine phosphokinase using polyacrylamide disk gel electrophoresis. Am J Clin Pathol, 61 : 599. 3. Cawley LP, 1969. Electrophoresis and immunoelectrophoresis. Little, Brown and Company, Boston. 4. Christenson RH, Azzazy HME, 1998. Biochemical markers of the acute coronary syndromes. Clin Chem, 44 : 1855. 5. Doran GR, Wilkinson JH, 1975. The origin of elevated activities of creatine kinase and other enzymes in the sera of patients with myxedema. Clin Chim Acta, 62 : 203. 6. Dubo H, Park DC, Pennington RJT, Kalbag RM, Walton JN, 1967. Serum-creatine-kinase in cases of stroke, head injury and meningitis. Lancet, 2 : 743. 7. Jockers-Wretou E, Pfleiderer G, 1975. Quantitation of creatine kinase isoenzymes in human tissues and sera by an immunological method. Clin Chim Acta, 58 : 223. 8. Kachmar JF, Moss DW: Enzymes. In Fundamentals of Clinical Chemistry. NW Tietz, Editor, Saunders, Philadelphia, 1976, pp 652-660. 9. Keffer JH, 1996. Myocardial markers of injury. Clin Chem, 105, 3 : 305. 10. King JO, Zapf P, 1972. A review of the value of creatine phosphokinase estimations in clinical medicine. Med J Aust, 1 : 699. 11. Konttinen A, Somer H, 1973. Specificity of serum creatine kinase isoenzymes in diagnosis of acute myocardial infarction. Br Med J, 1, 386. 12. Konttinen A, Somer H, Auvinen S, 1974. Serum enzymes and isoenzymes. Extrapulmonary sources in acute pulmonary embolism. Arch Intern Med, 133 : 243. 13. LaFair JS, Myerson RM, 1968. Alcoholic myopathy. Arch Intern Med, 122 : 417. 14. Mair J, Morandell D, Genser N, Lechleitner P, Dienstl F, Puschendorf B, 1995. Equivalent early sensitivities of myoglobin, creatine kinase MB mass, creatine kinase isoform ratios, and cardiac troponins I and T for acute myocardial infarction. Clin Chem, 41, 9 : 1266. 15. Morin LG, 1977. Creatine kinase : stability, inactivation, reactivation. Clin Chem, 23, 4 : 646. 16. Nealon DA, Henderson AR, 1975. Measurement of brain-specific creatine kinase isoenzyme activity in serum. Clin Chem, 21 : 1663. 17. Rao PS, Mueller HS, 1976. Evaluation of the chemical activation procedure (Rao s method) for the measurement of the MB isoenzyme of creatine kinase. Clin Chem, 22 : 932. 18. Rock RC, Dreskin R, Kickler T, Wimsatt T, 1975. Creatine kinase isoenzymes in serum of patients with Reye s syndrome. Clin Chim Acta, 62 : 159. 19. Roe CR, Limbird LE, Wagner GS, Nerenberg ST, 1972. Combined isoenzyme analysis in the diagnosis of myocardial injury : Application of electrophoretic methods for the detection and quantitation of the creatine phosphokinase MB isoenzyme. J Lab Clin Med, 80 : 577. 20. Thompson WG, Mahr RG, Yohannan WS, Pincus MR, 1988. Use of creatine kinase MB isoenzyme for diagnosing Myocardial infarction when total creatine kinase is high. Clin Chem, 34, 11 : 2208. 21. Vassella F, Richterich R, Rossi E, 1965. The diagnostic value of serum creatine kinase in neuromuscular and muscular disease. Pediatrics, 35 : 322. 22. Vincent WR, Rapaport E, 1965. Serum creatine phosphokinase in the diagnosis of acute myocardial infarction. Am J Cardiol, 15 : 17. 23. Weime RJ, 1965. Agar Gel Electrophoresis, Elsevier, Amsterdam. 24. Wolf PL, Kearns T, Neuhoff J, Lauridson J, 1974. Identification of CPK isoenzyme MB in myocardial infarction. Lab Med, 5 : 48. 25. Young DS, Pestaner LC, Gibberman V. Clin Chem, 21 : 1D (1975). 26. Zimmerman HJ, Henry JB: Clinical Enzymology. In Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, 16th ed., JB Henry, Editor, Saunders, Philadelphia, 1979, pp 365-368. 27. Zsigmond EK, Starkweather WH, 1963. Abnormal serum and muscle creatine phosphokinase (CPK) isoenzyme pattern in a family with malignant hyperthermia. Anaesthesis, 22 : 16. 28. Zsigmond EK, Starkweather WH, Duboff GS, Flynn KA, 1972. Elevated serum creatine phosphokinase activity in a family with malignant hyperpyrexia. Anesth analg, 51 : 827. 29. Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : justification et validité d un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité. Impact- Internat, Septembre 1986. - 143 -
SCHÉMAS / FIGURES Figure 1 Figure 2 1 2 3 4 5 6 7 Figure 3 Figure 4 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 Figure 5 Figure 6 1 2 3 4 5 6 7-144 -
SCHÉMAS / FIGURES Figure 7 Figure 8 Figure 9 Figure 10 Fraction identification BB MB Macro-CK Type Application point MM Mitochondrial (Macro-CK Type - 145 -