ProSpecT TM Shiga Toxin E. coli (STEC), stanovení na mikrotitračních destičkách

ProSpecT TM Shiga Toxin E. coli (STEC), stanovení na mikrotitračních destičkách R2474048...48 testů R2474096...96 testů 1 POUŽITÍ destičkách je určeno pro kvalitativní detekci shigatoxinů (Stx1 a Stx2) ve vodných extraktech vzorků stolice a fekálních kulturách pomnožených v bujonu. Test je určen pro použití jako pomůcka při stanovení diagnózy enterohemoragických infekcí E. coli. 2 SHRNUTÍ E. coli produkující shigatoxin (STEC) je známa jako důležité etiologické agens průjmu a závažných epidemií nebo ojedinělých případů život ohrožující hemoragické kolitidy a hemolyticko-uremického syndromu (HUS 2,3,13,14 ). Kmeny E. coli s těmito účinky jako první popsali Konowalchuk et al., jenž identifikovali cytotoxin, který byl cytopatogenní pro Vero buňky a byl nazván verotoxin, VT 6,7,8. O Brien et al. doložili, že tento cytotoxin těsně souvisí s shigatoxinem 9 a nazvali tento toxin SLT (shiga-like toxin). Byly identifikovány dvě formy toxinů, Stx1 a Stx2 9, a bylo dokázáno, že izoláty E. coli produkující shigatoxin(stec) produkují jeden z těchto cytotoxinů, nebo oba 15,16. E. coli O157:H7 je nejčastěji identifikovaným sérotypem enterohemoragické E. coli (EHEC) a může být izolována a identifikována většinou klinických laboratoří 1,10,12,14. Do souvislosti s produkcí cytotoxinů a vznikem HUS a/nebo hemoragické kolitidy však bylo dáno minimálně 50 sérotypů E. coli 5,11. Karmali 4 popsal stanovení cytotoxinů pro detekci toxinů, avšak potvrzení cytotoxinu tímto stanovením je časově velmi náročné a klade velké nároky na zkušenosti. destičkách je enzymová imunoanalýza, která umožňuje přímou detekci toxinů Stx1 a Stx2 ve vzorcích stolice nebo ve fekálních kulturách pomnožených v bujonu. 3 PRINCIP TESTU destičkách je imunoanalýza na pevné fázi, která slouží pro zjištění shigatoxinů. Naředěné vzorky stolice se přidají do odlamovacích jamek mikrotirační destičky, na něž jsou vázány králičí polyklonální protilátky proti shigatoxinům 1 & 2. Je-li toxin přítomen, je zachycen navázanou protilátkou. Jamky se inkubují a poté se promyjí, aby se odstranil nenavázaný materiál. Přidá se enzymový konjugát (monoklonální myší protilátka proti shigatoxinům 1 & 2 značená enzymem křenovou peroxidázou). Jamky se inkubují a poté se promyjí, aby se odstranil nenavázaný enzymový konjugát. Při pozitivní reakci toxin naváže enzymový konjugát na jamku. Přidá se substrát enzymu, 3,3,5,5 - tetramethylbenzidin (TMB). Při pozitivní reakci enzym navázaný toxinem na jamku přemění substrát na barevný reakční produkt. Vznik zbarvení lze detekovat vizuálně nebo spektrofotometricky. Při negativní reakci není toxin přítomen nebo je přítomen v nedostatečném množství, aby mohl navázat enzymový konjugát, a nevytvoří se žádný barevný reakční produkt. 4 DEFINICE SYMBOLŮ Katalogové číslo Diagnostický zdravotnický prostředek in vitro Obsah postačuje pro <n> testů Prostudujte návod k použití Teplotní omezení (skladovací teplota) Číslo šarže (č. šarže) Datum ukončení použitelnosti (datum exspirace) Výrobce Ředěný vzorek CS 5 OBSAH SOUPRAVY, PŘÍPRAVA K POUŽITÍ A SKLADOVÁNÍ destičkách obsahuje činidla postačující pro 48 nebo 96 testů. Viz též Upozornění, část 6. Datum exspirace každé soupravy je uvedeno na štítku obalu. Všechny složky uchovávejte při teplotě 2 až 8 C. Před použitím vytemperujte všechna činidla na pokojovou teplotu (20-25 C) a jemně je promíchejte. Po použití vraťte nespotřebovaná činidla do chladničky. Všechna činidla kromě promývacího pufru jsou dodávána v pracovní koncentraci. Činidla lze dávkovat přímo z lahviček s kapátkem nebo je lze odlít pro použití s vícekanálovými pipetami. Pokud jste odlili nadměrné množství činidla, přebytek činidla zlikvidujte. Nelijte přebytek činidla zpět do láhve. Návod k použití Pipety pro přenos roztoků Držák a kryt proužků mikrotitračních destiček Karta s postupem Mikrotitrační destička* (8 jamek/proužek) 6 proužků (R2474048) nebo 12 proužků (R2474096) potažených králičí polyklonální protilátkou proti shigatoxinům 1 & 2. Nepoužité proužky mikrotitračních destiček skladujte v plastovém sáčku obsahujícím vysoušedlo zabraňující přístupu vlhkosti. Enzymový konjugát* Jedna lahvička s kapátkem obsahující 12 ml (R2474048) nebo 25 ml (R2474096) myší monoklonální protilátky proti shigatoxinům 1 & 2 značené křenovou peroxidázou s antimikrobiálními látkami. Pozitivní kontrolní vzorek Jedna lahvička s kapátkem obsahující 4 ml supernatantu kultury E. coli obsahujícího shigatoxiny 1 & 2 s fetálním hovězím sérem, králičím sérem a antimikrobiálními látkami. Negativní kontrolní vzorek Jedna lahvička s kapátkem obsahující 4 ml pufrovaného roztoku s králičím sérem, červeným barvivem a antimikrobiálními látkami. Roztok pro ředění bakteriálních vzorků Jedna lahvička obsahující 120 ml pufrovaného roztoku s králičím sérem, červeným barvivem a antimikrobiálními látkami. Promývací pufr Jedna lahvička obsahující 120 ml (10x) koncentrovaného pufrovaného roztoku s antimikrobiálními látkami. Nařeďte 10x koncentrovaný promývací pufr na koncentraci 1x přidáním 1 dílu koncentrátu do 9 dílů destilované nebo deionizované vody. Naředěný promývací pufr je stabilní po dobu 1 měsíce, je-li skladován při teplotě 2-8 C. Barevný substrát Jedna lahvička s kapátkem obsahující 12 ml (R2474048) nebo 25 ml (R2474096) 3,3,5,5 - tetramethylbenzidinu (TMB) v pufru. Barevný substrát uchovávejte v lahvičce chráněné před světlem, v níž se dodává, a k dávkování ho odebírejte z této lahvičky. Pokud z jakéhokoli důvodu z původní lahvičky odeberete alikvotní díl, nevracejte nespotřebovaný barevný substrát do původní lahvičky. 1

Zastavovací roztok Jedna lahvička s kapátkem obsahující 12 ml 0,46 mol/l kyseliny sírové. *Poznámka: Nezaměňujte činidla souprav s různým číslem šarže. 6 UPOZORNĚNÍ Činidla jsou určena pouze pro diagnostické použití in vitro. Určeno pouze pro odborné použití. Informace o potenciálně nebezpečných složkách si laskavě vyhledejte v příslušném bezpečnostním listu a na označení výrobku. ZDRAVOTNÍ A BEZPEČNOSTNÍ INFORMACE 6.1 Činidla jsou připravena z biologických materiálů a je nutné s nimi manipulovat jako s potenciálně infekčním materiálem. Při likvidaci používejte odpovídající postupy pro biologicky nebezpečné materiály. 6.2 Nepipetujte ústy. Při manipulaci se vzorky a provádění stanovení používejte rukavice na jedno použití a prostředky na ochranu zraku. Po skončení práce si důkladně umyjte ruce. 6.3 Vzorky mohou obsahovat potenciálně infekční agens a při manipulaci s nimi je nutné aplikovat stupeň biologické nebezpečnosti 2 podle doporučení příručky CDC/NIH Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (Biologická bezpečnost v mikrobiologických a biomedicínských laboratořích), 5.vydání. 6.4 Promývací pufr obsahuje látku potenciálně senzibilizující kůži (< 1 % obj.). Zamezte styku s kůží. Používejte jednorázové nitrilové rukavice nebo rukavice z PVC. 6.5 Pro likvidaci použitého promývacího pufru použijte vhodné nádoby určené pro biologicky nebezpečné materiály. ANALYTICKÉ POKYNY 6.6 Důkladně si přečtěte a dodržujte všechny pokyny uvedené v tomto návodu k použití. 6.7 Kromě koncentrátu promývacího pufru se činidla dodávají v potřebné pracovní koncentraci. Činidla neřeďte kromě případů, které jsou uvedeny v pokynech. 6.8 Nepoužívejte činidla po uplynutí data exspirace. Datum exspirace je vytištěno na štítku každého činidla. Použití činidel po uplynutí data exspirace může ovlivnit přesnost výsledků. 6.9 Následující společná činidla lze používat pro celou řadu výrobků ProSpecT: promývací pufr, barevný substrát a zastavovací roztok. 6.10 Mikrobiální kontaminace činidel může snižovat přesnost stanovení. Při odebírání alikvotních dílů z lahviček s činidly používejte sterilní jednorázové pipety, zabráníte tak mikrobiální kontaminaci činidel. 6.11 Před použitím nechte všechna činidla a vzorky vytemperovat na pokojovou teplotu (20-25 C). 6.12 Proužky mikrotitračních destiček musejí být skladovány v uzavíratelném plastovém sáčku obsahujícím vysoušedlo, které chrání mikrotitrační destičky před přístupem vlhkosti. 6.13 Vzorky stolice musejí být před zpracováním důkladně promíchány, aby se zajistilo přesné reprezentativní zastoupení vzorku. VZORKY PŘED PROVEDENÍM TESTU NEKONCENTRUJTE. 6.14 Barevný substrát je citlivý na působení světla. Je-li činidlo vystaveno světlu a dojde k zabarvení, činidlo musí být zlikvidováno. 6.15 Osoby, které jsou barvoslepé nebo zrakově postižené, nemusejí být schopny stanovit výsledky testu a měly by pro interpretaci výsledků používat hodnoty zjištěné při spektrofotometrickém měření. 6.16 V průběhu celého testu přidávejte činidla do testovacích jamek ve stejném pořadí. Nedotýkejte se tekutiny v jamkách špičkou kapátka, aby se zabránilo kontaminaci. 6.17 Každou inkubaci provádějte přesně stanovenou dobu. Dobu začněte měřit po přidání činidla do poslední jamky na každé testované mikrotitrační destičce. Nezpracovávejte najednou více než tři destičky o 96 jamkách, aby byla zajištěna přesná doba inkubace. Odchýlení od určeného postupu může mít vliv na průběh stanovení. 2 6.18 Je důležité, abyste lahvičky s kapátkem drželi svisle, aby se na špičce ústí kapátka vytvořila kapka. Pokud se ústí kapátka namočí, vytvoří se kapka nesprávné velikosti okolo jeho konce a nikoli na jeho špičce; pokud k tomu dojde, nejdříve ústí kapátka otřete a teprve poté pokračujte dále. 6.19 Shigatoxin 1 a toxin produkovaný kmeny Shigella dysenteriae typu 1 (shigatoxin) jsou téměř identické. Proto stanovení ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) na mikrotitračních destičkách může být pozitivní vždy, když je ve vzorku přítomno stanovitelné množství shigatoxinu. 7 ODBĚR VZORKŮ STOLICE Při přímém testování vzorků stolice budou optimální výsledky dosaženy, pokud bude stolice testována okamžitě po přijetí do laboratoře. Pokud je možné testování provést do 48 hodin od odběru čerstvých vzorků nebo do 7 dnů u vzorků v transportním médiu Cary Blair, mohou být vzorky uchovávány při teplotě 2-8 C, jinak je nutné je uchovávat při teplotě -20 C nebo nižší. ČERSTVÉ VZORKY Nekonzervované vzorky (nebo vzorky v transportním médiu Cary Blair) uchovávejte při teplotě 2-8 C nebo je ihned po odběru zmrazte při teplotě -20 C nebo nižší. Vzorky pro kultivaci vložte do bujonu během jedné až dvou hodin od obdržení do laboratoře. Vzorky naředěné v roztoku pro ředění bakteriálních vzorků mohou být před testováním uchovávány při teplotě 2-8 C po dobu až 48 dnů. ZMRAZENÉ VZORKY Jestliže nelze kultivaci provést během 1-2 hodin, je nutné čerstvé vzorky nebo vzorky v transportním médiu Cary Blair pro kultivaci zmrazit při teplotě -20 C nebo nižší. Opakované zmrazování a rozmrazování vzorků může způsobit degradaci toxinu. 8 POSTUP TESTU POTŘEBNÉ DODANÉ MATERIÁLY Viz Obsah soupravy, část 5. POTŘEBNÉ MATERIÁLY,KTERÉ NEJSOU SOUČÁSTÍ DODÁVKY Nádoby pro odběr vzorků stolice Časovač pro měření času v minutách Střička na promývací pufr Destilovaná nebo deionizovaná voda VOLITELNÉ MATERIÁLY, KTERÉ NEJSOU SOUČÁSTÍ DODÁVKY Čtečka mikrotitračních destiček schopná odečtu při 450 nm nebo 450/620 až 650 nm Aplikační tyčinky s koncem obaleným bavlnou nebo viskózovým hedvábím Mikropipeta na dávkování objemů do 200 µl Plastové nebo skleněné jednorázové zkumavky Míchačka vortex s adaptérem pro destičky nebo třepačka POSTUP 8.1 Příprava vzorků pro stanovení: Vzorky v transportním médiu Cary Blair, které mají být testovány, lze přidat přímo do jamek mikrotitračních destiček (viz krok 8.4 níže). Vzorky v transportním médiu promíchejte před přenesením na mikrotitrační destičku. Čerstvé vzorky stolice nebo kultury pomnožené v bujonu musejí být naředěny (viz rámeček A nebo B níže). A Přímé testování stolice 1 Přidejte 0,6 ml roztoku pro ředění bakteriálních vzorků do čisté zkumavky 12 x 75 mm. 2 Promíchejte stolici co nejdůkladněji a nařeďte ji následujícím způsobem: a Tekutá nebo polotuhá stolice: pomocí pipety pro přenos vzorků přidejte 0,3 ml (třetí značka od špičky pipety). Stolici důkladně smíchejte s roztokem pro ředění bakteriálních vzorků a ponechte pipetu pro přenos vzorku ve zkumavce. b Tuhá stolice: pomocí aplikační tyčinky přidejte 0,3 g (průměr cca 6 mm). Vytvořte ze stolice emulzi v roztoku pro ředění bakteriálních vzorků a vložte pipetu pro přenos vzorku do zkumavky. c Stolici v transportním médiu Cary Blair přidejte přímo do jamky mikrotitrační destičky bez dalšího ředění. d Suspenzi stolice promíchejte na míchačce vortex. 3 PŘEJDĚTE KE KROKU 8.2

B Metoda s bujonem 1 Naočkujte 50 µl nebo 50 µg (množství odpovídající malému hrášku) čerstvé stolice nebo stolice v transportním médiu Cary Blair do 5 ml trypton-sójového bujonu (TSB), modifikovaného trypton-sójového bujonu (mtsb) nebo bujonu podle MacConkeyho. 2 Inkubujte při teplotě 37 C po dobu 18-24 hodin. 3 Do čisté zkumavky 12 x 75 mm přidejte 0,6 ml roztoku pro ředění bakteriálních vzorků. 4 Pipetou pro přenos vzorků přeneste 0,3 ml kultury pomnožené v bujonu do 0,6 ml roztoku pro ředění bakteriálních vzorků. Ponechte pipetu pro přenos vzorku ve zkumavce. 5 PŘEJDĚTE KE KROKU 8.2 8.2 Otevřete plastový sáček, vyjměte z něj potřebný počet proužků mikrotitračních destiček a vložte je do držáku proužků mikrotitračních destiček. Jednu jamku použijte pro negativní kontrolní vzorek a jednu jamku pro pozitivní kontrolní vzorek. Použijete-li méně než 8 jamek, odlomte z proužku potřebný počet jamek a nepoužité jamky vraťte do plastového sáčku s vysoušedlem. SÁČEK OPĚT TĚSNĚ UZAVŘETE, ABYSTE ZABRÁNILI PŘÍSTUPU VLHKOSTI, A VRAŤTE HO DO CHLADNIČKY. 8.3 Přidejte 4 kapky (200 µl) negativního kontrolního vzorku do jamky A1. Přidejte 4 kapky (200 µl) pozitivního kontrolního vzorku do jamky B1. 8.4 Pipetou pro přenos vzorků přidejte 4 kapky (200 µl) naředěného vzorku nebo nenaředěné stolice v transportním médiu Cary Blair do každé jamky. Poznámka: Vložte otvor pipety pro přenos vzorků do jamky tak, abyste zabránili rozstříknutí do okolních jamek. 8.5 Zakryjte mikrotitrační destičku a inkubujte ji při pokojové teplotě (20-25 C) po dobu 60 minut. Čas začněte měřit po přidání posledního vzorku. 8.6 Obsah jamek vytřepejte nebo odsajte. Promyjte tak, že každou jamku zcela naplníte zředěným promývacím pufrem (cca 350-400 µl na jamku). Po každém promytí z jamek vytřepejte nebo odsajte veškerou tekutinu. Promývejte celkem třikrát. Po posledním promytí odstraňte obsah a klepněte destičkou na čisté papírové utěrky nebo ji odsajte. Odstraňte maximální možné množství promývacího pufru, ale nikdy nenechte jamky vyschnout. 8.7 Do každé jamky přidejte 4 kapky (200 µl) enzymového konjugátu. 8.8 Zakryjte mikrotitrační destičku a inkubujte ji při pokojové teplotě (20-25 C) po dobu 30 minut. 8.9 Jamky vytřepejte nebo je odsajte a každou jamku pětkrát promyjte jako v kroku 8.6. 8.10 Do každé jamky přidejte 4 kapky (200 µl) barevného substrátu. 8.11 Zakryjte mikrotitrační destičku a inkubujte ji při pokojové teplotě (20-25 C) po dobu 10 minut. 8.12 Do každé jamky přidejte 1 kapku (50 µl) zastavovacího roztoku. Jemně jamkami poklepejte nebo je promíchejte na míchačce vortex, dokud nebude žluté zbarvení rovnoměrné. Změřte reakce do 10 minut po přidání zastavovacího roztoku. 8.13 Výsledek stanovte vizuálně nebo spektrofotometricky při 450 nm (jedna vlnová délka) nebo při 450/620 až 650 nm (dvě vlnové délky). 9 ŘÍZENÍ JAKOSTI Pozitivní a negativní kontrolní vzorky musejí být součástí stanovení při každém testu. Pozitivní a negativní kontrolní vzorky slouží jako kontrola činidel a kontrola postupu stanovení. Kontrolní vzorky jsou určeny pro monitorování závažných chyb činidel. Pozitivní kontrolní vzorek nezajistí přesnost při mezní hodnotě stanovení. Optická hustota (O.D.) negativního kontrolního vzorku by měla být < 0,100 při 450 nm nebo < 0,070 při 450/620 až 650 nm. Negativní kontrolní vzorek by měl být při vizuálním stanovení bezbarvý. Má-li negativní kontrolní vzorek žluté zbarvení, které na kartě s postupem odpovídá intenzitě zbarvení 1+ nebo vyšší, je nutné test zopakovat a věnovat při tom důkladnou pozornost promývacímu postupu. Optická hustota pozitivního kontrolního vzorku by měla být > 0,500 při 450 nm nebo 450/620 až 650 nm, a při vizuálním stanovení by měla odpovídat intenzitě zbarvení na kartě s postupem 2+ nebo vyšší. Má-li pozitivní kontrolní vzorek žluté zbarvení, které na kartě s postupem odpovídá intenzitě nižší než 2+, požádejte telefonicky o technickou asistenci. 10 VÝSLEDKY Interpretace zbarvení naleznete na přiložené kartě s postupem. VIZUÁLNÍ STANOVENÍ 10.1 Stanovte výsledky testu srovnáním se zbarveními reakce uvedenými na kartě s postupem. Pozitivní: Žluté zbarvení minimálně o intenzitě 1+. Negativní: Bezbarvé. Nelze stanovit: Slabě žluté zbarvení o intenzitě nižší než 1+. 10.2 Interpretace výsledků vizuálního stanovení: Pozitivní: Pokud v testovací jamce vznikne zbarvení, které na kartě s postupem odpovídá alespoň intenzitě 1+, vzorek obsahuje Stx1 nebo Stx2, nebo oba toxiny a test je pozitivní. Negativní: Bezbarvá reakce představuje negativní výsledek a indikuje, že testovaný vzorek neobsahuje žádný Stx1 ani Stx2 nebo je v něm přítomno nedetekovatelné množství toxinů. Nelze stanovit: Pokud vznikne slabě žluté zbarvení o intenzitě nižší než 1+, výsledek testu nelze stanovit. Testy, jejichž výsledek nelze stanovit, je nutné zopakovat. Pokud jsou výsledky opakovaného testu pozitivní, je vzorek pozitivní. Pokud jsou výsledky opakovaného testu negativní, je vzorek negativní. Pokud opět nelze stanovit výsledky opakovaného testu, je nutné získat a testovat nový vzorek. SPEKTROFOTOMETRICKÉ STANOVENÍ 10.3 Stanovte výsledky při jedné (450 nm) nebo dvou (450/620 až 650 nm) vlnových délkách. 10.4 Stanovené hodnoty výsledků testu: A. Jedná vlnová délka Pozitivní: O.D. > 0,150 Negativní: O.D. < 0,100 Nelze stanovit: O.D. 0,100-0,150. B. Dvě vlnové délky Pozitivní: O.D. > 0,100 Negativní: O.D. < 0,070 Nelze stanovit: O.D. 0,070-0,100 10.5 Interpretace výsledků spektrofotometrického stanovení: Pozitivní: Je-li hodnota optické hustoty vyšší než 0,150 (při jedné vlnové délce) nebo 0,100 (při dvou vlnových délkách), je výsledek pozitivní a indikuje přítomnost Stx1 a/nebo Stx2. Negativní: Je-li hodnota optické hustoty nižší než 0,100 (při jedné vlnové délce) nebo nižší než 0,070 (při dvou vlnových délkách), je výsledek negativní a indikuje, že testovaný vzorek neobsahuje Stx1, Stx2 nebo oba toxiny a nebo obsahuje nedetekovatelné množství toxinu. Nelze stanovit: Hodnota optické hustoty v rozmezí 0,100-0,150 (jedna vlnová délka) nebo 0,070-0,100 (dvě vlnové délky) znamená, že výsledky testu nelze stanovit. Testy, jejichž výsledek nelze stanovit, je nutné zopakovat. Pokud jsou výsledky opakovaného testu pozitivní, je vzorek pozitivní. Pokud jsou výsledky opakovaného testu negativní, je vzorek negativní. Pokud opět nelze stanovit výsledky opakovaného testu, je nutné získat a testovat nový vzorek. Poznámka: Výsledky stanovení všech jamek, jež jsou na pohled čiré, ale jejichž změřená hodnota optické hustoty neodpovídá vizuální interpretaci, je nutné považovat za rozporný výsledek a zkontrolovat, zda v jamkách nejsou bublinky, drobné částice nebo zda se v dolní části jamky nevytvořila neprůhledná vrstva. Případnou vrstvu odstraňte tak, že otřete spodní strany jamek, a znovu stanovte optickou hustotu. Jestliže rozpor mezi vizuálně stanoveným výsledkem a optickou hustotou přetrvává, zopakujte test. 11 FUNKČNÍ OMEZENÍ TESTU Platnost výsledků získaných pomocí stanovení ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) na mikrotitračních destičkách závisí na tom, zda kontrolní reakce proběhne podle očekávání. Viz Řízení jakosti, část 9. 3

Negativní výsledek testu nevylučuje možnost přítomnosti shigatoxinů a může nastat, pokud je hladina antigenu ve vzorku nižší než detekční úroveň testu. Korelace mezi množstvím antigenu ve vzorku a klinickými projevy nebyla stanovena. Stejně jako u všech diagnostických testů IN VITRO by výsledky testu měl interpretovat lékař s ohledem na klinický nález a/nebo další laboratorní výsledky. Správný odběr a zpracování vzorků je nezbytné pro dosažení optimálního průběhu stanovení. Optimální výsledky testu se získávají ze vzorků testovaných co nejdříve po odebrání vzorků. Viz též Odběr vzorků stolice, část 7. destičkách bylo klasifikováno jako velmi složité. 12 OČEKÁVANÉ HODNOTY Nejméně 50 různých sérotypů E. coli produkující shigatoxin (STEC) bylo dáno do souvislosti s tvorbou cytotoxinů a se vznikem život ohrožující hemoragické kolitidy a hemolyticko-uremického syndromu (HUS), což je důležité komplikace, která má za následek selhání ledvin, trombocytopenii a anémii. Přestože jsou rizikem vzniku HUS v důsledku infekce E. coli produkující shigatoxin vysoce ohroženy malé děti, mohou být rizikem infekce STEC též ohroženy další vybrané subpopulace, jako jsou senioři a pacienti s imunodeficitem. Jak je patrné z výsledků klinických hodnocení stanovení ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) na mikrotitračních destičkách, byla v testované populaci přítomna řada různých sérotypů. Testování na infekce STEC by nemělo být omezeno na testy, jež jsou specifické pouze pro O157:H7. Rovněž je třeba mít na paměti, že vždy neexistuje přímá korelace mezi výsledky přímého testování vzorků a testováním kultury pomnožené v bujonu. Může to být mimo jiné způsobeno tím, že: a.) toxin může být přítomen ve stolici ve stanovitelném množství, ale buňky STEC již nejsou schopny kultivace, b.) izolované kmeny E. coli O157 z kultivačního vyšetření stolice pacientů nepřímo souvisejí s intervalem mezi začátkem průjmu a mikrobiologickou kultivací 17 ; c.) toxin může být přítomen ve stolici v množství, které není testem stanovitelné, avšak buňky STEC je možné i nadále kultivovat; a d.) antimikrobiální léčba může mít vliv na kultivovatelnost buněk STEC. 13 PRACOVNÍ CHARAKTERISTIKY CITLIVOST A SPECIFIČNOST destičkách bylo hodnoceno na třech geograficky odlišných klinických pracovištích ve Spojených státech, Kanadě a v Německu. Jednalo se o tato pracoviště: městská nemocnice ve Virginii v USA, dětská nemocnice v Torontu v Kanadě a velký mikrobiologický ústav v Německu. V souboru vzorků byly zastoupeny tyto populace pacientů: symptomatičtí pacienti v normální dospělé populaci a pediatrické populaci s prevalencí. Vzorky byly předloženy nekonzervované a byly testovány stanovením ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) na mikrotitračních destičkách jako čerstvé vzorky a jako kultury pomnožené přes noc. Všechny vzorky též byly testovány stanovením cytotoxinů (CTA) na přítomnost shigatoxinů. Vzorky pozitivní na shigatoxin byly izolovány a byl u nich stanoven sérotyp (viz tabulka 3). U všech pozitivních a sporných výsledků byla pouze pro účely hodnocení provedena amplifikace pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) pro stanovení přítomnosti genu pro shigatoxin. Výsledky jednotlivých testovacích pracovišť jsou uvedeny v tabulkách 1 a 2. Při použití metody přímého testování bylo zjištěno 20 pozitivních vzorků (EIA+, CTA+, PCR+). Tři vzorky byly EIA-, CTA+, PCR+. Pět vzorků bylo EIA+, CTA-, PCR-. U všech nestanovitelných výsledků bylo zjištěno, že byly skutečně negativní. U 354 vzorků bylo oběma metodami zjištěno, že byly negativní (EIA-, CTA-). Celkové charakteristiky počátečního a opakovaného stanovení pro ověření výsledků ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) na mikrotitračních destičkách jsou uvedeny níže v tabulce 1. Tabulka 1. Stanovení ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) na mikrotitračních destičkách ve srovnání se stanovením cytotoxinů přímo ze vzorků stolice. Přímé testování stolice Počáteční výsledky Výsledky opakovaného stanovení* Pracoviště č. 1 + - Nestanov. + - Nestanov. + 12 2 0 + 12 2 0-1 156 4-1 161 0 Nestanov. 0 1 0 Nestanov. 0 0 0 Vzorků celkem: 176 176 Citlivost: 92,3 % 92,3 % Specifičnost: 98,7 % 98,7 % Pracoviště č. 2 + - Nestanov. + - Nestanov. + 8 3 0 + 8 3 0-2 186 6-2 193 0 Nestanov. 0 0 1 Nestanov. 0 0 0 Vzorků celkem: 206 206 Citlivost: 80,0 % 80,0 % Specifičnost: 98,4 % 98,5 % Kombinované + - Nestanov. + - Nestanov. + 20 5 0 + 20 5 0-3 342 10-3 354 0 Nestanov. 0 1 1 Nestanov. 0 0 0 Vzorků celkem: 382 382 Citlivost: 87,0 % (66,4-97,2) 87,0 % (66,4-97,2) Specifičnost: 98,6 % (96,7-99,5) 98,6 % (96,6-99,5) Korelace: 95,0 % (92,3-97,0) 97,9 % (95,9-99,1) Čísla uvedená v závorkách jsou 95% intervaly spolehlivosti. *Tabulky s opakovaným stanovením zobrazují výsledky opakovaného testování vzorků, jež byly zpočátku nestanovitelné, pomocí EIA. Jak je patrné z tabulky 1, jsou-li výsledky obou pracovišť zkombinovány, existuje u metody přímého testování vzorků pro data opakovaných stanovení 97,9% korelace mezi stanovením ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) na mikrotitračních destičkách a stanovením cytotoxinů. U metody kultivačního vyšetření vzorků pomnožených v bujonu bylo 63 vzorků pozitivních (EIA+, CTA+, PCR+). Tři vzorky byly EIA-, CTA+, PCR-. Po opakovaném testování CTA bylo u 2 ze 3 vzorků zjištěno, že jsou skutečně negativní. Deset vzorků bylo EIA+, CTA-, PCR-. U všech nestanovitelných výsledků bylo opakovaným testováním zjištěno, že byly skutečně negativní. U 771 vzorků bylo oběma metodami zjištěno, že byly negativní(eia-, CTA-). Celkové charakteristiky počátečního a opakovaného stanovení pro ověření výsledků ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) na mikrotitračních destičkách jsou uvedeny v tabulce 2. Tabulka 2. Stanovení ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) na mikrotitračních destičkách ve srovnání se stanovením cytotoxinů u vzorků pomnožených v bujonu. Vzorky pomnožené v bujonu Počáteční výsledky Výsledky opakovaného stanovení* Pracoviště č. 1 + - Nestanov. + - Nestanov. + 12 1 0 + 12 1 0-0 160 3-0 163 0 Vzorků celkem: 176 176 Citlivost: 100 % 100 % Specifičnost: 99,4 % 99,4 % Pracoviště č. 2 + - Nestanov. + - Nestanov. + 9 0 0 + 9 0 0-1 192 4-1 196 0 Vzorků celkem: 206 206 Citlivost: 90,0 % 90,0 % Specifičnost: 100 % 100 % 4

Pracoviště č. 3 + - Nestanov. + - Nestanov. + 42 9 0 + 42 9 0-2** 410 0-0 412 0 Vzorků celkem: 463 463 Citlivost: 95,5 % 100 % Specifičnost: 97,9 % 97,9 % Kombinované + - Nestanov. + - Nestanov. + 63 10 0 + 63 10 0-3 762 7-1 771 0 Vzorků celkem: 845 845 Citlivost: 95,5 % (87,3-99,1) 98,4 % (91,6-100) Specifičnost: 98,7 % (97,6-99,4) 98,7 % (97,7-99,4) Korelace: 97,6 % (96,4-98,5) 98,7 % (97,7-99,3) Čísla uvedená v závorkách jsou 95% intervaly spolehlivosti. *Tabulky s opakovaným stanovením zobrazují výsledky opakovaného testování vzorků, jež byly zpočátku nestanovitelné, pomocí EIA. ** Prosím pozor: Na pracovišti č. 3 byly zpočátku zjištěny 2 CTA falešně pozitivní výsledky, které byly po opakovaném testování CTA negativní. Jak je patrné z tabulky 2, jsou-li výsledky ze všech pracovišť zkombinovány, existuje u kultivačního vyšetření vzorku pomnoženého v bujonu pro data opakovaných stanovení 98,7% korelace mezi stanovením ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) na mikrotitračních destičkách a stanovením cytotoxinů. Stanovením E. coli na mikrotitračních destičkách byly testovány různé sérotypy kmenů E. coli produkující shigatoxin (STEC) a bylo zjištěno, že jsou reaktivní, a to buď pomocí přímého testování stolice, nebo testováním vzorků pomnožených v bujonu. Dále je uveden seznam testovaných sérotypů, číslo vzorků se specifickým sérotypem a typ toxinu produkovaného jednotlivými kmeny tam, kde je znám. Tabulka 3. Počet různých sérotypů u kmenů E. coli produkujících shigatoxin izolovaných z pozitivních vzorků. Sérotyp Počet izolovaných kmenů Sérotypy Stx1 Stx2 Stx1&2 Stx2c Neznámý Celkem O8:H9 1 1 O26:H11 7 2 1 3 13 O30 1 1 O88:H5 1 1 O91 2 1 3 O103:H2 1 1 O111:NM 2 1 3 O118 2 2 O128 2 2 O145 1 1 2 O153:H2 1 1 2 O157:H7 7 9 2 18 O166 1 1 Celkový počet typů toxinů 19 16 10 2 3 50 Tabulka 4. Testy pozitivní na shigatoxin podle konzistence stolice Počet vzorků stolice Konzistence stolice Vodnatá Měkká Sliz Vodnatá/ Měkká/ Krvavá sliz sliz 119 134 41 17 50 30 Shiga Toxin + 8 5 5 0 2 7 Cytotoxin + 10 5 5 1 3 7 ANALYTICKÁ CITLIVOST destičkách detekuje Stx1 přibližně v množství 52 pg/ml a Stx2 v množství 126 pg/ml. REPRODUKOVATELNOST Variační koeficient (CV) mezi stanoveními, neboli mezi jednotlivými sériemi měření, testu ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) na mikrotitračních destičkách byl hodnocen výběrem jednoho negativního a tří pozitivních vzorků s různými naměřenými hodnotami optické hustoty. Každý vzorek byl testován ve 24 jamkách/sérii měření ve třech po sobě jdoucích sériích měření. Střední hodnota variačního koeficientu mezi stanoveními byla 8,69 %. Vzorek Střední hodnota O.D. Směrodatná odchylka CV % 1 0,065 0,0101 15,61 % 2 0,264 0,0176 6,67 % 3 0,675 0,0270 4,00 % 4 0,830 0,0703 8,48 % Variační koeficient (CV) v rámci jednoho stanovení, neboli v rámci jedné série měření, byl hodnocen testováním 24 jamek pro každý ze 4 vzorků. Střední hodnota variačního koeficientu v rámci jednoho stanovení byla 4,59 %. Vzorek Střední hodnota O.D. Směrodatná odchylka CV % 1 0,069 0,0055 8,01 % 2 0,274 0,0134 4,90 % 3 0,563 0,1490 2,65 % 4 1,226 0,0340 2,78 % ZKŘÍŽENÁ REAKTIVITA Při testování řady organismů mikroflory lidského tračníku stanovením ProSpecT Shiga Toxin E.coli (STEC) na mikrotitračních destičkách nebyla zjištěna zkřížená reaktivita. Testy byly provedeny naočkováním dále uvedených organismů do stolice pozitivní a negativní na shigatoxin. Bakterie byly naočkovány v koncentracích > 1 x 10 7 CFU/ml stolice. Stanovením ProSpecT též byly testovány patogenní kmeny E. coli, které neprodukují shigatoxin (EPEC, ETEC, EIEC) a bylo zjištěno, že jsou negativní. Campylobacter jejuni ATCC 29428 Citrobacter braakii ATCC 43162 Enterobacter cloacae ATCC 13047 Escherichia coli ATCC 33660 Escherichia coli, EIEC, ATCC 43893 (O124:NM) Escherichia coli, EPEC, ATCC 12014 (O55:NM) Escherichia coli, EPEC, ATCC 33780 (O111:NM) Escherichia coli, ETEC/EPEC, ATCC 43887 (O111:NM) Escherichia coli, VT negativní, ATCC 25922 Enterococcus faecalis ATCC 49149 Klebsiella pneumoniae ATCC 27736 Proteus vulgarus, ATCC 33420 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Salmonella typhimurium, SA972229 Serratia liquefacians ATCC 27592 Shigella dysenteriae ATCC 49347 Shigella flexneri ATCC 25929 Shigella sonnei, ATCC 25931 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Yersinia enterocolitica ATCC 23715 14 SEZNAM LITERATURY 1. Johnson, W.M., H. Lior, and G.S. Bezanson, 1983. Cytotoxic Escherichia coli O157:H7 Associated with Haemorrhagic Colitis in Canada. Lancet pp. 76. 2. Karmali, M.A., B.T. Steele, M. Petric, and C. Lim, 1983. Sporadic Cases of Haemolytic Uraemic Syndrome Associated with Faecal Cytotoxin and Cytotoxin-Producing Escherichia coli. Lancet pp.619-620. 3. Karmali, M.A., M. Petric, C. Lim, P.C. Fleming, G.S. Arbus, and H. Lior, 1985. The Association Between Haemolytic Uraemic Syndrome and Infection by Verotoxin-Producing Escherichia coli. J. Infect. Dis. 151(5): 775-782. 4. Karmali, M.B., 1987. Laboratory Diagnosis of Verotoxin-Producing Escherichia coli Infections. Clin. Microbiol. Newsletter. 9(9): 65-70. 5. Kleanthous, H., H.R. Smith, S. M. Scotland, R.J. Gross, B. Rowe, C. M. Taylor, and D.V. Milford. 1990. Haemolytic uraemic syndrome in the British Isles, 1985-8: association with Verocytotoxin producing Escherichia coli. Part 2. Microbiological aspects. Am. J. Dis. Child. 65:722-727. 5

6. Konowalchuk, J., I. Speirs, and S. Stavric. 1977. Vero Response to a Cytotoxin of Escherichia coli. Infect. Immun. 18(3): 775-779. 7. Konowalchuk, J., N. Dickie, S. Stavric, and J.I. Speirs. 1978, Properties of an Escherichia coli Cytotoxin. Infect. Immun. 20: 575-577. 8. Konowalchuk, J., N. Dickie, S. Stavric, and J.I. Speirs, 1978. Comparative Studies of Five Heat-labile Toxic Products of Escherichia coli. Infect. Immun. 22:644-648. 9. O Brien, A.D., G.D. LaVeck, M.R. Thompson, and S.B. Formal, 1982. Production of Shigella dysenteriae type 1-like Cytotoxin by Escherichia coli. J. Infect. Dis. 144(6):763-769. 10. O Brien, A.D., T.A. Lively, M.E. Chen, S.W. Rothman, and S.B. Formal, 1983. Escherichia coli O157:H7 Strains Associated with Haemorrhagic Colitis in the United States Produce a Shigella dysenteriae I (Shiga)-like Cytotoxin. Lancet pp.702. 11. O Brien, A.D. and R.K. Holmes. 1987. Shiga and Shiga-like Toxins. Microbiol. Rev. 51(2): 206-220. 12. Pai, C.H., R. Gordon, H.Y. Sims, and L.E. Bryan, 1984. Sporadic Cases of Haemorrhagic Colitis Associated with Escherichia coli O157:H7. Ann. Intern. Med. 101: 738-742. 13. Pai, C. H., N. Ahmed, H. Lior, W.M, Johnson, H.V. Sims, and D.E. Woods, 1988. Epidemiology of Sporadic Diarrhea Due to Verocytotoxin-Producing Escherichia coli; A Two-year Prospective Study. J. Infect. Dis. 157(5):1054-1057. 14. Riley, L.W., R.S. Remis, S.D. Helgerson, H.B. McGee, J.G. Wells, B.R. Davis, R.J. Hebert, E.S. Olcott, L.M. Johnson, N.T. Hargrett, P.A. Blake, and M.L. Cohen, 1983. Haemorrhagic Colitis Associated with a Rare Escherichia coli Serotype. N. Engl. J. Med. 308(12): 681-685. 15. Scotland, S.M., H.R. Smith, and B. Rowe, 1985. Two Distinct Toxins Active on Vero Cells from Escherichia coli O157. Lancet. pp.885-886. 16. Strockbine, N., L. Marques, J. Newland, H. Williams Smith, R.K. Holmes, and A.D. O Brien, 1986. Two Toxin-Producing Phages from Escherichia coli O157:H7 Strain 933 Encode Antigenically Distinct Toxins with Similar Biologic Activities. Infect. Immun. 53(1):135-140. 17. Karch, H., et al., 1996. Isolation of Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157 Strains from Patients with Haemolytic-Uraemic Syndrome by Using Immunomagnetic Separation, DNA-Based Methods, and Direct Culture. JCM, March 1996, 34(3):516-519. ProSpecT TM je registrovaná ochranná známka. ATCC je registrovaná ochranná známka organizace American Type Culture Collection. Oxoid Ltd Wade Road Basingstoke Hants, RG24 8PW UK Máte-li zájem o technickou asistenci, obraťte se laskavě na místního distributora. IFU X7594, revize provedena 27. října 2008. Vytištěno ve Velké Británii. 6