Mnohobarevná cytometrie v klinické diagnostice Mgr. Marcela Vlková, Ph.D. Ústav klinické imunologie a alergologie, FN u sv. Anny v Brně
Průtoková cytometrie v klinické laboratoři Relativní a absolutní počty leukocytárních subpopulací Pro správnou interpretaci je potřeba mít správně nastavené normální hodnoty ve vyšetřovaném materiálu: plná krev, kostní dřeň, bronchoalveolarní laváž Odchýlení od normálních hodnot pak může ukazovat na určitý typ onemocnění
Denní měření kontroly Slouží k ověření správné přípravy vzorku pro průtokový cytometr pipetování odpovídajícího množství kontrolního vzorku a monoklonálních protilátek lýza, promývání Správné nastavení cytometru: Fludika, optika, lasery.. Správné nastavení protokolu: voltáže, kompensace
Správné nastavení cytometru
FL3 FL6 FL10 Správné nastavení cytometru FL1 FL4 FL7 FL2 FL5 FL9
Vliv zpracování vzorku a výběru a titru monoklonálních protilátek, správný výběr fluorochromu
Měření jednobarevných kompenzačích zkumavek
Kompenzace
Denní měření kontrol před počátkem rutinního měření Měření Flow Check, Spherotecu... Měření kontrolního vzorku
Flow check
Denní měření Rainbows
Denní měření kontrolního vzorku
Měření základních lymfocytárních subpopulací
Nejčastěji vyšetřované lymfocytární subpopulace MARKER EXPRESION FUNCTION NORMAL VALUES IN WHOLE BLOOD CD3 T lymphocytes associated with TCR receptor, transmission signal CD4 T helper lymphocytes receptor for MHC II, activation CD8 T cytotoxic lymphocytes receptor for MHC I, activation 58-85% 30-60% 15-35% CD19 B lymphocytes the regulator activation 7-23% CD16/CD56 NK cells FcR for IgG mediator of adhesion HLA-DR B lymphocytes, monocytes, activated T-lymphocytes MHC II, presentation of Ag 6-20% 100% of B-lymphocytes 3-7% of T-lymphocytes
Srovnání zastoupení základních lymfocytárních populací v závislosti na věku 110 100 90 13 8 7,5 10 9,5 13,5 15 16,5 19 80 70 15 21,5 24 27 29 30 20,5 16 12,5 60 NK buňky 50 B lymfocyty 40 30 72,5 61,5 63,5 65 60 59,5 66,5 65 69 T lymfoccyty 20 10 0 0-2 měsíce 2-5 měsíců 5-9 měsíců 9-15 měsíců 15-24 měsíců 2-5 let 5-10 let 10-16 let 16 150 let
Stanovení absolutních počtů leukocytárních a lymphocytárních subpopulací Počet leukocytů 3,6-10 x10 9 l Lymphocyty 20-55% Monocyty 0-10% Granulocyty neutrofily, eosinofily, basofily 37-75% Příklad: % absolutní počet Leukocyty: 5 x10 9 l lymphocyty: 20% 1,00 x10 9 l
Efekt infekce Bakteriální infekce Počet leukocytů: T pomocné lym.: CD3+ 4+: Lymfocytů: Monocyty: CD14+HLA DR+ : Granulocytů: Virová infekce Počet leukocytů: T cytotox. lym.: CD3+ 8+: Lymfocytů: Aktivace cytotoxických T lym.: Granulocytů: CD3+CD8+HLA DR+ : CD3+CD8+CD38+ :
Leukocytární subpopulace v plné krvi Monocytes Granulocytes Lymfocytes
Leukocytární subpopulace v plné krvi SSC CD45
Kontrola Pacient č.1 SK
EBV infekce
Kontrola Pacient č.2 EBV infekce
Pacient CLL Zdravá kontrola
Měření základních lymfocytárních subpopulací
Pacient
Pacient léčba Rituximabem
Pacient věk 3 měsíce Leu : 5,0x10 9 /l Ly: : 10% T LYMFOCYTES CD3+ : 17 (58-85)% CD3+ 4+: 4 (30-60)% CD3+ 8+: 9 (15-35)% 71% B LYMFOCYTES CD19+ : 62 (7-23) % 14% NK CELLS CD16,56+: 11 (6-20)%
Severe combined imunodeficiency (SCID) Leu : 5,0x10 9 /l Ly: : 10% T LYMFOCYTES CD3+ : 17 (58-85)% CD3+ 4+: 4 (30-60)% CD3+ 8+: 9 (15-35)% 71% B LYMFOCYTES CD19+ : 62 (7-23) % 14% NK CELLS CD16,56+: 11 (6-20)%
Pacient 1 rok T LYMFOCYTES CD3+ : 40 (58-85)% 22% 4% CD3+ 4+: 22 (30-60)% CD3+ 8+: 4 (15-35)% B LYMFOCYTES CD19+ : 22 (7-23) % 22% 36% 40% 40% NK CELLS CD16,56+ : 36 (6-20)%
DiGeorge s syndrome T LYMFOCYTES CD3+ : 40 (58-85)% 22% 4% CD3+ 4+: 22 (30-60)% CD3+ 8+: 4 (15-35)% B LYMFOCYTES CD19+ : 22 (7-23) % 22% 36% 40% 40% NK CELLS CD16,56+ : 36 (6-20)%
Burst test E.coli fmlp PMA
Chronic Granulomatous Disease Negative control (autosomal recessive) Mother Patient Stimulation PMA Father Stimulation PMA Stimulation PMA
Chronic Granulomatous Disease Negative control (X-linked) Mother Patient Stimulation PMA Father Stimulation PMA Stimulation PMA
Cytometrické stanovení myeloperoxidázy
Deficit myeloperoxidázy Exprese MPO na monocytech Healthy Control Patient Comparison patient healthy control
Deficit myeloperoxidázy Exprese MPO na granulocytech Healthy Control Patient Comparison 89% patient Healthy control
Deficit MPO Burst test - stimulace E. coli ZDRAVÁ KONTROLA PACIENTKA SROVNÁNÍ pacientka zdravá kontrola Počet aktivovaných buněk: 95% Počet aktivovaných buněk: 89% Stimulační index: 163 Stimulační index: 22
Deficit MPO Burst test - stimulace PMA ZDRAVÁ KONTROLA PACIENTKA SROVNÁNÍ pacientka zdravá kontrola Počet aktivovaných buněk: 97% Stimulační index: 281 Počet aktivovaných buněk: 92% a 6% Stimulační index: 23 a 201
Děkuji za pozornost!