MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Katedra antropologie Určování krevních skupin u historického kosterního materiálu Bakalářská práce Klára Parmová Vedoucí práce: doc. RNDr. Eva Drozdová, Ph. D. Brno 2007 1
Prohlašuji, že jsem tuto bakalářskou práci vypracovala samostatně a s použitím literatury uvedené v seznamu literatury. V Brně, dne 15.5.2007 2
Děkuji doc. RNDr. Evě Drozdové, Ph. D. za vedení této bakalářské práce. Dále bych chtěla poděkovat paní Mgr. Janě Benešové z Oddělení fyziologie a imunologie živočichů Masarykovy univerzity za její ochotu a cenné konzultace. V neposlední řadě patří můj dík také Bc. Janě Kamarýtové za praktické ukázky laboratorních metod. 3
Obsah Abstrakt...6 Klíčová slova...6 1. Úvod... 7 2. Metody práce... 8 3. Krevní skupiny u člověka...9 3.1. Krevní systém AB0... 9 3.1.1. Podskupiny systému AB0...11 3.1.2. Imunohematologie... 12 3.1.3. Fenomén vylučovatelství...12 3.1.4. Genetika systému AB0...14 3.1.5. Fenotyp Bombay... 16 3.2. Krevní systém Rh... 17 3.3. Fetální erytroblastóza... 18 3.4. Další krevní systémy... 21 4. Antropologie krevních skupin... 24 4.1. Počátky séroantropologie...24 4.1.1. Hardyho Weinbergova rovnice... 24 4.1.2. Biochemický index...25 4.2. Séroantropologie v Československu...25 4.2.1. Vojtěch Suk a jeho dílo... 26 4.3. Geografické rozložení krevních skupin ve světě...27 4.3.1. Systém AB0 ve světě... 28 4.3.1.1. Krevní skupina 0... 28 4.3.1.2. Krevní skupina A... 29 4.3.1.3. Krevní skupina B... 30 4.3.2. Systém AB0 v České republice... 31 4.3.3. Systém Rh ve světě...31 4.3.4. Evoluce krevních skupin... 32 5. Určování krevního systému AB0 u historického kosterního materiálu... 33 5.1. Molekulárně genetické vyšetření krevních skupin...33 5.1.1. Molekulární genetika systému AB0... 33 5.1.2. Metoda PCR ( polymerase chain reaction )...35 5.2. Serologické vyšetření krevních skupin...36 5.2.1. Historie výzkumů...37 5.2.2. Biologický materiál... 40 5.2.2.1. Kosti...40 5.2.2.1.1. Původ kosterního materiálu...40 5.2.2.1.2. Příprava kostí... 40 4
5.2.2.1.3. Výběr kostí k analýze... 41 5.2.2.2. Anti H sérum...42 5.2.3. Metody...43 5.2.3.1. Metoda absorpčně inhibiční (AI)...43 5.2.3.1.1. Fáze extrakce...44 5.2.3.1.2. Fáze koncentrace...44 5.2.3.1.3. Fáze aglutinačně inhibiční... 44 5.2.3.2. Metoda absorpčně eluční (AE)...46 5.2.3.2.1. Přípravná fáze... 46 5.2.3.2.2. Absorpční fáze...46 5.2.3.2.3. Eluční fáze...47 5.2.3.2.4. Aglutinace... 47 5.2.3.3. Dvourozměrný absorpčně inhibiční test (2DAI)... 47 5.2.3.4. Metoda dvoukruhového systému ve dvou fázích...48 5.2.3.5. Metoda fluorescenčního značení antigenů... 48 ( Fluoreszenz Antikörper Methode ) 5.2.4. Narušení stálosti krevních vlastností... 50 5.2.4.1. Kontaminace mikroorganismy... 51 5.2.4.2. Kontaminace rostlinnými a živočišnými zbytky...56 5.2.5. Výsledky a diskuze...58 6. Závěr...74 Slovník důležitých pojmů...76 Seznam použité literatury...83 Rejstřík... 88 O autorce... 90 5
Abstrakt Krevní skupiny jsou vlastnosti organismu, které jsou spolehlivě zjistitelné již několik měsíců po narození a za života se již nemění. Nemá na ně vliv ani okolní prostředí. Už jen z tohoto hlediska jsou vhodným identifikačním faktorem. Znalosti krevních skupin hojně využívají mnohá profesní odvětví. První místo zaujímá bezpochyby medicína, pro kterou je zásadní zvláště převod krve a transplantace orgánů. Určení krevní skupiny je dále významné v kriminalistice, soudním lékařství a také v antropologii. Z tohoto hlediska je identifikace jedince možná na základě antigenů přítomných na buněčných membránách. Krevní skupiny lze vyšetřit sérologicky nebo pomocí metody analýzy DNA. Dnešní doba umožňuje určit krevní skupinu nejen z krve, ale také z lidských sekretů a tkání, včetně tkáně kostní. Určení krevní skupiny z kosterního materiálu je významné v paleosérologii a séroantropologii pro objasnění původu lidstva a vymezení příbuzenských vztahů jedinců. Metody vypracované pro kostní tkáň mají také své uplatnění ve forenzní antropologii. Klíčová slova Krevní skupiny Séroantropologie Geografické rozšíření krevních skupin DNA analýza Sérologické metody Paleosérologie 6
1. Ú v o d Krev byla lidmi odpradávna vnímána jako symbol života i smrti. Krev je obecně nositelem důležitých informací z pohledu medicíny, genetiky a biologických věd. Z krevních vzorků lze vyšetřit mnohá onemocnění, genetickou výbavu i další zajímavé informace vedoucí k identifikaci jedince. Zařazení krve do jednotlivých skupin bylo ustanoveno počátkem 20. století. Autorem výzkumu byl vídeňský lékař Karl Landsteiner a nezávisle na něm Jan Janský. Tyto poznatky vyvolaly ve světě medicíny nepředstavitelný objev. Od té doby vědci objevili více než 50 krevních systémů. Za základní systém je považován krevní systém AB0, který má své největší uplatnění zvláště při transfúzích krve. Je též nejdéle známý a nejvíce probádaný. Později se o téma krevních skupin začali zajímat i antropologové a soudní znalci. Vznikla věda nazývaná séroantropologie a jejím objektem zkoumání bylo rozšíření krevních skupin ve světě a podrobný rozbor izolovaných skupin lidí v souvislosti s původem obyvatelstva i jeho migrací. Krevní skupiny jsou také důležitým identifikačním faktorem. Velký přínos mají jednak v kriminalistice při určování totožnosti pachatele, v soudním lékařství při paternitních sporech, ale i přírodních vědách. Dnes se dají běžně vyšetřit krevní skupiny nejen z čerstvé krve, ale i krve tepelně degradované, z lidských tkání, slin a sekretů. Méně probádané a taktéž náročné je vyšetření skupinových vlastností krve z kostní tkáně. Zde samozřejmě závisí úspěšnost metody na podmínkách prostředí a zachovalosti materiálu. Vědci ale musí čelit dalším překážkám jako jsou mnohé nespecifické reakce a nestabilita skupinových vlastností způsobená okolním prostředím. V návaznosti na toto téma se hovoří o paleosérologii, tedy vědě zabývající se krevními vlastnostmi jedinců i celých populací v pravěkých dobách. Informace o krevních skupinách hojně využívá i historická antropologie, kde jsou často předmětem zkoumání vzájemné příbuzenské vztahy jednotlivců. Pro určení krevní skupiny z kosterního materiálu se užívá metod sérologických i molekulárně genetických. V dnešní době jsou metody sérologické neprávem potlačovány metodami využívající analýzy DNA. V tomto směru, metody zkoumající DNA výbavu jedince jsou velice přesné, avšak také časově náročné a finančně nákladné. Bylo ale prokázáno, že v některých případech je sérologický postup úspěšnější. 7
Pro kostní tkáň bylo dosud navrhnuto relativně málo účinných metod, které by vedly k neomylnému výsledku s možností jeho opakování. Ačkoli historie prací na toto téma sahá do 30. let minulého století, dalo by se říci, že celý výzkum je teprve na svém počátku. Cílem této bakalářské práce je přehledně shrnout a následně i vyhodnotit jednotlivé sérologické metody, pomocí nichž lze z kostní tkáně vyšetřit krevní skupinu jedince. Dále také analyzovat jednotlivé problémy a překážky vzniklé při samotném výzkumu a způsob, jak jim předcházet. Praktickou částí na toto téma bych mohla navázat v pozdější magisterské práci. 2. M e t o d y p r á c e Jedná se o literární rešerši na dané téma, praktická část je tedy vynechána. Metody mé práce zahrnovaly studium příslušné literatury a sběr časopiseckých článků, které se vztahují k tématu. Odborné články pocházejí z domácích i zahraničních časopisů, některé z nich byly součástí knižních publikací. K sepsání práce jsem využila také internetových zdrojů, čerpala jsem především z internetových vědeckým portálů jakými jsou Science Direct a Web of Science. Dále jsem pracovala s internetovými stránkami, které jsou uvedené v seznamu použité literatury. Většina citovaných článků pochází z následujících časopisů: American Journal of Physical Anthropology, Journal of Human Evolution a Forensic Sciences. Časopisecké články jsem získala ze zdrojů jednotlivých vědeckých ústavů ČR a knihoven. K získání článků zahraničních jsem využila meziknihovní služby Lékařské fakulty a MZK. K jazykovým překladům jsem použila anglický elektronický slovník StarDict a mnohojazyčný elektronický slovník Winged. S laboratorními metodami jsem se prakticky seznámila v laboratoři fyziologie a imunologie živočichů Masarykovy univerzity pod vedením Mgr. Jany Benešové. 8
3. K r e v n í s k u p i n y u č l o v ě k a Krevní skupiny jsou fenotypové vlastnosti organismu. Fetter a kol. (1967) je označuje za nejstálejší z fyziologických vlastností, jsou také základem pro dělení lidstva dle krevních skupin. Na světě je nyní známo přes 50 krevních systémů (s nejméně 500 aktivními antigeny), v rámci kterých existují různá značení pro vlastní krevní skupiny. Většina skupinových krevních systémů byla objevena náhodně při reakcích na uměle vytvořená antiséra. Mezi nejčastěji vyšetřované krevní systémy patří AB0, Rh, MNSs, P, Duffy, Levis a Kidd, avšak pro praxi jsou důležité pouze první dva uvedené systémy. Ostatní krevní systémy (viz kapitola 3.4. Další krevní systémy ) využívají mnohé obory pro specializované vědecké výzkumy. Krevní systémy jsou na sobě nezávislé a vyskytují se na odlišném lokusu chromozomu (Vácha a kol. 2004). Z hlediska variability lidstva jsou krevní skupiny polymorfní znaky s diskontinuální proměnlivostí. Objevují se tedy v populacích ve dvou a více formách, přičemž mají vymezený počet variant (Beneš 1979). Všechny buňky lidského těla mají na svém povrchu několik desítek antigenů. Vyšetření těchto antigenů je významné při transplantacích a krevních transfúzích. Pokud spolu nesouhlasí antigenní struktury dárce a příjemce, dochází potom k imunitní neboli antigenní reakci. Ta vede k tvorbě protilátek proti cizímu antigenu, což může vyvolat poškození organismu anebo smrt. V klinické praxi patří antigeny na membránách červených krvinek k nejčastěji vyšetřovaným (Vácha a kol. 2004; Trojan a kol. 2003). 3.1. K r e v n í s y s t é m A B 0 Krevní systém AB0 byl poprvé objeven v roce 1900 Landsteinerem, kdy pozoroval aglutinaci erytrocytů, jež vyvolalo sérum pocházející od odlišného jedince. Landsteiner svůj objev uveřejnil v roce 1901 a popsal tak 3 možné krevní skupiny u člověka. V roce 1902 jeho žáci, Decastello a Sturli, popsali i skupinu v pořadí čtvrtou (Race, Sanger 1954). Nezávisle na nich zkoumal krevní vlastnosti lékař Janský, který v roce 1907 sám pojmenoval 4 krevní skupiny. Dnešní označení krevních skupin vychází z návrhu Dungerna a Hirszfelda z roku 1927 (Fetter a kol. 1967) (viz Tab. 1). 9
Obr. 1, 2 K. Landsteiner (vlevo). Zdroj: www.oeaz.at (14) a J. Janský (vpravo). Zdroj: www.ceskatelevize.cz (12).. Dungern Hirszfeld Landsteiner Janský Moss 0 1 I IV A 2 II II B 3 III III IV I AB Tab. 1 Označení krevních skupin systému AB0 různými autory. Zdroj: Martin, Saller 1960. Převzato v plném znění. V krevním systému AB0(H) rozlišujeme 4 krevní skupiny A, B, AB a 0 (H). Typ krevní skupiny je dán na základě přítomnosti aglutinogenu A a B na povrchu membrány erytrocytů (viz Tab. 2). Látky aglutinogeny jsou chemicky sacharidové povahy. V séru jsou obsaženy protilátky aglutininy anti A a anti B. Aglutininy jsou bílkovinné struktury. Jsou to přirozené protilátky (imunoglobuliny IgM) a jsou spolu s aglutinogeny geneticky podmíněny. Přičemž platí známé Landsteinerovo pravidlo, že v krevní plazmě nejsou antigeny proti vlastním aglutinogenům. Tedy krevní skupina A nese aglutinogen A a vždy pouze aglutinin anti B (Trojan a kol. 2003). 10
Krevní skupina Aglutinogen A Aglutinogen B AB0 systému Aglutinin A Aglutinin B A ano ne ne ano B ne ano ano ne 0 ne ne ano ano AB ano ano ne ne Tab. 2 Antigeny krevního systému AB0. Zdroj: http://anthro.palomar.edu/blood/default.htm (3). Přepracováno. Jak uvádí Vácha a kol. (2004) aglutininy se vyskytují přirozeně a je možné je vyšetřit již pár měsíců po narození. Jejich tvorba je podpořena bakteriemi ve střevech a složkami potravy. Trojan a kol. (2003) dodává, že maximum titru antigenů je dosaženo kolem devátého roku věku dítěte, k poklesu titru dojde poté ve stáří. Přičemž antigenní schopnosti se zvyšují až asi do 20 let věku. V této době je erytrocyt téměř 5 krát citlivější na specifický aglutinin než při narození. Jinak je to u vrozených aglutininů. Ačkoli aglutinogen je možno určit u každého novorozence, aglutinin jen asi u poloviny narozených dětí. Ostatní nemají při narození v séru přítomné žádné aglutininy, ty se vytvoří do 5 až 10 let věku dítěte (Malaska 1957). 3.1.1. P o d s k u p i n y s y s t é m u A B 0 V rámci krevního systému AB0 rozlišujeme ještě několik možných podskupin. Jako první v roce 1911 objevili Dungern a Hirszfeld podskupinu A1 a A2, také i A1B a A2B. Dále byly popsány i další formy, od A1 až po A6 (Race, Sanger 1954). Podskupiny se vzájemně liší především tím, že jejich krvinky mají různou rychlost a sílu shlukování aglutininem anti A (alfa). Krvinky s aglutinogenem A1 jsou nejvíce shlukovatelné, naproti tomu krvinky A5 nejméně (Malaska 1957). Podobné vlastnosti má i skupina B. Toto způsobuje nízká aktivita enzymu transferázy, která pojí monosacharidy k prekurzorové molekule antigenu H za vzniku příslušné krevní skupiny. Beneš (1979) uvádí ještě další popsané alely Am, Ax, Bm a Bx. Všechny alely jsou součástí mnohočetných alelických sérií dvou genů. Tyto geny leží na dvou souhlasných lokusech párů chromozomů, zde dochází k jednotlivému střídání alel. 11
Podskupina A1 je v evropské populaci zastoupena asi 80%, zatímco A2 necelými 20%. Ostatní jsou dosti vzácné. Spolu s antigeny se samozřejmě rozlišují i protilátky anti A1, anti A2 atd. (Trojan a kol. 2003; Schreiber a kol. 1998). 3.1.2. I m u n o h e m a t o l o g i e Imunohematologie je obor studující příčiny, průběh a následky obranných reakcí organismu vyvolaných krevními antigeny a protilátkami. Studuje také problematiku krevních transfúzí a imunitní reakce při krevních chorobách (Bičík 1992). Isohemaglutininy jsou látky mající schopnost shlukovat krvinky daných skupin. Dělíme je na pravidelné a nepravidelné isohemaglutininy (viz Tab. 3). Pravidelné jsou vždy přítomny v séru dané skupiny (např. aglutinin alfa, alfa1 v sérech krevních skupin B a 0). Alfa1 shlukuje pouze krvinky A1 a A1B. Zatímco všechny krvinky A a AB jsou shlukovány aglutininem alfa. Nepravidelné isohemaglutininy, jak název napovídá, se v sérech vyskytují nepravidelně (např. aglutinin alfa1 v sérech krevních skupin A2 a A2B). Tyto dva aglutininy alfa1 (pravidelný a nepravidelný) se od sebe liší chováním za různých teplot (Malaska 1957). Protilátky (imunoglobuliny) jsou specifické bílkoviny obsažené v krevní plazmě. Rozeznáváme protilátky přirozené (vrozené) a získané (imunní). Přirozené protilátky jsou přítomny v organismu hned po narození anebo se vytvářejí do jednoho roku věku dítěte, poté jsou už v séru přítomny po celý život. Jsou to aglutininy anti A a anti B, které se vyskytují u jedinců skupiny A, B a 0. Dále jsem patří také anti A1 a anti 0, ale i další protilátky přirozeně (někdy) se vyskytující u dalších krevních systémů. Více reagují při teplotách nižších než je teplota těla. Naproti tomu získané protilátky se vytvářejí na podnět cizího krevního antigenu imunizací. Ty mohou být buď charakteru aglutininu (shlukují krvinky ve fyziologickém roztoku) anebo nekompletních protilátek, které aglutinují krvinky pouze v prostředí bílkovinném. Tyto reagují nejsilněji při teplotě těla (Bičík 1992; Malaska 1957). 12
Skupina Aglutininy vyskytující Vazba s aglutininy Možné iregulární aglutininy a podskupina se v séru normálně 0 anti 0 (alfa2) anti A (alfa a alfa1) anti B (beta) žádné velmi vzácně anti 0 (alfa2), reaguje se všemi krvinkami 0 a s 95% krvinek A2 A1 alfa1 a alfa anti B (beta) A2 alfa, alfa2 (vždy) anti 0 (v 95% případů) anti B (beta) vzácně alfa1, reagující s krvinkami A1 a A1B A1B alfa1, alfa a beta žádné velmi vzácně anti 0 (alfa2) A2B alfa, alfa2 a beta je sporné, zda s anti 0 žádné často (25%) alfa2, reagující s krvinkami A1 a A1B B beta anti A (alfa a alfa1) velmi vzácně s anti 0 (alfa2) Tab. 3 Přehled výskytu iregulárních aglutininů. Zdroj: Malaska (1957). Převzato v plném znění. 3.1.3. F e n o m é n v y l u č o v a t e l s t v í Další významný objev související s krevními vlastnostmi je datován do roku 1925. Jedná se o fenomén vylučovatelství, který má své uplatnění zvláště v kriminalistice. Na tomto základě se lidé (na celém světě) dělí do dvou pomyslných skupin na tzv. sekretory (vylučovatelé) a non sekretory (nevylučovatelé) (1). Sekretorů je v populaci kolem 80%. U těchto osob jsou antigeny A, B, H přítomné nejen v krvi (na erytrocytech, v malém množství i na leukocytech a trombocytech), ale kromě toho jsou také vylučovány do ostatních tělních tekutin, jako jsou slzy, moč, sliny, sperma, mateřské mléko, pankreatické a žaludeční šťávy atd. Přičemž všichni sekretoři vylučují antigen H a mimo to také antigen A nebo B, dle své skupinové příslušnosti. Z toho vyplývá, že sekretor skupiny AB vylučuje antigen H, A i B, zatímco u skupiny 0 sekretora, je to pouze antigen H, který je vylučován (Hrubiško a kol. 1983). Zbylých 20% lidí tuto vlastnost postrádá. Nonsekretoři mají specifické skupinové látky pouze v buňkách. Ty jsou na rozdíl od sekretorů nerozpustné ve vodě (v lipoidní formě) (Malaska 1957). 13
Antigeny lze vyšetřit i ze zaschlých vzorků tekutin. Jsou odolné i vůči vysokým a nízkým teplotám (Bičík 1992). Sekrece těchto A, B a H substancí je podmíněna alelami Se a se. Vylučovatelé mají genotyp SeSe anebo Sese, nevylučovatelé sese. S tímto je spojen i skupinový systém Lewis. Vylučovatelé jsou Lea, Leb +, Leb, zatímco nevylučovatelé mají Lea+, Lea, Leb (Hrubiško 1983). Systém sekretorů je hojně využíván při vyšetřování trestných činů, pokud nejsou k dispozici krevní stopy pachatele. U sekretorů lze v tělních tekutinách najít nejen specifické typy antigenů, ale i bílkoviny, protilátky a enzymy, které jsou pro krev charakteristické (Bičík 1992). 3.1.4. G e n e t i k a s y s t é m u A B 0 Dědičnost krevních skupin je dokonalý příklad dědičnosti lidských znaků. Krevní skupina je znak se 100% dědivostí (heritabilitou); životní prostředí na ni nemá žádný vliv (Rosypal a kol. 2003). Krevní skupiny systému AB0 se řídí dle Mendlových zákonů dědičnosti. Většina lidských genů jsou geny polymorfní. Obsahují tedy více než 2 alely. Typický lidský gen kóduje enzym, který připojuje molekuly sacharidu k molekulám lipidu na povrch červených krvinek. Tento sacharid je poté rozeznán imunitním systémem organismu. Je to právě antigen aglutinogen přítomný na membráně erytrocytů. Gen kóduje enzym, který označujeme písmenem I. Gen I obsahuje 3 možné alely; alelu IA (připojuje modifikovanou formu cukru galaktosamin), alelu IB (připojuje disacharid galaktózu) a alelu I0, která k sobě nepojí žádný sacharid (Raven, Johnson 1992). Alely příslušného genu mohou být z pohledu expresivity genu dominantní, kodominantní anebo recesivní. U systému AB0 platí, že alela A a alela B jsou dominantní nad alelou 0 (ta je tedy vzhledem k nim recesivní). Avšak alela A a B jsou navzájem kodominantní, každá působí vlastním efektem na organismus. Krevní skupina AB tudíž produkuje 2 formy enzymu a pojí galaktózu i galaktosamin na povrch krevních buněk (Vácha a kol. 2004; Raven, Johnson 1992) 14
Každý jedinec zdědí od každého z rodičů po jedné kopii chromozomu nesoucí gen I, příslušný genotyp vzniká právě kombinací těchto genů. Jedinec může být pro tento znak heterozygotní anebo homozygotní (viz Tab. 4, 5). Jak dodává Hruban a Majzlík (2000), při určování biologického rodičovství se vždy vychází z vyloučení otce. Při krevním testu systému AB0 dosáhneme pouze 20% vyloučení, pokud použijeme i jiných 10 znaků (další krevní systémy, krevní bílkoviny) úspěšnost stoupne až na 85%. Nejpřesnější je v tomto ohledu vyšetření DNA genotypu jedince. Toto vyšetření se v ČR provádí od roku 1992. Matka Otec Fenotyp Genotyp A1 A1 A1 A1 A2 A1 0 Fenotyp Dítě Genotyp Genotyp Fenotyp A1 A1 A1 A1 A2 A1 0 A1 A1 A1 A2, A2 A2 A1 0, 0 0 A1 A2 0 A2 A2 A2 A2 0 A1 A1 A1 A1 A2 A1 0 A1 A2 A1 0, A2 A2 0 0, A2 0 A1 A2 0 A2 A2 A2 A2 0 A2 A2 A2 A2 0 A1 A2 A2 0, 0 0 A2 0 A1 B A2 B, A1 0 A2 0 B 0, 0 0 A1 B A2 B A1 A2 B, 0 BB B0 B B BB B0 B BB B0 A1 B A1 B A1 A1 A1 A2 A1 0 A1 A2 A2 A2 A2 0 A2 B A2 0 B 0, 0 0 B BB B0 BB B 0, 0 0 A1 A1 A1 A1 A2 A1 0 A1 A1, A1 B A1, A1 B A1 A2, A2 A2 B B B A1 0, B 0 Tab. 4 Příklady pro dědičnost krevních skupin systému AB0. Zdroj: Malaska (1957). Převzato v plném znění. 15 A2 B A2 B, 0 B0
Rodičovské A B 0 A AA (A) AB (AB) A0 (A) B AB (AB) BB (B) B0 (B) 0 A0 (A) B0 (B) 00 (0) alely Tab. 5 Genotypy a fenotypy potomstva. Zdroj: http://anthro.palomar.edu/blood/default.htm. Přepracováno. Jako fenotyp označujeme z genetického hlediska krevní skupinu, kterou zjišťujeme aglutinačním testem. Vzájemná kombinace genů vytváří v populaci 4 fenotypové skupiny (Fetter a kol. 1967). Krevní skupina 0 se označuje jako univerzální dárce. Nemá na povrchu žádný cizí antigen, proti kterému by se mohl bránit imunitní systém příjemce. Naproti tomu skupina AB je univerzální příjemce. Buňky na membráně u této skupiny obsahují antigen A a antigen B, tedy obě možné varianty, a proto pro ni není žádný antigen cizí. Krevní skupiny nikterak nesouvisejí s vlastnostmi lidí, a to jak fyzickými, tak duševními. V dnešní době jsou také studovány možné souvislosti krevní skupiny s onemocněním pacienta. Uvádí se, že jedinci skupiny A trpí častěji rakovinou žaludku. Příslušníci skupiny 0 mají zase častější výskyt vředů v oblasti břišní (Bičík 1992). 3.1.5. F e n o t y p B o m b a y Fenomén (fenotyp) Bombay byl poprvé popsán v Indii a dle místa výskytu byl také pojmenován. Jedná se o genetickou zvláštnost spojenou s krevními skupinami. U jedinců takto zatížených se odlišuje jejich fenotyp od genotypu. V tomto případě jsou narušena základní pravidla dědičnosti krevních skupin, antigen H přítomný na povrchu červených krvinek může zabránit projevu očekávané krevní skupiny. Mluvíme o recesivní epistázi alely H. 16
Tvorba antigenu H je dána geneticky. Pokud dojde ke vzácnému jevu, kdy jedinec je recesivní homozygot (hh), pak se nevytváří ani antigen H. Ten je však prekurzorem pro tvorbu antigenu A i B, pro jejich tvorbu je nepostradatelný. Alela A nebo B musí být přítomna, aby se vytvářel příslušný enzym (A nebo B) a přeměnil H antigen na A, popřípadě na B antigen. Výsledkem je zdánlivý fenotyp 0, avšak jedinec může nést geny pro tvorbu některého z antigenů A nebo B; genotyp mu neodpovídá (3, 4). Z Obr. 3 je patrné, že dítě po obou rodičích zdědilo recesivní alelu pro antigen H, tedy hh. Fenotypově se tedy jeví jako 0, avšak rodiče alelu pro 0 postrádají. Matka Předpokládaný otec Matka Dítě Předpokládaný otec Dítě Obr. 3 Fenotypový a genotypový projev fenoménu Bombay. Zdroj: http://anthro.palomar.edu/blood/default.htm. Přepracováno. 3.2. K r e v n í s y s t é m R h Objev skupinového systém Rh je připisován Landsteinerovi spolu s Wienerem v roce 1940, ačkoli k tomuto objevu významně přispěli i jiní badatelé jako například Levine a Sterson. Ti upozorňovali ve své práci na neobvyklé případy aglutinace u jedinců stejné skupiny již v roce 1939. Byl to bezesporu významný zlom v oboru sérologie a medicíny od dob objevení krevního systému AB0 před 40 lety (Race, Sanger 1954). Zvláštní okolnosti porodů a transfúzí byly jednoznačně vysvětleny právě pokusem Landsteinera a Wienera, kdy imunizovali králíky a morčata krví opice makaka (Macaca mulatta). Jejich záměr byl však studovat imunní protilátky anti M a anti N. Takto byl tedy náhodou objeven další antigen přítomný taktéž na povrchu krevních buněk (společný pro člověka a makaka, ale i jiné druhy opic). 17
U asi 85% lidí docházelo ke shlukování červených krvinek imunizovaným sérem. Tato skupina je označena jako Rh pozitivní, v jejich krvi je obsažen Rh faktor. Naproti tomu lidé, kteří jsou Rh negativní (okolo 15%) tento faktor postrádají a k aglutinaci nedochází (Vácha a kol. 2004). R. A. Fisher později objasnil podstatu 3 základních antigenů, které přiřazují člověku právě jeden z typů krevní skupiny Rh. Jsou to antigeny C, D a E a jejich alelomorfní varianty c, d, e. Chromozom nemůže nést geny pro obě varianty, tedy například pouze C anebo malé c. Jedinec dědí jednu alelu od matky a jednu od otce. Dostáváme pak různé genotypy vzniklé kombinací příslušných alel (Race, Sanger 1954). Rozhodující v této věci je alela D. Pokud je v genotypu přítomná jedinec je Rh pozitivní. Jak uvádí Fetter a kol (1967) existují i další formy alel. Vlastnost D může být ve formě D, Du anebo v krvi není (d). Stejně tak u vlastnosti C je možnost C, c, Cw, Cx, Cu, cv. Vlastnost E se také vyskytuje jako e, Eu a Ew. Dále se vyskytují další vlastnosti Rh systému označované jako F a V pokud jsou přítomny a jako f, v pokud chybí. Tímto teoreticky vzniká na 288 podskupin systému Rh. Některé se vyskytují častěji, u 98% evropské populace se objevuje pouze 8 podskupin. Imunoglobuliny anti D nejsou v plazmě Rh jedinců běžně přítomny. K této změně dochází druhotně až po imunizaci. Stává se tak během nevhodné transfúze krve Rh+ jedinci s fenotypem Rh. Takto byla objasněna potransfúzní reakce vyvolávající horečky a třesavky. Další případ imunizace je možný při těhotenství. Komplikace mohou nastat pouze v tom případě, kdy matka je Rh a její plod je Rh pozitivní po otci. Zde hrozí nebezpečí onemocnění, které se nazývá fetální erytroblastóza neboli hemolytická nemoc novorozenců (Vácha a kol. 2004). 3.3. F e t á l n í e r y t r o b l a s t ó z a Fetální erytroblastóza je těžká choroba, spojená s dalším vážným poškozením organismu dítěte (např. vodnatelností mozku). Tato komplikace byla v minulosti častější, dnes je podstata tohoto onemocnění dokonale známá a jsou zavedena preventivní opatření při takto rizikových těhotenstvích. 18
Jak uvádí Zahálková (2002), hlavní příčiny tohoto onemocnění tkví v krevní inkompatibilitě mezi matkou a dítětem. Nejčastější projev má v systému AB0. Zde je však průběh nemoci velmi mírný, prudké reakce spojené s tímto systémem jsou velmi vzácné. Zásadní nebezpečí je spojeno se systémem Rh v případě, kdy je matka Rh negativní a její plod Rh pozitivní po otci (viz Tab. 6, 7). Onemocnění se může projevit i v souvislosti s jiným krevním systémem, avšak těchto případů bylo ve světě zaznamenáno opravdu velmi málo. Možná komplikace tedy nastává, pokud si matka Rh (genotyp dd) vytváří protilátky proti krvinkám Rh pozitivnímu plodu (genotyp Dd anebo DD). Matčin imunitní systém tento antigen nerozezná, považuje jej za cizorodý a bojuje proti krvinkám plodu tvorbou protilátek. Za běžných okolností krevní oběh plodu a matky spolu přímo nesouvisí, krvinky plodu se tedy během těhotenství nedostávají do oběhu matky a naopak. Ani v krvi matky nejsou protilátky normálně přítomny (3). OTEC D M d Dd A T Dd K d A Děti 100% Rh+ D Dd Dd Tab. 6 Genotypový projev krevního systému Rh u potomstva a výsledný fenotyp. Zdroj:http://anthro.palomar.edu/blood/default.htm (3). Přepracováno. 19
OTEC D d M d Dd A T Dd K d A Děti 50% Rh+ dd dd Tab. 7 Genotypový projev krevního systému Rh u potomstva a výsledný fenotyp. Zdroj: http://anthro.palomar.edu/blood/default.htm (3). Přepracováno. Může však dojít ke kontaktu a mísení krve během porodu při odlučování placenty anebo při patologických stavech. V tomto případě matčin imunitní systém podněcuje růst protilátek. Již velmi malé množství krve novorozence vyvolává bouřlivou reakci a tvorbu velkého množství protilátek na straně matky. Tento stav je nebezpečný zvláště při dalším těhotenství, protože tyto protilátky setrvávají v krvi matky a procházejí placentou k plodu. To může ohrozit život Rh pozitivního plodu, jehož erytrocyty jsou protilátkami shlukovány a rozrušovány (hemolýza). Výsledkem je životu nebezpečná anémie, krev plodu totiž postrádá dostatek kyslíku (3). V tomto případě následuje neodkladná transfúze krve Rh+ dítěti. Již během těhotenství může nastat situace, kdy dojde k shlukování krvinek v některých cévách plodu. Hrozí nebezpečí ucpání cév a odumření plodu. Transfúzi je možno provést i nitroděložně, za účelem odstranění odumřelých krvinek a množství bilirubinu (Vácha a kol. 2004). Nebezpečí porušení krvinek plodu se zvyšuje s dalším těhotenstvím. Jak uvádí internetový zdroj (3), evropská populace je k tomuto onemocnění nejnáchylnější, kolem 13% novorozenců je vystaveno tomuto riziku. Avšak v dnešní době asi 6% (polovina z těchto dětí) má určité komplikace. Díky monitorování a včasné léčbě dnes onemocní těžkou žloutenkou méně než 1% jedinců. 20
Vácha a kol (2004) uvádí, že tvorba anti D protilátek je velmi individuální a u velkého počtu těhotenství k fetální erytroblastóze nedochází. Preventivní opatření slouží podávání imunoglobulinu s anti D protilátkami ohroženým ženám do 72 hodin po porodu dítěte (i potratu). Uvádí se, že tato prevence je efektivní v 99% případů. Tímto se předejde imunizaci matky. Krvinky, které stačily proniknout do matčina oběhu jsou navázány na anti D protilátky a následně pohlceny makrofágy. 3. 4. D a l š í k r e v n í s y s t é m y Jsou známy mnohé další krevní systémy u člověka. Užití mají zvláště v aplikovaných vědách, při transfúzi krve nehrají důležitou roli. Vyšetřují se výjimečně, jak uvádí Schreiber a kol. (1998), pouze v případech opakované transfúze většího množství krve. Antigeny těchto méně známých systémů působí velmi slabě a v séru se protilátky proti nim přirozeně ani nevyskytují. Stává se tak až po případné násobné imunizaci daným antigenem. Mluvíme tak o systémech MNSs, P, Lutheran, Kell Cellano, Lewis, Duffy a Kidd a mnohých jiných (viz Tab. 8, 9). Race a Sanger (1954) uvádí i další objevené systémy, nalezené v určitých populacích. Ty nemají praktické uplatnění v genetice člověka, protože antigeny na základě kterých byly identifikované, u jedinců buď téměř vždy chybí anebo jsou přítomny. Některé z nich byly nalezeny v jednotlivých rodinách, jiné jsou typické pro určité populace. Pro shrnutí, antigenní systémy kromě AB0 a Rh mají uplatnění zvláště u výzkumu etnogenetické analýzy populací, při hledání vývojových spojovacích článků mezi skupinami lidstva, dále také při výkladu příbuznosti jedinců a při podrobném stanovování otcovství. Sehrály také důležitou úlohu při objasnění dědičnosti člověka (Fetter a kol. 1967). 21
Rok Skupinový objevu systém Antigen Fenotyp Objevitel AB0 A1, A2, A3, A4, B 0, A1, A2, B, AB Landsteiner (1907 Janský) 1927 MNSs M, (M2), N, (N2) Ss M, N, MN, S, s, Ss Landsteinerovi Levine 1927 P P1, P2 P1, P2,p Landsteiner Levine 1940 Rh C, Cw, Cx, (Cu), (cv), c D, Du, d E, Ew, (Eu), e (F) f Rh+ Rh Landsteiner Wiener 1945 Lutheran Lua, Lub Lu (a+b ) Lu (a b+) Callender Race Coombs Mourant Race 1900 1946 Kell K K+k, k+k+ K k+, (K k ) 1946 Lewis Lea, Leb Le (a+b ) Mourant b Fy, Fy Fy (a+b ) Fy (a+b+) Fy (a b+) Fy(a b ) Cutbush Mollison Parkin Allen Diamond Niedziela 1950 Duffy a 1951 Kidd Jka, Jkb Jk (a+b ) Jk (a+b+) Jk (a b+) Jk (a b ) 1955 Diego Dia Di (a+) Di (a ) 1955 Sutter Jsaa Js (a+) Js (a ) 1961 Auberger Aua Au (a+) Au (a ) 1962 Xg Xga Xg (a+) Xg (a ) Tab. 8 Ostatní popsané krevní systémy. Zdroj: Molnar (1983); Malaska (1957); Race, Sanger (1954). Přepracováno. 22
Rok objevu Název Označení vlastnosti Objevitel Příčniny vzniku protilátky 1934 Hunter Hu Landsteiner a kol. heteroaglutinin 1946 Levay 1946 Graydon 1947 Jobbins 1951 Miltenberger 1951 Becker 1951 Jay 1952 Callender Race Gr transfuze Graydon přirozený Gilbey těhotenství Levine a kol. těhotenství Elbel Prokop těhotenství Levine a kol. nádor Vel Sussman Miller transfúze 1952 Ven Loghem Hart těhotenství 1953 Berrens Be Davidsohn těhotenství 1953 Wright Wra Holman těhotenství 1953 Henshew He Nijenhuis heteroaglutinin 1954 Batty Bya Simmons těhotenství 1954 Verwest Vw Hart Loghem těhotenství 1954 Romunde Rm Hart Loghem těhotenství Mia Tja Další krevní vlastnosti: Cartwrigh (YT), Scianna (SC), Dombrock (DO), Colton (CO), Landstener Wiener (LW), Chido/Rogers (CH/RG), Hn (H), Kx (XK), Gerbich (GE), Cromer (CROMER), Knops (KN), Indian (IN) Tab. 9 Další popsané krevní vlastnosti. Zdroj: Race, Sanger (1954); Malaska (1957); http://www.bloodbook.com/type sys.html (15). 23
4. A n t r o p o l o g i e k r e v n í c h s k u p i n 4.1. P o č á t k y s é r o a n t r o p o l o g i e Věda séroantropologie je jedním z odvětví antropologického bádání. Přišla na svět v době, kdy byly objeveny i další krevní systémy, které nesloužily už jen pouze medicíně. Staly se tak velkým přínosem pro studium genetiky člověka. Za tento moment je považován objev manželů Hirszfeldových, kteří upozornili na to, že jednotlivé lidské rasy vykazují rozdíly v distribuci krevních skupin (... there were racial differences in the distribution of the groups ). Od té doby se krevní skupiny staly velmi důležitým nástrojem pro fyzické antropology (Race a Sanger 1954). Polští vědci Ludvík a Hana Hirszfeldovi v roce 1918 uveřejnili výsledky svých výzkumů z makedonské fronty. Zde zkoumali krevní skupiny u vojáků různého původu. Jednoznačně dospěli k závěru, že krevní skupina A se geograficky projevuje na západě ve velké míře, přičemž postupem na východ je potlačena skupinou B (Fetter a kol. 1967). Od té doby výzkum pokročil k objevům mnoha dalších krevních systémů. Například v roce 1926 uveřejnili Landsteiner spolu s Levinem systém MN a systém P. Tyto a jiné objevené krevní systémy nikterak neovlivňují transfúzi krve, těší se však velkému zájmu antropologů a genetiků. 4.1.1. H a r d y h o W e i n b e r g o v a r o v n i c e Hardyho Weinbergův zákon neboli rovnice slouží pro populačně genetický rozbor. Je to vztah mezi frekvencemi alel a genotypem populace. Rovnovážný stav nastává, pokud je distribuce alel a tedy i genotypů neměnná po několik generací. Toto platí však jen pro ideální populace. Původním předpokladem je, aby organismy byly diploidní, pohlavně reproduktivní a aby v populaci probíhalo náhodné páření (panmixie). Populace musí být v ideálním případě dostatečně (nekonečně) veliké. Také zde musí být vyloučena mutace, migrace a výběr. Pokud je toto zachováno, Hardyho Weinbergův zákon platí pro autosomy a v populacích s odděleným pohlavím pouze za předpokladu shodných alelových četností. 24
Představíme li si populaci v nejjednodušším případě, vezmeme v úvahu lokus (místo) s dvěma alelami A a s alelovými četnostmi p a q. Hardy Weinbergův zákon tedy předpovídá genotypové četnosti pro AA homozygota (p2), Aa heterozygota (2pq), aa homozygot (q2 ). Populace, jež jsou v rovnováze, lze vyjádřit tedy následující rovnicí: p2 + 2pq + q2 = 1 (Relichová 2000; 6; 7). 4.1.2. B i o c h e m i c k ý i n d e x Hirszfeldovi zavedli tkzv. biochemický index rasy, který slouží jako podílový ukazatel výskytu četností aglutinogenu A a aglutinogenu B. Posuzuje populace ze sérologického hlediska a stanovuje jejich vzájemné pozice. Nevýhodné je to, že zde není počítáno s četností skupiny 0 (Martin, Saller 1960). I = A + AB / B + AB Na základě výsledku tohoto indexu byly vyčleněny 3 hlavní skupiny: evropský typ ( europaischer Typ ) >2,5 přechodný typ ( intermediarer Typ ) 1,3 1,8 afro asijský typ ( afro asiatischer Typ ) <1,0 Bylo vytvořeno i mnoho dalších indexů pro porovnávání populací (více viz Martin, Saller 1960, s. 1611). Jakékoli členění lidstva do skupin, popřípadě tkzv. ras na základě morfologických znaků a metrických ukazatelů je již přežitek. Takovéto srovnávání a hodnocení nemá žádné vědecké opodstatnění, stává se jen podkladem pro rasistické teorie. 4.2. S é r o a n t r o p o l o g i e v Č e s k o s l o v e n s k u O výzkum krevních skupin se zajímali i mnozí fyzičtí antropologové v tehdejším Československu. Toto odvětví mělo u nás již zavedenou tradici od dob Janského, který na základě svých výsledků pojmenoval 4 krevní skupiny u lidí. Právem se tak zařadil mezi autory objevu krevního systému AB0. 25
Objev manželů Hirszfeldových podnítil zájem mnoha dalších antropologů o téma krevních skupin. Již v roce 1929 započal Trokan výzkum krevního systému AB0. Následovali další, v roce 1932 Suk (viz níže), dále Raška, Dokládal a Vlček. Krevními systémy se zabývali další vědečtí pracovníci, např. Kout, Hrubiško, Šmálik, Vacl, Ferák a Kušíková (Dokládal 1976). 4.2.1. V o j t ě c h S u k a j e h o d í l o Profesor Vojtěch Suk (1879 1967) se řadí mezi významné české antropology pro svůj velký přínos v tomto oboru. Zabýval se také dlouhodobě právě výzkumem krevních skupin populací a dalších znaků, které souvisejí s těmito krevními vlastnostmi. Je úzce spjat s dnešní Masarykovou univerzitou, založil zde na Přírodovědecké fakultě Antropologický ústav (dobudován v roce 1927). Vojtěch Suk byl vystudovaný lékař a antropolog. Svůj výzkum zaměřil především na obor sérologie, rasové antropologie a etnologie. V oblasti sérologie působil v Brně i Praze, zkoumal populace na svých vědeckých cestách na Labradoru (1927) i v Podkarpatské Rusi. Zabýval se krevními skupinami u recentních populací, zaměřoval se na geografické rozšíření skupin, hledal také korelace mezi nemocností obyvatelstva a typem krevní skupiny (Pilařová 2005). Zastoupení krevních skupin studoval u evropské populace, široké šetření provedl v Brně a okolí (kolem 3000 vzorků). Zde dospěl v roce 1930 k následujícímu zastoupení krevních skupin (Zdroj: Suk 1930): 0 A B AB 28,8% 44% 18,2% 9% Tyto výsledky jsou téměř shodné v porovnání s frekvencemi krevních skupin ve střední Evropě (Suk 1934). V rámci tohoto výzkumu se zaměřil taktéž na krevní skupiny lidí narozených ve velkých městech a na vesnicích. Zde našel prokazatelný rozdíl v rozložení jednotlivých skupin. Skupina 0 měla u obou pohlaví o mnoho vyšší frekvence ve městech, na rozdíl od vesnic, kde bylo zase větší zastoupení skupiny A. Na odebraných vzorcích však vyvrátil myšlenku, která předpovídala vztah mezi krevní skupinou jedince a barvou pleti a také krevní skupinou a věkem (Suk 1930). 26
Suk se zabýval také možnou spojitostí krevních skupin s onemocněním. Ve své práci Faultless teeth and blood groups z roku 1930 uvádí, že děti bělochů mají prokazatelně více kazů než děti původem z Natalu a Zululandu. Zkoumal také stav chrupu u dalších populací v Africe a severní Kanadě. Tato myšlenka ho přiměla k bližšímu prozkoumání chrupu u již zmiňovaného souboru z Brna, u kterých byly krevní skupiny známy. Skupina 0 byla nejodolnější vůči zubnímu kazu, nejvyšší procento kazivosti zubů vykazovaly skupiny A a B (Suk 1930). 4. 3. G e o g r a f i c k é r o z l o ž e n í krevních skupin ve světě Rozložení krevních skupin není ve světě jednotné. V některých oblastech světa převládá v populaci určitý typ skupiny, zatímco druhý je značně potlačen. O tento jev se postarala evoluce. Lidské populace byly po dobu let ovlivňovány míšením, mutacemi a přírodním výběrem, také posun genetické rovnováhy sehrál důležitou roli. Dle Vogela (1960, 1970), tento jev (způsob rozložení krevních skupin) zapříčinila epidemie moru a pravých neštovic (in Kellermann 1971). Frekvence krevních typů ve světě je jedno z témat, kterým se zabývají antropologové a evoluční biologové. Na základě těchto údajů můžeme sledovat lidskou variabilitu a celkové migrační chování obyvatelstva. Dále pak také směr, jakým se evoluce v dějinách ubírala. Nejlépe je to patrno ze studia izolovaných skupin jedinců. Dnes prakticky neexistuje dokonale izolovaná skupina lidí, v průběhu času došlo k mezidruhovému křížení. Krevní skupiny jsou vhodné pro studium lidské variability, protože otázka jejich dědičnosti je dnes už vyřešena. Wolf (2000) uvádí, že dědičnost morfologických a deskriptivních znaků člověka je o mnoho složitější a její podstata zůstává nejasná. Výzkum skupin za poslední roky značně pokročil a je významnou pomůckou v moderní antropologii. 27
4.3.1. S y s t é m A B 0 v e s v ě t ě 4.3.1.1. K r e v n í s k u p i n a 0 Skupinu 0 vlastní největší počet lidí na světě (viz Obr. 4). Krevní typ 0 má vysokou četnost (přes 50%) u Basků, Irů a Islanďanů. Největší zastoupení má však u amerických Indiánů, u některých kmenů dosahuje téměř 100% (Fetter a kol. 1967). Beneš (1979) uvádí, že ačkoli je skupina 0 pro Indiány typická, stejně se tak nacházejí velké rozdíly v rámci kmenů. Například u západoamerických Utesů je výskyt této skupiny 97%, zatímco u Černonožců žijících v sousedství je to jen 23%. Vácha a kol. (2004) dodává, že právě u Indiánů chybí skupina B. Ta vznikla nejspíš mutací ve starém světě. Další oblast poměrně vysokého výskytu je Afrika. Kolem 75% obyvatelstva ve střední, západní a jihovýchodní části mají tento fenotyp 0. Afričané osídlující území severně od Sahary, se se svou nižší skupinovou četností 0 blíží některým západoevropským populacím (Beneš 1979). Lidstvo na zemi vlastní alelu 0 v 63%. Skupina 0 se také ve velkém měřítku objevuje u domorodých Austrálců a v západní Evropě, zvláště u populací s Keltskými předky. Nejnižší frekvence této skupiny je ve východní Evropě a Střední Asii, kde je častá skupina B (3). Jih a sever asijského kontinentu je oproti centrální Asii ve výskytu skupiny B o dosti bohatší (Beneš 1979). 28
Obr. 4 Rozložení skupiny 0 ve světě (%). Zdroj: http://anthro.palomar.edu.com (3). 4.3.1.2. K r e v n í s k u p i n a A Skupina A je druhá nejčetnější krevní skupina ve světě (Beneš 1979). Své největší zastoupení má v Evropě, zvláště pak na severu a západě. Směrem na východ a jih ustupuje skupině B. Tento posun je patrný v Itálii, kde zastoupení skupiny A směrem od severu k jihu slábne. Stejně tak v Německu, kde je tento úbytek od západu na východ. Do skupiny A spadá více než 50% obyvatel Laponska, Norska a Portugalska. U Poláků, Rusů a Ukrajinců se vyskytuje mezi 32 40% (Fetter a kol. 1967; Wolf 2000). Eskymáci vykazují výskyt této skupiny přes 60% (Vácha a kol. 2004). Celkově je alela A na světě u lidí přítomna v 21% (viz Obr. 5). Jak dále uvádí internetový zdroj (3), nejvyšší frekvence alely A se nachází v malých populacích, jako jsou Černonožci v Montaně (30 35%), u původního obyvatelstva Austrálie (40 53%) a v severní Skandinávii (50 90%). Přičemž alela A zjevně vůbec není přítomna u Indiánů ve střední a Jižní Americe a nevyskytovala se vůbec ani v minulosti. Objevila se až s příchodem Evropanů. Tato hypotéza se však rozchází s objevem skupiny A u mumií z předkolumbijského období. Nízké hodnoty jsou u populací paleomongoloidních a východoindických. Také v Africe není výskyt této skupiny nikterak vysoký (průměr 15 20%), v některých oblastech ojediněle 5 10%. Podtyp A2 se vyskytuje pouze u Evropanů a Afričanů, u jiných skupin obyvatelstva nebyl dosud zjištěn (Beneš 1979). 29
Obr. 5 Rozložení alely A ve světě (%). Zdroj: http://anthro.palomar.edu.com (3). 4.3.1.3. K r e v n í s k u p i n a B Skupina B se v Evropě vyskytuje nejméně. Téměř skoro nikde na území Evropy nepřekročí 20%. Jedinou výjimkou jsou Romové, u kterých byla zjištěna skupina B v 35%. Tímto se svou distribucí blíží k asijským skupinám Burjatů, Kalmyků, Indů a Siamců (Fetter a kol. 1967; Wolf 2000). Až 40% zaujímá v jihovýchodní Asii a v Koreji, také Indii a Indonésii (Vácha a kol. 2004). Další území s vysokým výskytem této skupiny je Afrika, kde je také patrná nerovnoměrnost na daných územích, někde je dosti vysoká, jinde nedosahuje frekvence ani 5%. V Austrálii (zjištěna jen u severoaustrálských domorodců) a Americe se téměř nevyskytuje. Velmi vzácná je v Melanésii a Polynésii (Beneš 1979). Právě na Polynésanech lze dobře doložit jejich původ, který by bez studia krevních skupin zůstával nevyřešenou otázkou. Porovnáním jejich skupinových frekvencí bylo prokázáno jasné zastoupení amerických genů (tomu odpovídá vysoké procento skupiny 0, velmi málo skupiny B a úplná nepřítomnost podskupiny A2). Pozdější výzkum dalších systému potvrdil i částečné geny z Asie (Beneš 1994). Alela B je však ve světě svým výskytem nejvzácnější (viz Obr. 6). Tuto alelu nese pouze 16% veškerého obyvatelstva na světě (3). 30
Obr. 6 Rozložení alely B ve světě (%). Zdroj: http://anthro.palomar.edu.com (3). 4.3.2. S y s t é m A B 0 v Č e s k é r e p u b l i c e 0 A B AB Suk (1932) 28,8% 44% 18,2% 9% Wolf (2000) 30% 44% 18% 8% Bičík (1992) 36% 41% 16,5% 6,5% Vácha a kol. (2004) 37,8% 41,5% 14,1% 6,6% Tab. 10 Zastoupení krevních skupin v České republice dle různých autorů. 4.3.3. S y s t é m R h v e s v ě t ě Systém Rh slouží jako vhodná antropologická charakteristika. U Afroameričanů a Asiatů je výskyt skupiny Rh+ velmi častý, téměř 100%. V evropské populaci tomu už tak není, Rh pozitivních jedinců je okolo 80%, výjimku tvoří Baskové (pod 70%) a obyvatelé švýcarských kantonů (ti zůstali po určitou dobu v izolaci). 31
Podskupina systému Rh, cde je u Evropanů přítomna okolo 2%, zatímco u Afroameričanů dosahuje až 70% (Vácha a kol. 2004; Fetter 1967; 3). S frekvencí výskytu této podskupiny je spojována také další krevní vlastnost. Jedná se o tvar červených krvinek, které jsou ve tvaru srpu ( sickle cell trait ). Tento znak je častý u Afroamerické populace. Tímto se zabýval ve své práci i Zoutendyk a kol. (1953), kdy zkoumal frekvence krevních skupin u lidí v jižní Africe ( Bushmen people ). Zde zaznamenal vysokou frekvenci cde, avšak žádné srpkovité krvinky. Na základě Lehmana a Cutbushe (1952) přistoupil Zoutendyk na teorii, že tento typ krvinek se přesunul na africký kontinent z Asie a má odlišný původ od vysoké frekvence cde. Poznatek spjatý s touto vlastností přispívá k objasnění původu lidstva. Úzká skupina obyvatel jižní Afriky jsou nejspíše starověkého původu. V minulosti obsazovali daleko větší území, než na kterém žijí nyní (Beneš 1979). 4.3.4. E v o l u c e k r e v n í c h s k u p i n Evoluce krevních skupin je nesmírně zajímavé téma, kterým se zabývá především věda evoluční biologie. Je velmi obtížné stanovit nějaký daný rámec, dle kterého se ve vývoji utvářely krevní vlastnosti lidstva. Ostatně, na toto téma je publikováno mnoho různých teorií. Jak uvádí Routil ve své práci o vztahu rasy a krevních skupin, vysoké procento skupiny 0 ve světě je předpoklad toho, že lidstvo se vyvíjelo monofyleticky (Suk 1934). Původní člověk tedy vlastnil pouze skupinu 0. To znamená, že na povrchu červených krvinek nebyl přítomen antigen A ani B (16). Krevní skupiny A a B jsou evolučními fázemi ve vývoji krevních skupin ( blood specificity ). Dle teorie Hirszfelda a Amzela, jsou A a B mutacemi skupiny 0 (Martin, Saller 1960). Internetový zdroj (16) uvádí, že krevní skupina A vznikla mutací pravděpodobně 20 000 lety p. K. Na povrchu erytrocytů se vyvinul antigen A. Skupina B by měla být mladší ještě asi o 10 000 let. Její vznik je kladen do Asie. Není však jasné, proč se tento krevní typ utvářel právě na tomto území. Jako poslední článek ve vývoji vznikla míšením skupina AB asi před 1500 lety. Někteří evoluční biologové se však domnívají, že první ve světě vznikla alela Ia a až poté se z ní vyvinula alela i pouze odstraněním její funkční části. Alela Ib je kladena do poslední fáze evolučního vývoje. 32
5. U r č o v á n í k r e v n í h o s y s t é m u A B 0 u historického kosterního materiálu 5. M o l e k u l á r n ě g e n e t i c k é v y š e t ř e n í krevních skupin Vyšetření krevních skupin je dnes možno úspěšně provést metodou analýzy DNA. V dvouřetězcové molekule DNA je uložena veškerá genetická informace jedince (část také v mitochondriích). Gen je úsek chromozomu se specifickou sekvencí nukleotidu. Geny se nacházejí na typických místech chromozomu, nazývaných lokusy. Dnes už je velká část lidského genomu zmapována. Vědci znají konkrétní místa výskytu potřebné informace. Jsou tedy známa i místa specifická pro rozluštění genotypu krevních skupin. Na rozdíl od sérologických metod není metoda analýzy DNA ovlivněna kontaminací vlivem vnějšího prostředí a dochází podstatně méně k nespecifickým reakcím. 5.1.1. M o l e k u l á r n í g e n e t i k a s y s t é m u A B 0 Antigenní vlastnosti krevních skupin nejsou přesně předurčeny geny A, B nebo 0, nýbrž jsou určeny aktivitou enzymů glykosyltransferáz. Jak už bylo v úvodu řečeno, A transferáza je odpovědná za přenos N acetylgalaktosaminu a B transferáza za přenos D galaktózy, z toho také vyplývá určení krevní skupiny A a B. U skupiny AB jsou umístěné obě transferázy, u skupiny 0 žádná. Jak uvádí Bennet a kol. (1995), geny pro tyto transferázy jsou přítomny na dlouhém raménku 9. chromozomu (9q34). Tento lokus AB0 je složen ze 7 exonů s celkovou délkou 1062 párů bází (bp). Délka jednotlivých exonů je v rozsahu 27 až 690 bp. Na exonech 6 a 7 se nacházejí nejvýznamnější delece a substituce (in Zelený 2006; 5). Při zjišťování krevního systému AB0 jsou velmi důležitá místa 261 a 703 v sekvenci DNA glykozyltransferázového genu. Pozice 261 je rozpoznávací a restrikční místo pro enzym KpnI. Zde dochází u většiny alel 0 k deleci nukleotidu guaninu. Tímto lze alelu 0 odlišit od alely A a B. 33
V místě 703 se nalézá typické místo pro restriktázu AluI, kde dochází k substituci nukleotidu guaninu za alanin v sekvenci transferázy B. K odlišení dalších alel se používají i jiné specifické restriktázy, tyto 2 jsou ale nejvyužívanější (Zelený 2006; Hummel 2003). Lee a Chang (1992) při svém výzkumu odhalili krevní skupiny pomocí restriktáz v místě 258 a 700 sekvence DNA. Tento postup použili úspěšně i na vzorcích kostní tkáně, která byla vystavena extrémním podmínkám. Zde dokazují, že postačí pouze rozbor pozice nukleotidu 258 a 700 (za použití 2 sad specifických primerů) k určení krevní skupiny. Výsledný genotyp je poté jednoduše určen na základě projevu štěpných enzymů dle závazných pravidel (viz Tab. 11). KpnI AluI 00 BB A0, B0 AB, B0 Nerozloženo AA, AB, AA, A0, ( No digestion ) BB 00 Celkový rozklad ( Complete digestion ) Poloviční rozklad ( Half digestion ) Tab. 11 Výsledné genotypy AB0 předurčené aktivitou enzymů KpnI a AluI. Zdroj: Lee, Chang (1992). Přepracováno. Obr. 7 Výsledek metody PCR. Detekce krevních skupin. Zdroj: www.dadamo.com (6). 34
5.1.2. M e t o d a P C R ( p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ) Genotyp krevní skupiny jedince je téměř jednoduše rozluštitelný pomocí PCR metody (polymerázová řetězová reakce). Jak dodává Dobisíková (1999), při analýze starých nálezů je toto často jediná možná metoda. Metoda PCR byla zavedena v roce 1983 K. Mullisem, za kterou později získal Nobelovu cenu. Jedná se o mnohonásobnou replikaci konkrétního úseku DNA in vitro. PCR je také jedinečná v tom, že bez klonování získáme požadovanou sekvenci molekuly DNA (Doškař 2006). Proces replikace vyžaduje v přírodě přítomnost mnoha enzymů, pro průběh reakce in vitro postačí použití jen jednoho enzymu. Pro provedení metody PCR potřebujeme následující materiál: templát (DNA nebo RNA; postačí již malé množství, asi 1molekula nukleové kyseliny) primery (specifické oligonukleotidy; pro krevní skupiny se používají AB01, AB02, AB07, AB010) termostabilní enzym DNA polymerázu (získává se z termofilních mikroorganismů) směs nukleotidů (dntp) hořečnaté ionty (Zelený 2006; Rosypal, Doškař 2000; Mazura a kol. 2001) Vlastní metodě PCR předchází izolace DNA. Základní metoda polymerázové řetězové reakce se skládá z následujících kroků, přičemž cyklus se opakuje 25 35 krát: denaturace připojení primerů prodlužování primerů (Doškař 2006) Následuje restrikční štěpení specifickými enzymy KpnI a AluI a poté detekce zmnoženého úseku produktu PCR gelovou elektroforézou (agaróza, polyakrylamid). Pro rozbor výsledných produktů se vystaví gel pod UV světlo a také se pořídí fotografie. Nakonec se hodnotí délky fragmentů a po porovnání se standardem se označí jako pozitivní anebo negativní. Při práci se musí dávat pozor na jakoukoli možnou kontaminaci materiálu. 35