Masarykova univerzita Lékařská fakulta ZHODNOCENÍ VÝTĚŽNOSTI VZORKŮ ZPRACOVANÝCH TECHNIKOU CYTOBLOKU A POROVNÁNÍ JEDNOTLIVÝCH METOD ZPRACOVÁNÍ Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant Vedoucí bakalářské práce: MUDr. Jitka Hausnerová Autor: Kamila Kiliánová Brno, duben 2016
Jméno a příjmení autora: Kamila Kiliánová Název bakalářské práce: cytobloku a porovnání jednotlivých metod zpracování Zhodnocení výtěžnosti vzorků zpracovaných metodou Pracoviště: Fakultní nemocnice Brno, ústav patologie Vedoucí bakalářské práce: MUDr. Jitka Hausnerová Rok obhajoby bakalářské práce: 2016 Souhrn: Práce se zabývá studiem techniky cytobloku, používané při zpracování tekutých vzorků. Metod přípravy je několik, v bakalářské práci jsem se zaměřila na tři z nich. Obecná část je zaměřena na všeobecné poznatky o cytologii a dále pak na charakteristiku výpotků, se zaměřením na výpotky pleurální. Praktická část je věnována jednotlivým metodám zpracování, jejichž vyhodnocení je v závěrečné, experimentální části. Klíčová slova: cytologie, výpotek, cytoblok, cytospin Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem.
Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením MUDr. Jitky Hausnerové a uvedla v seznamu literatury všechny použité literární a odborné zdroje. V Brně dne...... podpis autora
Touto cestou bych ráda poděkovala vedoucí práce MUDr. Jitce Hausnerové za její odborné vedení, čas a věcné rady. Mé díky patří také paní laborantce Andree Jelínkové za její pomoc při zpracování vzorků.
Obsah 1 ÚVOD... - 7-2 OBECNÁ ČÁST... - 8-2.1 CYTOLOGIE... - 8-2.1.1 MATERIÁL URČENÝ PRO CYTOLOGICKÉ VYŠETŘENÍ... - 9-2.1.1.1 Exfoliativní cytologie... - 9-2.1.1.2 Abrazivní cytologie... - 10-2.1.1.3 Punkční cytologie... - 10-2.2 VÝPOTKY... - 11-2.2.1 PLEURÁLNÍ VÝPOTEK... - 11-2.2.1.1 Hrudní punkce... - 12-2.2.2 MAKROSKOPICKÝ VZHLED PUNKTÁTU... - 15-2.2.3 MIKROSKOPICKÉ HODNOCENÍ PUNKTÁTU... - 16-2.2.4 ODLIŠENÍ BENIGNÍCH A MALIGNÍCH VÝPOTKŮ... - 20-3 SPECIÁLNÍ ČÁST... - 23-3.1 CÍLE... - 23-3.2 ZPRACOVÁNÍ VÝPOTKŮ V LABORATOŘI... - 24-3.2.1 CYTOSPINOVÝ PREPARÁT... - 24-3.2.2 CYTOLOGICKÉ BARVENÍ... - 26-3.2.2.1 Papanicolaou (PAP)... - 26-3.2.2.2 May Grünwald Giemsa (MGG)... - 27-3.2.2.3 Hematoxylin-eosin (HE)... - 28-3.2.3 CYTOBLOK... - 30-3.2.3.1 Sedimentační metoda... - 31-3.2.3.2 Agarová metoda... - 31-3.2.3.3 Metoda s použitím Histogelu... - 32-3.3 IMUNOHISTOCHEMIE... - 37 -
3.3.1 POUŽITÉ PROTILÁTKY... - 38-4 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST... - 41-4.1 ZHODNOCENÍ VÝTĚŽNOSTI VZORKŮ ZPRACOVANÝCH TECHNIKOU CYTOBLOKU... - 41-4.2 POROVNÁNÍ 3 METOD ZPRACOVÁNÍ CYTOBLOKU... - 49-5 ZÁVĚR... - 55-6 ZDROJE... - 57 -
Seznam zkratek CB ELISA FN HE HG ID IHC LBC MGG N/C NIS PAP ÚPA Cytoblok Enzyme-linked immuno sorbent assay Fakultní nemocnice Hematoxylin-eosin Histogel Identifikační údaje Imunohistochemie Liquid based cytology May Grünwald Giemsa Nukleocytoplazmatický poměr Nemocniční informační systém Papanicolaou barvení Ústav patologie
1 ÚVOD Předložená práce se zabývá využitím techniky cytobloku při laboratorním zpracování výpotků. Všechny výpotky, vyšetřované na Ústavu patologie Fakultní nemocnice Brno, se v současné době rutinně zpracovávají metodou cytospinu i cytobloku. Cytoblok nabízí oproti cytospinu výhodu použití imunohistochemického barvení, a tím i přesnější diagnostiku nádorových onemocnění. Pro srovnání jsou použity tři metody zpracování cytobloku. Jedná se o metodu formolsedimentační, standardně využívanou na ÚPA FN Brno, metodu s použitím agaru a metodu s použitím Histogelu. U takto připravených preparátů se pak hodnotí množství a typ buněk a jejich rozložení v preparátu. Důvodem pro srovnání metod jsou úvahy o zavedení nové metody s použitím Histogelu. Pokud by se potvrdily její kvality, mohla by na Ústavu patologie nahradit současnou metodu formol-sedimentační. - 7 -
2 OBECNÁ ČÁST 2.1 CYTOLOGIE Cytologie je věda zabývající se studiem buněk, ať už normálních nebo strukturálně změněných, které mohou pocházet z různých částí těla. Název se odvozuje z řeckého kytos = buňka a latinského logos = věda. Cytologie zkoumá buněčné tvary, složení, funkce a změny, které mohou nastávat za fyziologických a patologických podmínek. Do cytologie také spadá podobor cytopatologie, který hodnotí morfologii buněk, ne však jejich funkci. Patolog hodnotí změny tvaru buňky, jaderné membrány, jádra, strukturu chromatinu, buněčné inkluze, vzhled jadérek apod. Podle těchto znaků pak určí, zda se jedná o buňku zdravou nebo patologicky změněnou. (Driák, 2011), (Al Alwan, b.r.) Na rozdíl od histologie, cytologie se zabývá změnami až na úrovni jádra a cytoplazmy a hodnotí každou buňku zvlášť. Výhodou také je to, že diagnóza může být určena mnohem rychleji než při klasických histopatologických technikách. Materiál pro vyšetření je možno získat mnoha způsoby. Na rozdíl od histologie je základním barvením barvení dle Papanicolau, May Grünwald-Giemsa, histologické barvení Hematoxylin-eosin však lze také použít. (Al Alwan, b.r.) Histologie je ale stále zlatým standardem v diagnostické patologii. Celé tkáně umožňují stanovit přesnější diagnózu. Interpretace změn v buněčné morfologii je založena hlavně na individuálním pozorování a ty často nemohou být zařazeny do pevných kritérií. Proto v mnoha případech nemůže být z cytologie stanovena finální diagnóza a je nutná konfirmace s histologií. Důvody jsou následující: Podstata poškození není tak zřejmá jako v histologickém řezu. Z cytologie je obtížné určit umístění léze. Například dlaždicové buňky karcinomu nalezené v cytologii ve vzorku sputa mohou pocházet z bukální sliznice, hltanu nebo průdušek. Velikost léze nemůže být v cytologii přiblížena. Typ léze, např. karcinom in situ, v porovnání s počátkem invaze je obtížné posoudit vzhledem k tomu, že vztah k okolnímu stromatu nemůže být určen cytologií. (Al Alwan, b.r.) - 8 -
2.1.1 MATERIÁL URČENÝ PRO CYTOLOGICKÉ VYŠETŘENÍ Materiál pro cytologické vyšetření může být různý, různé jsou tedy i techniky jeho odběru. Výhodou cytologie je to, že využívá minimální množství vzorku ke zpracování a stanovení diagnózy. V zásadě jsou pro cytologii typické tři možnosti odběru vzorku, a to: Samovolně odloučené buňky Buňky získané kartáčovými stěry nebo podobnou abrazivní technikou Aspirační biopsie nebo získání buněk z nepovrchových orgánů za pomoci jehly, případně stříkačky 2.1.1.1 Exfoliativní cytologie Exfoliativní cytologie je založena na spontánním odlučování buněk z výstelky orgánu do dutiny, odkud může být odebrán neabrazivním způsobem. Typickým příkladem jsou vaginální stěry z buněk odloučených ze zadní klenby poševní. Buňky, které se hromadí poševní klenbě, pocházejí z dlaždicového epitelu, z epiteliální výstelky endocervikalního kanálu i vzdálenějších oblastí, jako je endometrium. Dalším příkladem vzorku, získaným exfoliativní cytologií, je sputum. Sputum je mukózní materiál, obsahující buňky odloučené z bukální sliznice, hrtanu, hltanu, průdušnice, bronchů a plicních alveolů. Dále obsahuje zánětlivé buňky, mikroorganismy a další. Exfoliativní cytologie je nejjednodušší ze tří uvedených technik. K zabránění znehodnocení buněk přítomností vzduchu, enzymatickými nebo bakteriálními procesy, by měl být materiál co nejdříve zpracován. Alternativou je použití fixativa, například alkoholu. - 9 -
2.1.1.2 Abrazivní cytologie Smyslem tohoto postupu je získání vzorku, který obsahuje buňky získané přímo z povrchu místa, které je zájmem cytologického vyšetření. Z toho důvodu je buněčný vzorek obvykle získán povrchovým seškrabem z lézí. Této metody využívá kartáčový stěr z děložního čípku, zvaný také Pap test, nebo novější metoda LBC, při které je kartáček s buňkami vložen do tekutého média. Dalším příkladem je stěr z bukální sliznice, seškrab kůže nebo kartáčové techniky používané při endoskopii. (Al Alwan, b.r.) 2.1.1.3 Punkční cytologie Jedná se o metodu, která je mírně invazivní a bývá prováděna ambulantně. Používá se při odběru vzorků štítné žlázy, prsu, prostaty a dalších orgánů. Po dezinfekci místa vpichu je pak jehlou a stříkačkou aspirován materiál z ložiska. Preparáty z takto získaného materiálu lze zpracovat roztěrem na sklíčko nebo jako cytoblok. Do této kategorie spadá i odběr tělních výpotků. (Dvořák, 2008), (Al Alwan, b.r.) - 10 -
2.2 VÝPOTKY Termínem výpotek se označuje nahromadění tekutiny v tělních dutinách. Fyziologicky se v těchto dutinách vyskytuje malé množství tekutiny, které je nezbytné ke zvlhčování parietálního a viscerálního listu a jejich vzájemnému pohybu. Technika cytobloku se používá nejčastěji právě při diagnostice výpotků. (Ganjei-Azar, 2011) Dle lokalizace se rozlišují se výpotky pleurální, perikardiální a peritoneální. Perikardiální výpotky, jak už je z názvu zřejmé, se vyskytují v perikardu srdce. Jejich výskyt je častý u zánětů srdce, ruptury aorty, zhoubných nádorů. Za peritoneální výpotek, nebo také ascites, se považuje nahromadění tekutiny v dutině břišní. Mezi nejčastější příčiny ascitu patří záněty a nádorová onemocnění dutiny břišní, onemocnění jater a srdeční selhání. (Riedel, b.r.), (Cibas, 2009) Hromadící se patologickou tekutinu označujeme jako transsudát nebo exsudát, podle toho, jak vzniká. Liší se i svými biochemickými vlastnostmi. Exsudát je výpotek zánětlivého původu, zatímco transudát je nezánětlivá tekutina. (Biboo, 2008) 2.2.1 PLEURÁLNÍ VÝPOTEK Fluidotorax je nejčastěji se vyskytujícím výpotkem. Plíce je kryta hladkou blánou, poplicnicí (viscerální pleura). Ta přechází v oblasti plicního hilu v pohrudnici (parietální pleura), která kryje celou pleurální dutinu (Obrázek 1). (Páč, 2012) Štěrbinový prostor mezi poplicnicí a pohrudnicí se nazývá pleurální dutina. Pleurální dutina je fyziologicky vyplněna malým množstvím serózní (0,1 0,3 ml/kg), tlakově hypoonkotické tekutiny. (Zatloukal, 2001) Za pleurální výpotek je považováno nahromadění tekutiny v pleurální dutině nad fyziologickou mez (více než 10 ml tekutiny u dospělého člověka s hmotností 70 kg). (Zatloukal, 2001) - 11 -
Nejčastější příčinou nahromadění tekutiny v hrudníku je nádorové onemocnění. Může se jednat o maligní onemocnění pleury, ale častěji je tumor lokalizován v jiné oblasti (plíce, GIT, vaječníky, apod.) Další možnou příčinou je onemocnění srdce (tzv. kardiální hydrotorax), zánětlivá onemocnění a plicní embolizace. (Marel, 2011) Obrázek 1: Anatomie pleury [1] 2.2.1.1 Hrudní punkce Hrudní punkce je lékařský výkon, při kterém je jednorázově nabodnuta pohrudniční dutina dutou jehlou za účelem odstranění patologického obsahu (tekutina, vzduch) z tohoto prostoru. (Hrudní punkce a drenáž, b.r.) Kontraindikacemi hrudní punkce jsou velmi malý výpotek, koagulopatie, trombocytopenie a stav po pneumonektomii (chirurgické odstranění plíce). (Hrudní punkce, b.r.) - 12 -
Relativní kontraindikací je umělá plicní ventilace, kvůli velkému riziku přetlakového pneumotoraxu. Další komplikací, která znemožňuje hrudní punkci, jsou kožní choroby, u kterých hrozí rozšíření infekce do dalších míst (např. virus herpes zoster virus pásového oparu). (Zatloukal, 2001) Hrudní punkce se dělí na diagnostické a terapeutické. Diagnostická hrudní punkce se nemusí provádět u všech pacientů v případě, že klinický průběh je typický. To může být u pacienta s městnavým srdečním selháním. Dále také u menších výpotků po hrudní nebo břišní operaci. (Zatloukal, 2001) Důvodem pro terapeutickou hrudní punkci je odstranění nahromaděné tekutiny v pleurální dutině. Tím se sníží plicní kapilární tlak a zvyšuje se poddajnost plíce. Provádí se u pacientů s městnavým srdečním selháním. Cílem terapeutické hrudní punkce je ulevit pacientovi od dušnosti, což znamená, že pokud se pacientovi po první hrudní punkci neuleví, nemá je smysl opakovat. (Zatloukal, 2001) Provedení hrudní punkce Poloha vsedě s rukama dopředu, kdy pacient sedí na židli obkročmo směrem k opěradlu s rukama opřenýma o opěradlo, je pro pacienta nejpohodlnější a zároveň pro lékaře nejvýhodnější (Obrázek 3). Lékař nejprve prohlédne skiagram, provede poslechové a poklepové vyšetření, případně ultrasonografické vyšetření a poté zakreslí místo vpichu. Při terapeutické punkci se používá silnější punkční jehla, a proto je nutné ji provádět s lokální anestezií. Diagnostická punkce zahrnuje pouze jeden vpich tenkou jehlou, tudíž se zde lokální anestezie nepoužívá. Vpich je vždy veden nad horním okrajem žebra, aby nedošlo k poškození nervově cévního mezižeberního svazku. Ten probíhá při dolním okraji žebra (Obrázek 2). Komplikací punkce může být pneumotorax, méně často krvácení do hrudní dutiny. Při jedné punkci by se nemělo odebrat více než 1000 1500 ml tekutiny, kvůli riziku plicního edému z rychlé reexpanze plíce. (Zatloukal, 2001) - 13 -
Obrázek 2: Odběr výpotku [2] Obrázek 3: Poloha při odběru výpotku [3] - 14 -
2.2.2 MAKROSKOPICKÝ VZHLED PUNKTÁTU Po přijetí vzorku do laboratoře a před jeho laboratorním zpracováním laborantka nejprve hodnotí vzhled punktátu makroskopicky. Tyto údaje pak napíše cytopatologovi na žádanku. Transsudát bývá většinou čirý, vzhledu krevního séra, bez zápachu a viskozity. Naproti tomu exsudát je většinou viskózní, zakalený a často obsahuje příměs krve. Zakalení exsudátu může být způsobeno tukem nebo buněčnou příměsí. Dalším typem výpotku je hemoragický výpotek, neboli hemotorax, obsahující krev, a také chylotorax, výpotek mléčného zabarvení. (Teřl, b.r.) (Fila, 2007) Čichem je možno rozlišit vzácný urinotorax, který páchne po moči. Putridní zápach je známkou, že se nejspíše jedná o anaerobní empyém. (Teřl, b.r.) Po makroskopickém zhodnocení (Obrázek 4) následuje laboratorní zpracování. Na Ústavu patologie FN Brno se každý výpotek zpracovává cytospinovou metodou a ze zbytkového materiálu se připravuje cytoblok. Obrázek 4: Makroskopický vzhled punktátu. Vlevo krvavý, uprostřed exsudát, vpravo hnisavý výpotek. - 15 -
2.2.3 MIKROSKOPICKÉ HODNOCENÍ PUNKTÁTU Preparát nejprve prohlíží a orientačně hodnotí cytologická skrínerka, následně je prohlížen cytopatologem, který napíše závěrečnou diagnózu. Pro lékaře je nejdůležitější zjištění, zda buňka, nacházející se ve výpotku, je zde fyziologicky a jestliže tomu tak není, kde je její původ. Ve výpotcích jsou přítomny buňky odvozené z krve (erytrocyty, leukocyty, histiocyty) a buňky ze serózních výstelek. Poměr různých typů buněk je variabilní, záleží na okolnostech vzniku, jako jsou délka trvání exsudace a přítomnost nebo absence zánětu. Rozhodnout, které buňky jsou ve výpotku normální, je složité, protože už samotná přítomnost výpotku je patologií. (Biboo, 2008) Mezoteliální buňky Mezotelie jsou buňky vystýlající tělní dutiny. Ve vzorku jsou nacházeny jednotlivě nebo v malých shlucích. Mají okrouhlé jádro i cytoplazmu a často obsahují více jader. Pojmem reaktivní mezotelie se označuje spektrum buněk od normálních po atypické, s různou velikostí jádra, hrubou texturou chromatinu, nepravidelnými jadernými obrysy nebo s nápadnými jadérky (Obrázek 5). (Cibas, 2009) Mezoteliální buňky mohou, v závislosti na okolnostech, podlehnout hypertrofii (hypertrofie = zvětšení objemu buněk) a hyperplazii (hyperplazie = zmnožení buněk a tkání). Podnětem pro vznik může být zánět, nekróza, přítomnost dalších látek, jako krev nebo vzduch, v serózních dutinách. Mikroskopicky nelze rozpoznat, jaký stimul podnítil hypertrofii nebo hyperplazii. To musí být určeno z klinických obtíží. (Biboo, 2008) - 16 -
Obrázek 5: Mezotelie, vlevo nahoře se nahází skupinka pravidelných mezotelií, v okolí erytrocyty, lymfocyty a makrofág (zvětšení 40x) Erytrocyty Červené krvinky jsou ve výpotku časté, většinou jde ale o kontaminaci při odběru. V preparátu jsou to dobře poznatelné buňky s velikostí o průměru 7 µm. Při přípravě preparátu může dojít k jejich poškození a změně vzhledu. Erytrocyty mají bikonkávní tvar, ale mohou se objevit i jiné tvarové formy. (Biboo, 2008) Neutrofily Téměř každý výpotek obsahuje neutrofilní granulocyty. Jejich počet může být různý, od ojedinělých buněk ve vzorku až po hodně buněčný hnisavý výpotek, obsahující téměř samé neutrofily. Purulentní výpotky jsou světle žluté barvy a viskózní konzistence. Pokud jsou infekční, mohou zapáchat. Neutrofilní granulocyty jsou snadno rozpoznatelné jak v nátěru, barveném Papanicolaou, tak v cytobloku. Jádro je lobární, cytoplazma bez viditelných granul. (Biboo, 2008) - 17 -
Eosinofily Eosinofilní pleurální výpotky se nacházejí u široké škály onemocnění. Může se jednat o alergie, autoimunitní choroby, pneumonie, plísňové onemocnění, parazitární infekce, malignity, plicní tuberkulózu, pneumotorax a jiné. (Biboo, 2008) Histiocyty Histiocyty jsou přítomny v různých formách u téměř všech serózních výpotků. Jejich velikost je velmi různorodá, od 15µm do 100 µm v průměru, nejčastěji ale 20 µm- 40 µm. V nátěru lze makrofág poznat dle jeho velikosti, excentricky uloženého kulatého nebo fazolovitého jádra s lehce probarvenou, krajce podobnou, cytoplasmou. Makrofágy jsou fagocyty, a proto lze v jejich cytoplasmě pozorovat pohlcené leukocyty, erytrocyty, lipidové kapénky, buněčné částice, hemosiderin. (Biboo, 2008) Lymfocyty Většina výpotků obsahuje alespoň pár lymfoidních buněk, které lze rozpoznat v nátěru barveném Papanicolaou. Jedná se o malé buňky s okrouhlým jádrem a úzkým lemem cytoplasmy, někdy cytoplasma nebývá zřetelná. Patologicky zvýšený počet lymfocytů bývá u chronických zánětlivých onemocnění, včetně tuberkulózních. (Biboo, 2008) Megakaryocyty Megakaryocyty jsou ve výpotcích zřídkakdy nalézány. Vyskytovat se ale mohou u myeloproliferativních onemocnění, lymfomů, metastatických karcinomů. Megakaryocyty jsou velké buňky s velkým proměnlivým jádrem. (Biboo, 2008) - 18 -
Obrázek 6: Zánětlivé buňky:lymfocyty, neutrofily, eosinofil, makrofágy, erytrocyty (zvětšení 40x) - 19 -
2.2.4 ODLIŠENÍ BENIGNÍCH A MALIGNÍCH VÝPOTKŮ Naprosto zásadní je odlišení, zda se ve výpotku nachází buňky fyziologicky přítomné nebo maligní. Fyziologicky přítomné buňky jsou všechny výše popsané. Záleží také na jejich počtu. Při nálezu maligních buněk patologa zajímá, odkud tyto buňky pocházejí. To je naprosto klíčová otázka a záleží na ní léčba pacienta. Maligní buňky (Obrázek 7) se identifikují porovnáním s benigními mezoteliálními buňkami. Často tvoří "druhou populaci buněk", která je od buněk benigních odlišitelná. Může se ale stát, že ve vzorku dominuje pouze populace nádorová. Někdy také benigní elementy mohou napodobovat nádor. Takovým příkladem mohou být prstenčité buňky napodobující karcinom z prstenčitých buněk, jednotlivé buňky, které vypadají jako buňky karcinomu nebo lymfomu a některé další benigní buňky. (Dušková, b.r.) Maligní buňky nemusí být větší než mezoteliální, ale mají vyšší N/C poměr, hyperchromní jádra nebo makronukleoly. Maligní buňky také tvoří shluky, které u mezotelií většinou nenacházíme a mají tendenci k ohraničení. V cytobloku tvoří lakuny. (Cibas, 2009) Obecně platí, že většina maligních výpotků jsou exsudáty, není to však pravidlem, transsudáty tvoří zhruba 20% maligních efuzí. Malignita také většinou nebývá doprovázena výrazným zánětem. Dále platí důležité pravidlo, které říká, že pokud jsou buňky degenerované nebo je jejich morfologie špatně hodnotitelná, neměla by se stanovit nádorová diagnóza. (Dušková, b.r.) Nález maligních buněk může signalizovat primárně zhoubné onemocnění pleury, maligní mezoteliom (Obrázek 8, Obrázek 9, Obrázek 10), ale také nádorové onemocnění jiného orgánu (plic, žaludku, slinivky, prsu, vaječníku, apod.), což znamená pokročilou fázi onkologického onemocnění. Z preparátu nabarveného cytologickým barvením patolog nemůže poznat, odkud maligní buňky pocházejí. K tomu využívá imunohistochemické barvení, které využívá imunologických principů. Cílem je lokalizace molekuly antigenu použitou protilátkou. (Hořejší, 2009) - 20 -
Obrázek 7: Maligní buňky (trs buněk v centru obrázku). (zvětšení 40x) Obrázek 8: Maligní mezoteliom, barvení MGG. Přítomny atypické mezotelie s variabilně velkými jádry a hyperchromázií jader. (zvětšení 20x) - 21 -
Obrázek 9: Maligní mezoteliom, cytoblok, barvení HE (zvětšení 40x) Obrázek 10: Maligní mezoteliom, pozitivita CK7 (hnědá barva značí pozitivitu, modrá negativitu) (zvětšení 40x) - 22 -
3 SPECIÁLNÍ ČÁST 3.1 CÍLE Cílem této práce je porovnání tří metod zpracování vzorků technikou cytobloku. Vzorek o velkém množství materiálu, přijatý do laboratoře ÚPA FN Brno, byl rozdělen na tři stejné části a každá tato část pak zpracována jinou metodou přípravy cytobloku, metodou sedimentační, agarovou a metodou s použitím Histogelu. U takto připravených preparátů pak bylo hodnoceno a porovnáno množství, typ a rozložení jednotlivých buněk přítomných ve vzorku. Chceme zjistit, který metoda je nejvíce výtěžná a tedy nejlepší pro potřeby Ústavu patologie FN Brno. Předpokládáme, že metoda s použitím Histogelu by mohla nároky splňovat nejlépe, a pokud by tomu tak bylo, mohla by nahradit současně využívanou metodu sedimentační. Dalším cílem je zhodnocení výtěžnosti již zpracovaných vzorků od pacientů s pleurálním výpotkem. Teprve nedávno bylo totiž zavedeno zpracování každého výpotku, přijatého na ÚPA FN Brno, jak metodou cytospinovou, tak metodou cytobloku (formol-sedimentační metoda). Zaměřila jsem se zde na to, v kolika případech byl cytoblok výtěžný/nevýtěžný (tedy bylo dostatečné množství vzorku s dostatečnou buněčností) a co bylo nejčastější příčinou vzniku výpotku. - 23 -
3.2 ZPRACOVÁNÍ VÝPOTKŮ V LABORATOŘI Všechny výpotky by se měly zpracovávat čerstvé, bez použití fixace. Pokud není možný okamžitý transport do laboratoře, uchovávají se vzorky v lednici při teplotě 2-8 C. Materiál by měl být zpracován do 48 hodin od doby odběru. (Standardní operační postup organizační, 2014) Diagnostická kritéria jsou založena na tom, jak jsou vzorky buněk připraveny. Metody přípravy, fixace a barvení se mohou lišit v závislosti na laboratoři. Metodiky jsou si většinou podobné v jejich základním konceptu, jde o zredukování buněčných artefaktů a získání optimálně buněčného vzorku. (Cibas, 2009) Na patologickém ústavu FN Brno se každý výpotek zpracovává nejprve cytospinovou metodou, zbytkový materiál slouží pro přípravu cytobloku. Rutinně se používá metoda CB s filtrací sraženiny (formol-sedimentační). 3.2.1 CYTOSPINOVÝ PREPARÁT Cytocentrifuga (Obrázek 11) je speciálně upravená centrifuga, sloužící ke zhotovení mikroskopického preparátu. Do rotoru se vkládají speciální nástavce (Obrázek 12) s plastovou zkumavkou, mikroskopickým sklem a filtračním papírem s kruhovým otvorem, jehož průměr činí 5 mm. (Dastych, 2007) Sklo se nejprve označí ID pacienta a poté se sestaví nástavec. Do zkumavky se napipetuje vzorek a spustí příslušný program. Během centrifugace se tekutina ze vzorku vsákne do filtračního papíru a buňky se přichytí na podložní sklo. Takto zpracovaný preparát se obarví metodou PAP a MGG a zamontuje. - 24 -
Obrázek 11: Cytocentrifuga Obrázek 12: Nástavec pro cytospin - 25 -
3.2.2 CYTOLOGICKÉ BARVENÍ 3.2.2.1 Papanicolaou (PAP) Základním barvením v cytologii je polychromatické, přesněji trichromatické, barvení Papanicolaou. Sestává z jednoho jádrového a dvou cytoplazmatických barvení. Vzorek nesmí až do doby zpracování vyschnout, jinak dochází k nežádoucím artefaktům a nedostatečnému probarvení cytoplazmy. Metoda je často modifikována v závislosti na laboratoři, lišit se mohou roztoky i časy. Je mnoho faktorů, které mohou ovlivnit výsledek. Jedná se o typ použitého fixativa, složení použitého hematoxylinu, složení difúzního barviva, doba barvení, teplota vody pro oplach, čerstvost barviva a řada dalších. Cytologický preparát se nejprve fixuje v alkohol-éteru a poté opláchne pod tekoucí vodou. Na Ústavu patologie FN Brno probíhá barvení v barvicím automatu Varistein (Obrázek 13). Použitý roztok Čas 1. 96% alkohol 10 minut 2. Oplach destilovanou vodou 1 minuta 3. Harrisův hematoxylin 5 minut 4. Praní ve vodě 1 minuta 5. Praní ve vodě 1 minuta 6. Modrání ve vodovodní vodě 10 minut 7. 96% alkohol 40 sekund 8. Oranž G6 5 minuta 9. Oplach v 96% v alkoholu 1 minuta 10. Oplach v 96% v alkoholu 30 sekund 11. Polychrom EA50 5 minut 12. Oplach v 96% v alkoholu 40 sekund 13. Oplach v 96% v alkoholu 40 sekund 14. Oplach v 96% v alkoholu 40 sekund 15. 100% alkohol 1 minuta 16. Xylen 5 minut 17. Xylen 5 minut Tabulka 1: Protokol barvení dle Papanicolaou - 26 -
Výsledek cytologického barvení dle Papanicolaoua Jádra buněk: tmavě modrá až fialová Cytoplasma eosinofilních buněk: růžová až fialová Cytoplasma cyanofilních buněk: zelená Erytrocyty: oranžovočervené Hlen: zelený až světle fialový Bakterie: tmavě fialové Spory a mycelia: růžové Keratinizující buňky: oranžové (Beranová, 2014) 3.2.2.2 May Grünwald Giemsa (MGG) Barvení May Grünwald Giemsa je panoptické barvení což znamená, že znázorňuje všechny struktury. Na rozdíl od barvení dle Papanicolaou se jedná o monochromatické barvení. (Dvořák, Dvořáková, Feit, 2008) Před barvením se nechají preparáty zaschnout po dobu minimálně 30 minut. Do kyvet se připraví barvicí řada. Použitý roztok Čas 1. May-Grünwald, neředěný 5 minut 2. May Grünwald, ředěný 1:1 destilovanou vodou 5 minut 3. Giemsa-Romanowki, ředěný 1:10 20 minut 4. Oplach vodovodní vodou Tabulka 2: Protokol barvení MGG Výsledek cytologického barvení MGG Jádra buněk: modrá až fialová Cytoplasma: šedivě modrá - 27 -
Hlen: modrý až fialový Jadérka: temně modrá Erytrocyty: světle červené (Beranová, 2014) 3.2.2.3 Hematoxylin-eosin (HE) Hematoxylin-eosin je základní barvicí metoda v histologii. Hematoxylin je nažloutlý krystalický prášek. Před barvením se musí nejdříve oxidovat pomocí oxidačních činidel (např. jodičnan sodný nebo draselný). K připravenému hemateinu se pak přidá mořidlo a tím vznikne barevný lak. Podle druhu mořidla se hematoxyliny dělí na kamencové a železité. Na ÚPA FN Brno se používá kamencový Mayerův hematoxylin. Barvení Hematoxylin-eosin se používá k barvení cytobloků. Použitý roztok Čas 1. 96% alkohol 15 minut 2. Oplach destilovanou vodou 30 sekund 3. 96% alkohol 5 minut 4. 50% alkohol 5 minut 5. Praní ve vodě 30 sekund 6. Mayerův hematoxylin 2 minuty 7. Praní ve vodě 30 sekund 8. Praní ve vodě 5 minut 9. Eosin 30 sekund 10. Praní ve vodě 30 sekund 11. 96% alkohol 30 sekund 12. 96% alkohol 30 sekund 13. 96% alkohol: xylen 1:1 30 sekund 14. Xylen 5 minut 15. Xylen 5 minut Tabulka 3: Protokol barvení HE - 28 -
Výsledek barvení HE Jádra buněk: modrá Cytoplasma: červená Chrupavka: modrá Svalstvo: červené Erytrocyty: červené (Beranová, 2014) Obrázek 13: Barvicí automat - 29 -
3.2.3 CYTOBLOK Technika cytobloku je velmi užitečná při zpracování tekutých vzorků. Metod přípravy je více, ale vždy jde o to, že se materiál zalije do parafínu a krájí na mikrotomu jako klasický bioptický materiál. Výhodou CB je možnost použití imunohistochemických barvení na cytoblokové řezy. Patolog tak může určit původ malignity. V dnešní době také nabývají na významu metody molekulární biologie. Jednou z nich je fluorescenční in situ hybridizace (FISH), která může být většinou aplikována pouze na vzorky zpracované technikou cytobloku, nikoli cytospinu. U pacientů s plicním karcinomem se metodou FISH provádí vyšetření na ALK mutaci. Pokud je mutace prokázána, jsou tito pacienti léčeni podle cíleného léčebného protokolu. (Jing, b.r.) (Jain, 2014) Ze vzorku výpotku přijatého do laboratoře je nejprve připraven cytospinový preparát. Teprve potom následuje zpracování cytobloku. Obecným problémem cytobloku je právě malé množství materiálu. Z toho důvodu se může stát, že vzorek bude málo buněčný, což neumožní morfologické, ani imunohistochemické hodnocení. Takovýto vzorek potom hodnotíme jako nevýtěžný. Na ÚPA FN Brno je standardně využívanou metodou metoda sedimentační. Její výhodou je bezesporu cena. Použitým spotřebním materiálem je v tomto případě filtrační papír a roztok formolu. Metoda je ale poměrně zdlouhavá a zabere zhruba celé dopoledne. Po tříhodinové fixaci a dalším zpracování totiž následuje filtrace, která trvá, v závislosti za vzorku, další dvě až tři hodiny. Navíc předpokládáme, že výtěžnost této metody není úplně optimální z toho důvodu, že při sedimentaci a zalití do parafínu se buňky ze vzorku dostanou do různých vrstev bločku a v jednotlivých řezech jsou pak jen jednotlivé buňky. Z těchto důvodů je zvažována nová metoda. Pokud se prokáže lepší výtěžnost metody s použitím Histogelu, mohla by nahradit, na Ústavu patologie FN Brno současně využívanou, metodu sedimentační. Výtěžností máme na mysli lepší buněčnost preparátu. Předpokládáme, že by měla být vyšší z toho důvodu, jelikož by buňky při centrifugaci s Histogelem a markerem měly padnout ke dnu a být tak v jedné vrstvě. Laborantka pracující s mikrotomem pak ví, kde má krájet, díky dobře viditelnému markeru. Výhodou histogelové metody, oproti metodě sedimentační, je časová úspora. HG cytoblok, od přijetí vzorku do laboratoře po vložení Histogelového disku do kazetky, určené k zalití do - 30 -
parafínu, trvá přibližně hodinu. Navíc se jedná o metodu sofistikovanější. Vzorky jsou mnohem rychleji zpracovány, navíc se pracuje s automatickou pipetou a laborantka nepřijde do styku s punktátem tolik, jako když výpotek stojí několik hodin v laboratoři a sedimentuje. Cena materiálu je v tomto případě vyšší. Je nutno zakoupit komerčně dodávaný Histogel i malé zkumavky s plochým dnem. Ty se ovšem budou sterilizovat a používat opakovaně. 3.2.3.1 Formol-sedimentační metoda Jedná se o nejjednodušší metodu přípravy cytobloku. Není k ní zapotřebí žádné speciální vybavení, ani reagencie, zato je však zdlouhavá. Čerstvý nebo z lednice vytažený výpotek se ve zkumavce zalije formolem a materiál se nechá fixovat po dobu 3 hodin. Po zfixování se připraví nálevka s filtračním papírem a kádinka, do které bude odkapávat čirá tekutina. Tekutina se nechá překapat přes filtrační papír. Pokud je materiál ve filtračním papíru bezbarvý nebo je ho malé množství, přidá se kapka Mayerova hematoxylinu. Poté se filtrační papír s materiálem složí a vloží do očíslované modré kazetky. Takto očíslované se vloží do nádobky s formolem. Další zpracování pak pokračuje na úseku biospií, kde je materiál zalit do parafínu, krájen na mikrotomu a obarven Hematoxylinem-eosinem. 3.2.3.2 Agarová metoda Výpotek se nechá zcentrifugovat při 1200 otáček/7 minut. Poté se slije supernatant a do zkumavky přidá formol pro zfixování materiálu. Fixujeme po dobu 10 minut. Mezitím se nechá v mikrovlnné troubě rozpustit agar. Malá skleněná zkumavka obsahující zfixovaný výpotek se zalije agarem a vloží do větší plastové zkumavky, naplněné teplou vodou. Teplá voda zajistí, aby agar při centrifugaci ihned nezatuhnul. Zkumavka se nechá centrifugovat na 3500 otáček po dobu 5 minut. Po vyjmutí z centrifugy se malá zkumavka vyjme ven. Vyjmutí cytobloku Do stříkačky se natáhne formol a agar ve zkumavce se jí opatrně obkrouží se současným vytlačováním formolu z pístu. Dojde k uvolnění agarového bločku, který se zabalí do filtračního papíru a vloží do označené kazetky. Až do doby zalití a krájení je ponechán v kádince s formolem. - 31 -
3.2.3.3 Metoda s použitím Histogelu Tato metoda přípravy cytobloku využívá k zalití buněk ze vzorku Histogel (Obrázek 14). Jedná se o speciální gel, který po krátkém zahřátí v mikrovlnné troubě mění svoji konzistenci v tekutinu. Oproti agaru je mnohem tekutější a netuhne tak rychle. Navíc mnohem lépe proniká mezi buňky ze vzorku. Další nezbytnou součástí této metody je marker. Jedná se o fragment tmavé barvy, který po centrifugaci zůstane, stejně jako buňky, na dně zkumavky a slouží k orientaci při histologickém krájení. Obrázek 14: Histogel Příprava markeru Marker potřebný k této metodice je možné zakoupit. Jeho příprava však není složitá, a proto byl pro potřeby laboratoře Ústavu patologie Fakultní nemocnice Brno připraven dle návodu uvedeného v literatuře. Pro jeho přípravu je potřeba slupka od banánu. Ta se podélně nejprve nakrájí na cca 2 mm tenké proužky a každý poté proužek příčně, také přibližně po 2 mm. Takto nakrájená banánová slupka se přemístí do nádobky a přidá se inkoust tak, aby byly všechny kousky ponořené. Po zhruba 10 minutách se přidá nadbytek 10% formalínu. Poté se odstraní přebytečný inkoust promytím vodou nebo 10% formalínem. Takto připravený marker se skladuje v 10% formalínu. (M. Varsegi, b.r.) - 32 -
Příprava vzorku a vložení markeru Podle doporučení metody Shidham se vzorek přenese do malé zkumavky s plochým dnem a v té se nechá zcentrifugovat. Na Ústavu patologie FN Brno je vzorek nejprve přepipetován do popsané zkumavky s kulatým dnem, následuje centrifugace (3000 otáček/5 min) a slití supernantu (Obrázek 15). Obrázek 15: Vzorky po centrifugaci (oddělen sediment a supernatant) Obrázek 16: Označené zkumavky s markerem - 33 -
Do malé zkumavky (označené ID vzorku) s plochým dnem (Obrázek 16) se vloží signální marker tmavé barvy, o velikosti 2 mm 2 mm, který má plochý povrch a dá se dobře krájet na mikrotomu. Histogel se nechá rozpustit přibližně po dobu 10 vteřin v mikrovlnné troubě. Poté se do zkumavky s kulatým dnem, ve které je slitý vzorek, přidá 0,5 ml Histogelu. HG je nutné se vzorkem řádně promíchat několikerým nasátím a vypuštěním pipety. Toto odchýlení se od doporučení metody Shidham bylo zařazeno, jelikož buňky po zcentrifugování ve zkumavce s plochým dnem nedržely, a při slití byly odplaveny. Nyní je důležité pracovat rychle, aby Histogel neztuhnul. Malou zkumavku s plochým dnem je třeba uzavřít. Do plastové nádobky se napipetuje 2,5 ml teplé vody (teplota 45 C). Malá skleněná zkumavka se přemístí do plastové nádobky s teplou vodou. Tento krok je důležitý z toho důvodu, aby Histogel okamžitě neztuhnul. Nádobka z plastu, s vloženou skleněnou zkumavkou, je vložena do centrifugy. Centrifuguje se při 3000 otáček/5 min. Smyslem centrifugace v tomto kroku je průnik markeru a koncentrace buněk do vrstvy těsně k řezné ploše finálního cytobloku, zalitého do parafínu. Plastová nádobka se skleněnou zkumavkou se opatrně vyjme z centrifugy tak, aby se nerozvířil sediment buněk na dně. Menší skleněná zkumavka (Obrázek 17) se vytáhne pomocí pinzety, stále je nutné dávat pozor na nechtěné rozvíření buněk. Skleněná zkumavka se vzorkem se vloží do lednice na 15 minut kvůli zchlazení a tím i ztuhnutí HG. Obrázek 17: Vzorky s Histogelem po centrifugaci - 34 -
Vyjmutí cytobloku Ztuhnutý disk Histogelu se sedimentem buněk na dně zkumavky je třeba uvolnit. K tomu slouží stříkačka obsahující 10% formalín. Jehla stříkačky se vsune ke stěně zkumavky a opatrně obkrouží HG disk (Obrázek 18). Při tomto pohybu je ze stříkačky pomalu uvolňován formalín. Díky tomu se disk z Histogelu, spolu s koncentrovanými buňkami a AV markerem, oddělí ode dna zkumavky (Obrázek 19). Gelový disk je přemístěn do označené kazetky a následuje zalití do parafínu. Obrázek 18: Vyjmutí cytobloku - 35 -
Obrázek 19: HG disk Zalití a krájení vzorku HG disk se zalije do parafínu. Marker je na spodní straně řezné plochy. Cytoblok je krájen, dokud není marker odkrytý a jasně viditelný. Od tohoto místa jsou pak krájeny 3-4 µm silné řezy. Řezy jsou zachyceny na podložní sklíčko a obarveny klasickým barvením a dále imunohistochemicky. - 36 -
3.3 IMUNOHISTOCHEMIE Imunohistochemie, spadající do oboru histochemie, je praktická aplikace imunologických principů a metod, které umožňují studium tkání nebo buněk. K detekci jednotlivých struktur využívá vzájemnou vazbu antigenu a protilátky. Antigeny přítomné ve tkáních mohou být endogenního i exogenního původu. Endogenní antigeny jsou například antigeny membránové, cytoskeletální, produkty onkogenů a další. Exogenní antigeny jsou nejčastěji bakteriální nebo virové. (Lukáš, 1997) Do imunohistochemie patří všechny techniky využívající monoklonální či polyklonální značené protilátky, jimiž se lokalizují a vizualizují příslušné tkáňové antigeny. Metody IHC jsou doplňkem přehledně i speciálně barvených preparátů v rutinní diagnostice. Pro výzkumné účely a některé další speciální úkony bývá IHC ještě doplňována dalšími imunochemickými metodami, jako jsou ELISA, Western blotting a jiné. (Lukáš, 1997) V imunohistochemii se je základním principem vazba antigenu a protilátky. Pokud je tedy antigen (nebo antigenní determinanta) ve sledované tkáni přítomen, naváže se na něj specifická protilátka a tuto vazbu je pak možno znázornit řadou způsobů. (Lukáš, 1997) Imunohistochemické metody se rozdělují podle principu vazby a jejich zviditelnění. Imunohistochemické metody: Přímá metoda Nepřímá metoda dvojstupňová Nepřímá metoda trojstupňová o Metoda PAP (peroxidase-anti-peroxidase komplex) o Metoda ABC (avidin-biotin komplex) Přímá metoda Přímá metoda je nejjednodušší způsob detekce antigenu ve tkáni. Primární protilátka je přímo značena enzymem. Při použití přímé metody musí být antigen přítomen ve studované tkáni v nadbytku. Konjugované protilátky rozpoznají více epitopů téhož antigenu a používají se zejména v nativních řezech, na parafínových řezech je metoda málo citlivá. (Beranová, 2002) - 37 -
Nepřímá metoda dvojstupňová Nepřímé IHC metody jsou mnohem citlivější a také složitější než metody přímé. Nejprve se na tkáňové řezy aplikuje primární protilátka proti prokazovanému antigenu a teprve potom se nanese protilátka proti primární protilátce. Druhá protilátka je značena enzymem. (Beranová, 2002) Nepřímá metoda trojstupňová Metoda se používá, pokud je koncentrace antigenu ve tkáni nízká. Nejprve se je na řez aplikována primární protilátka reagující se studovaným antigenem ve tkáni. Poté se použije neznačená specifická protilátka proti protilátce první a zároveň třetí, jedná se tedy o protilátku spojovací a tvoří tzv. můstek. Nakonec se přidá značený komplex, kterým může být peroxidáza-anti-peroxidázový komplex nebo avidin-biotin komplex. (Beranová, 2002) 3.3.1 POUŽITÉ PROTILÁTKY Cytokeratin 5/6 (CK 5/6) Protilátka užívaná k detekci mezoteliálních buněk (mezotel je dlaždicový epitel kryjící výstelku tělních dutin) a buněk skvamózního epitelu. (DAKO, b.r.) Cytokeratin 7 (CK 7) Protilátka značící mnoho typů normálních a neoplastických epitelů. Je vhodná pro klasifikaci adenokarcinomů plic, prsu, endometria, štítné žlázy, vaječníků i karcinomů ledvin. (DAKO, b.r.) Cytokeratin 20 (CK 20) CK 20 je vhodný pro detekci adenokarcinomu tlustého střeva a žaludku, spolu s CK 7 bývá exprimován také u karcinomu žlučového systému i slinivky břišní. (DAKO, b.r.) - 38 -
Thyroidní transkripční faktor (TTF1) TTF1 je selektivně exprimován v plicích a štítné žláze. Slouží k rozlišení primárního (TTF1+) a metastazujícího (TTF1-) plicního karcinomu. V přibližně 15% případů primárních plicních karcinomů ale TTF1 není pozitivní. (DAKO, b.r.) Dále TTF1 je vykazuje pozitivitu v případě plicního adenokarcinomu, na rozdíl od karcinomu z dlaždicových buněk, jež je TTF1 negativní. Lze jím také odlišit karcinom plic (TTF1+) od mezoteliomu (TTF1-). (DAKO, b.r.) (Pathology Outlines, b.r.) Estrogenový receptor (ER) ER značí jádra buněk exprimujících estrogenový receptor. Jedná se tedy o buňky dělohy a mléčné žlázy. (DAKO, b.r.) Progesteronový receptor (PR) PR je receptorem steroidních hormonů, které hrají důležitou roli v diagnostice rakoviny prsu. (DAKO, b.r.) Protein p63 (p63) p63 je exprimován v jádru bazálních buněk mnoha epitelů. Při diagnostice výpotků slouží tento marker k odlišení plicního adenokarcinomu od plicního dlaždicobuněčného karcinomu. (DAKO, b.r.) CA 125 Protilátka exprimující se při adenokarcinomu tlustého střeva, karcinomu prsu, maligním metozeliomu, karcinomu plic, karcinomu vaječníku a dalších. (DAKO, b.r.) - 39 -
Calretinin Calretinin slouží k detekci mezotelií. (DAKO, b.r.) HBME-1 Protilátka reagující s membránou mezoteliálních buněk. Slouží ke klasifikaci epiteliálního mezotelimu a adenokarcinomu různého původu. (DAKO, b.r.) Prostatický specifický antigen (PSA) PSA je silně exprimován normálními i neoplastickými buňkami prostaty. Pozitivita bývá u zhoubných i nezhoubných nádorů a infekcí prostaty. (DAKO, b.r.) - 40 -
4 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 4.1 ZHODNOCENÍ VÝTĚŽNOSTI VZORKŮ ZPRACOVANÝCH TECHNIKOU CYTOBLOKU Experimentální část se zabývá zhodnocením výtěžnosti vzorků zpracovaných technikou cytobloku. Pro zhodnocení bylo použito 75 vzorků pleurálních výpotků vyšetřovaných na Ústavu patologie Fakultní nemocnice Brno v období 1. 1. 2015 18. 11. 2015. Data o vzorcích byla získána z nemocničního informačního systému (NIS) se svolením FN Brno. VYHODNOCENÍ VĚK Ze získaných dat je zřejmé, že pleurální výpotek se vyskytuje především u pacientů nad 60 let věku (tvoří 88% pacientů) (Tabulka 4). Tito lidé častěji trpí onemocněními, u nichž se může právě pleurální výpotek vyskytovat. Jedná se například o srdeční selhání, nádorová onemocnění (může se jednat o maligní mezoteliom, ale častěji jde spíše o primární tumor jiného orgánu, převážně plic a prsu), pneumonie apod. věk počet procenta [%] 0-40 1 1 41-60 8 11 61-80 52 69 81-100 14 19 Tabulka 4: Věk pacientů - 41 -
Obrázek 20: Věk pacientů POHLAVÍ Ve vyhodnocování vzorků jsem se zaměřila také na pohlaví pacientů (Tabulka 5). Pohlaví pacientů zřejmě nehraje vliv při vzniku výpotku. Záleží zde na onemocnění, které výpotek vyvolalo. Ze 75 vyšetřovaných vzorků se jednalo ve 41 případech o muže, ve 34 případech o ženy. Poměr mužů a žen je tedy přibližně vyrovnaný. pohlaví počet procenta [%] muži 41 55 ženy 34 45 Tabulka 5: Pohlaví pacientů - 42 -
Graf 1: Pohlaví pacientů VÝTĚŽNOST CYTOBLOKU Výtěžnost cytobloku byla jednou z klíčových otázek. Zajímalo nás, kolik takto zpracovaných výpotků je výtěžných a hodnotitelných (Tabulka 6). Vzorek považujeme za nevýtěžný, jestliže obsahuje velmi malé množství buněčných elementů. To totiž následně znemožňuje zhodnocení morfologie i imunohistochemické navázání specifických protilátek. V některých případech je totiž vzorku výpotku tak málo, že preparát z něj není možné hodnotit. Cytoblok se totiž připravuje ze zbytkového materiálu, předchází mu zpracování cytospinem. Jindy je zase fluidotorax velmi málo buněčný, což právě znemožňuje jeho diagnostiku. Ze 75 vzorků byl výpotek výtěžný v 79% případů. výtěžnost počet procenta [%] ANO 59 79 NE 16 21 Tabulka 6: Výtěžnost cytobloku - 43 -
Obrázek 21: Výtěžnost cytobloku DRUH VÝPOTKU U výpotků je důležité zjištění, jaké buňky se v něm nacházejí a zda se tedy jedná o výpotek maligní, zánětlivý nebo hemoragický. Pokud byl výpotek jiného charakteru, nebo jestliže tato informace ve výsledku nebyla udána, je zde zařazen do kategorie výpotků nejasné etiologie (Tabulka 7). Druh výpotku se určoval u 59 vzorků, které byly vyhodnoceny jako výtěžné. Ve více než polovině případů se jednalo o maligní výpotek (56%), počet zánětlivých a hemoragických výpotků byl poměrně vyrovnaný. Zánětlivý výpotek tvořil 22% případů, hemoragický 19%. druh počet procenta [%] maligní 33 56 zánětlivý 13 22 hemoragický 11 19 nejasné etiologie 2 3 Tabulka 7: Druh výpotku - 44 -
Obrázek 22: Druh výpotku POUŽITÉ PROTILÁTKY K rozlišení maligních výpotků se využívá imunohistochemie. Použité protilátky patologovi napoví, kde se nachází primární ložisko tumoru. Nejčastěji aplikovanou protilátkou byla TTF1, tedy thyroidní transkripční receptor. Z celkových 36 vzorků, ve kterých byly aplikovány protilátky, TTF1 bylo použito ve 32 případech. Nádor plic totiž bývá nejčastější příčinou vzniku pleurálního výpotku, a proto je jeho průkaz patology nejvíce požadován (Tabulka 8). Protilátka počet Protilátka Počet CK 5/6 18 CA 125 4 CK 7 26 ER 9 CK 20 8 PR 9 TTF1 32 HBME 1 p63 16 PSA 1 calretinin 16 Tabulka 8: Použité protilátky - 45 -
Obrázek 23: Použité protilátky PŮVOD VÝPOTKU Maligní výpotky tvořily celkem 33 vzorků. V 17 případech bylo prokázáno, že výpotek je tvořen na základě plicního karcinomu (Obrázek 25, Obrázek 26, Obrázek 27). U 5 výpotků byl potvrzen původ malignity v gynekologické nebo prsní oblasti. V 1 případě byl zjištěn původ maligních buněk z karcinomu gastrointestinálního traktu. U deseti výpotků tento údaj nebyl uveden (Tabulka 9). původ malignity počet případů plíce 17 gynekol. 5 GIT 1 neuvedeno 10 Tabulka 9: Původ výpotku - 46 -
Obrázek 24: Původ výpotku Obrázek 25: Plicní adenokarcinom, barvení MGG (zvětšení 20x) - 47 -
Obrázek 26: Plicní adenokarcinom, cytoblok, barvení HE (zvětšení 40x) Obrázek 27: Plicní adenokarcinom, pozitivita TTF1 (jaderný marker). Hnědá barva=pozitivita jader. Trs buněk nevykazujících pozitivitu = mezotelie. (zvětšení 20x) - 48 -
4.2 POROVNÁNÍ 3 METOD ZPRACOVÁNÍ CYTOBLOKU V předložené bakalářské práci jsme se zaměřili také na porovnání 3 různých metod zpracování vzorků technikou cytobloku. Hlavním kritériem pro výběr vzorku bylo množství materiálu. Tuto podmínku splňovalo pouze 6 vzorků, z toho byl pouze jeden maligní. Vhodný výpotek byl totiž zpracován technikou cytospinu a dále pak materiál rozdělen na tři stejné části. Každá tato část pak byla zpracována jinou metodou, a to metodou sedimentační, agarovou a metodou s použitím Histogelu. Cytobloky byly po zpracování v laboratoři nakrájeny a obarveny Hematoxylinem-eosinem. Následovalo vyhodnocení cytopatologem. V hodnocených preparátech nás zajímala výtěžnost, tedy to, zda byl vzorek hodnotitelný. Dále pak buněčnost, typ přítomných buněk a jejich rozložení v preparátu a typ výpotku (Tabulka 10). V prvním případě se jednalo o smíšený zánětlivý výpotek s převahou neutrofilů. Cytospinový preparát, stejně jako ve všech ostatních případech, vykazoval vysokou buněčnost a rovnoměrné rozložení buněk. Výtěžný byl i CB preparát připravený agarovou metodou, jehož buněčnost byla hodnocena jako střední. Buněčnost Histogelového preparátu byla nízká a to mělo vliv na posouzení výtěžnosti, ta byla totiž z tohoto důvodu omezená. Cytoblok připravený sedimentační metodou byl nevýtěžný, jednalo se o acelulární vzorek. U druhého vzorku, charakteru smíšeného zánětlivého výpotku, vykazoval vysokou buněčnost, kromě cytospinového preparátu, také cytoblok, zhotovený klasickou sedimentační metodou. Buňky v něm však byly nakupeny na sobě, v ostatních preparátech bylo jejich rozložení rovnoměrné. Preparáty, zhotovené technikou agarovou a metodou s použitím Histogelu, byly středně buněčné. U třetího, hnisavého výpotku, vykazovaly vysokou buněčnost všechny preparáty, které tedy byly zároveň hodnoceny jako výtěžné. Stejně jako u druhého vzorku, byly v preparátu zhotoveném formol-sedimentační metodou, buňky nakupené na sobě. Ve všech preparátech se nacházely neutrofily, erytrocyty, nečetné lymfocyty a mezotelie dobře čitelnou morfologií. U čtvrtého vzorku, hemoragicko-lymfocytárního výpotku, byla shledána nejvyšší buněčnost z cytoblokových preparátů u vzorku zhotoveného metodou s použitím Histogelu. - 49 -
Ta byla hodnocena jako střední, zatímco u agarového a formol-sedimentačního preparátu se jednalo o málo buněčný vzorek. To pak také mělo vliv na výtěžnost. Hemoragicko-lymfocytární výpotek, který byl pro naše účely označen číslem 5, byl ve všech případech výtěžný. CB připravený HG metodou se vyznačoval vysokou buněčností, stejně jako cytospinový preparát. Střední buněčnost byla pozorována u preparátů připravených sedimentační a agarovou metodou. Ve výpotku se nacházely erytrocyty, lymfocyty, dále pak nečetné neutrofily a ojediněle mezotelie. Rozložení buněk bylo u všech preparátů rovnoměrné. Jediný maligní výpotek byl u všech zpracovaných preparátů hodnocen jako výtěžný, u Histogelového preparátu vykazoval vysokou buněčnost. Preparáty zhotovené sedimentační a agarovou metodou vykazovaly střední buněčnost, ale u sedimentační metody byly buňky nerovnoměrně rozložené, nakupené na sobě. Porovnání bylo provedeno na malém počtu vzorku, protože bylo nutné použít pouze vzorky s dostatečným objemem materiálu. I přes to, se metoda s použitím Histogelu, zdá být perspektivní. Ve srovnání se standardně využívanou metodou na ÚPA FN Brno, metodou sedimentační, vykazovala HG metoda ve čtyřech případech vyšší buněčnost. Agarová metoda se taky neukázala jako optimální řešení z toho důvodu, že agar při práci rychle tuhne a vytlačuje buňky k okrajům zkumavky a buněčnost nebyla tak vysoká. V preparátech připravených sedimentační metodou je také problémem rozložení buněk. Buňky rovnoměrně zastoupené v preparátu lze snáze a lépe hodnotit, než buňky nakupené na sobě. - 50 -
Obrázek 28: Hnisavý výpotek, barvení MGG, zvětšení 40x Obrázek 29: Hnisavý výpotek, barvení PAP, zvětšení 40x. Přítomny četné neutrofilní granulocyty, méně lymfocyty, v pozadí dále erytrocyty a makrofágy - 51 -
Případ Metoda Barvení Buněčnost Přítomné buňky Rozložení Charakter Výtěžnost 1 Cytospin MGG, PAP Vysoká Zastiženy lymfocyty, neutrofily, mezotelie Rovnoměrné Smíšený zánětlivý Výtěžný s dobře čitelnou morfologií výpotek s převahou neutrofilů Formol-sedimentační HE Acelulární vzorek - - - Nevýtěžný Agar HE Střední Zastiženy lymfocyty, neutrofily, mezotelie s dobře čitelnou morfologií Histogel HE Nízká Zastiženy lymfocyty, neutrofily, mezotelie s dobře čitelnou morfologií 2 Cytospin MGG, PAP Vysoká Zastiženy lymfocyty, neutrofily, makrofágy, mezotelie s dobře čitelnou morfologií Formol-sedimentační HE Vysoká Zastiženy lymfocyty, neutrofily, makrofágy, mezotelie s dobře čitelnou morfologií Agar HE Střední Zastiženy lymfocyty, neutrofily, makrofágy, mezotelie s dobře čitelnou morfologií Histogel HE Střední Zastiženy lymfocyty, neutrofily, makrofágy, mezotelie s dobře čitelnou morfologií Rovnoměrné Rovnoměrné Rovnoměrné Buňky nakupené na sobě Rovnoměrné Rovnoměrné Smíšený zánětlivý výpotek s převahou neutrofilů Smíšený zánětlivý výpotek s převahou neutrofilů Smíšený zánětlivý výpotek s převahou neutrofilů Smíšený zánětlivý výpotek Smíšený zánětlivý výpotek Smíšený zánětlivý výpotek Výtěžný Výtěžnost omezená z důvodu nízké buněčnosti Výtěžný Výtěžný Výtěžný Výtěžný - 52 -
3 Cytospin MGG, PAP Vysoká Zastiženy neutrofily, erytrocyty, nečetné lymfocyty a mezotelie s dobře čitelnou morgologií Formol-sedimentační HE Vysoká Zastiženy neutrofily, erytrocyty, nečetné lymfocyty a mezotelie s dobře čitelnou morgologií Agar HE Vysoká Zastiženy neutrofily, erytrocyty, nečetné lymfocyty a mezotelie s dobře čitelnou morgologií Histogel HE Vysoká Zastiženy neutrofily, erytrocyty, nečetné lymfocyty a mezotelie s dobře čitelnou morgologií Rovnoměrné Hnisavý výpotek Výtěžný Buňky nakupené na sobě Hnisavý výpotek Výtěžný Rovnoměrné Hnisavý výpotek Výtěžný Rovnoměrné Hnisavý výpotek Výtěžný 4 Cytospin MGG, PAP Vysoká Zastiženy erytrocyty a lymfocyty Rovnoměrné Hemoragickolymfocytární výpotek Formol-sedimentační HE Nízká Zastiženy erytrocyty a lymfocyty Rovnoměrné Hemoragickolymfocytární výpotek Agar HE Nízká Zastiženy erytrocyty a lymfocyty Rovnoměrné Hemoragickolymfocytární výpotek Histogel HE Střední Zastiženy erytrocyty a lymfocyty Rovnoměrné Hemoragickolymfocytární výpotek Výtěžný Výtěžnost omezená z důvodu nízké buněčnosti Výtěžnost omezená z důvodu nízké buněčnosti Výtěžný - 53 -