PŘÍRODOPIS, BIOLOGIE

PŘÍRODOPIS, BIOLOGIE TROJLÍSTEK - PODPORA VÝUKY PŘÍRODOPISU, BIOLOGIE, FYZIKY A CHEMIE ŽÁKŮ VE VĚKU 11 AŽ 15 LET reg. č.: CZ.1.07/1.1.00/26.0044 PROJEKT JE REALIZOVÁN V RÁMCI OPERAČNÍHO PROGRAMU VZDĚLÁVÁNÍ PRO KONKURENCESCHOPNOST A SPOLUFINANCOVÁN Z PROSTŘEDKŮ EVROPSKÉHO SOCIÁLNÍHO FONDU A STÁTNÍHO ROZPOČTU ČR

Obsah 1 Základy optiky 3 1.1 Optické soustavy 3 1.1.1 Optické členy pracují na základě zákonů lomu a odrazu paprsků 3 1.1.2 Lom paprsků 5 1.2 Zobrazování čočkou a rozptylkou 6 1.2.1 Čočka 6 1.2.2 Rozptylka 9 1.2.3 Vady optických členů 9 1.3 Lupa 10 1.4 Mikroskop 11 1.4.1 Jak vzniká v mikroskopu obraz 15 1.4.2 Neobvyklé způsoby mikroskopování 19 1.4.3 Mikrofotografie 20 2 Terénní odběry mikroorganismů 26 2.1 Pomůcky ke sběru 26 2.2 Měření v terénu 27 2.3 Záznamy o sběru a vzorcích 27 3 Laboratoř 28 3.1 Preparační nástroje a pomůcky 28 3.2 Zdroj pokusných organismů 30 3.3 Kultivace 32 3.3.1 Okenní kultivace, krátkodobá kultura pro orientační pohled 32 3.3.2 Kultivace na pevných půdách, růst kolonií, výběr kolonií, převod do sbírky 32 3.3.3 Experimentální kultivace, jak nasadit pokus, jak zajistit stálou teplotu a intenzitu světla 32 3.4 Metody preparace 34 3.4.1 Fixovaný materiál, cytologie 34 3.5 Studium na živých organismech 34 3.5.1 Stanovení životního cyklu 34 3.5.2 Určení generační doby a růstové křivky 35 3.5.3 Studium pohybu 35 3.6 Živná media 35 3.6.1 Jednoduchá živná media s půdním odvarem 35 3.6.2 Jednoduchá plně definovaná kultivační media 37 4 Závěr 39 1

Příručka pro biologii Příručka vznikla na základě projektu Trojlístek podpora výuky přírodopisu, biologie, fyziky a chemie žáků ve věku 11 až 15 let. Je zaměřena na zvládnutí základů optické mikroskopie a technik studia mikroorganismů získaných z lokálních zdrojů (řas, sinic, kvasinek, probiotických organismů). Naše publikace je metodický doplněk k laboratorní výuce. V první části představuje základy optických soustav a základy mikroskopie. Ve druhé se věnuje práci v laboratoři a popisuje základní techniky experimentální biologie. Nezapomíná ani na improvizace, které je nutno v minimálních pracovních podmínkách učinit. Doufáme, že příručka pro biologii bude platnou pomůckou pro učitele a žákům poodhalí krásu a tajemno mikroskopie. 2

1 Základy optiky Optické pomůcky a přístroje se ve studiu biologie využívají v terénu i při práci v laboratoři. Je jich celá řada od nejjednodušší lupy až ke složitému přístroji - mikroskopu. Ačkoliv se to na první pohled nemusí zdát, lupa i mikroskop mají společné optické členy. Pracují totiž na základě zákonů lomu a odrazu paprsků v prostředí o různých optických vlastnostech. Kdo se specializuje na mikroskopickou biologii, musí tyto zákony velmi důkladně znát. Stejně tak by měl vědět, jak ošetřovat světelný mikroskop, jak ho správně seřídit, a poznat jeho rozlišovací meze. 1.1 Optické soustavy Mikroskop je složité zařízení, které obsahuje několik optických soustav. Optická soustava je složena alespoň ze dvou optických členů, například spojné čočky a zrcadla. Právě na ty se v této části zaměříme. 1.1.1 Optické členy pracují na základě zákonů lomu a odrazu paprsků Odraz paprsků známe například ze zrcadla. U rovinného zrcadla je odraz úplný. To znamená, že všechny paprsky přicházející na plochu zrcadla se odrážejí ve stejném úhlu, v jakém na něj dopadly. Známe ale i polopropustná zrcadla. U těch je na základní skleněné desce napařena slabá odrazná vrstva, od které se část dopadajících paprsků odrazí a část prochází. O tom, v jakém poměru jsou odražené a procházející paprsky, rozhoduje hustota napařené vrstvičky. Základní schéma variant odrazu je uvedeno na obrázku 01 a obrázku 02. zrcadlo propustné zrcadlo propustný hranol Obrázek 01: Odraz paprsků - jak se paprsky odrážejí a jsou propouštěny optickými soustavami. 3

Paprsek dopadající na zrcadlo v úhlu 45 je odrážen ve stejném úhlu 45, takže dohromady 90, což nám v konkrétním případě umožňuje vidět za roh. Totéž platí i o složeném optickém hranolu. Prakticky se tohoto jevu využívá například při vytyčování pravých úhlů v terénu. ZDROJ SVĚTLA výstup 3. hranolu 2. hranol optická osa 1. hranol 3. hranol výstup 1. hranolu výstup 2. hranolu Obrázek 02: Odrazy a propustnosti možné v optických hranolech. V mikroskopové technice je někdy užíváno zrcadlo při tak zvaném kritickém způsobu osvětlení, tedy když není možné použití světelného zdroje. Hranoly jsou užívány zejména v binokulárním tubusu, popřípadě jako pomocný optický člen při fotografování. 4

1.1.2 Lom paprsků Lom paprsků známe například z pohledu do vody, v níž je částečně ponořen pokusný objekt. Zkuste to. Uvidíte, že se bude zdát kratší, než skutečně je. Lom paprsků je závislý na optické hustotě prostředí, kterým paprsek prochází. Optická hustota udává množství absorbovaného světla pohlceného v měřeném vzorku. Vzduch má optickou hustotu jedna, voda ji má vyšší. Při průchodu z prostředí opticky řidšího do prostředí opticky hustějšího se paprsky lámou v úhlu, který je závislý na optické hustotě nového prostředí. Schéma je na dalším obrázku 03. Lomu paprsků se běžně využívá v mikroskopii, kdy pomocí imersní (ponořené) optiky zvyšujeme rozlišovací schopnost optického systému. Bílý paprsek, který je složen z barev celého spektra, se lomí tak, že se rozkládá na jednotlivé barevné složky. Dopadá-li paprsek bílého světla z hustšího prostředí do řidšího, po lomu se rozkládá. Nejméně se odchyluje od původního směru paprsek červený, nejvíce modrý. MEZNÍ ÚHEL ÚPLNÝ ODRAZ LOM Sklo Sklo V z d u c h V z d u c h Obrázek 03: Lom paprsků jak se světlo láme při průchodu z opticky hustějšího prostředí do prostředí opticky řidšího. 5

1.2 Zobrazování čočkou a rozptylkou Čočka je optický člen s kladnou optickou mohutností, naopak rozptylka má optickou mohutnost zápornou. Optická mohutnost je veličina ukazující zakřivení čočky. Rozptylce se lidově říká také zmenšovací sklíčko a jako optický člen má mnoho funkcí při korekcích optických vad. Nás však budou více zajímat čočky. 1.2.1 Čočka Na počátku všeho je osa, tedy optická osa. Můžeme si ji představit jako paprsek běžící z nekonečna do nekonečna. Kdyby běžela jen tak, neměla by valného smyslu. Takových přímek může být nekonečně mnoho a velmi chaotických. Jiná situace nastane, když umístíme do prostoru čočku. Ta totiž ihned určí, kudy má optická osa běžet a umístí ji do svého optického středu (obrázek 04). Jakmile kolem běžící paprsky uvidí, že se vyskytlo něco, co jim dává řád, po průchodu čočkou se seřadí podle zajímavých pravidel. a b F f O f F c Obrázek 04: Průchod paprsků spojnou čočkou. Paprsek a, rovnoběžný s optickou osou, se láme do ohniska. Paprsek b, procházející optickým středem, pokračuje nezměněným směrem. Paprsek c, procházející ohniskem, pokračuje po průchodu spojnou čočkou rovnoběžně s optickou osou. 6

Nás teď zajímají paprsky, které jdou rovnoběžně s optickou osou, tedy kolmé na rovinu optického členu v tzv. optické rovině. Ty se po průchodu čočkou soustřeďují do ohniska (obr. 05), ležícího na optické ose označeného písmenem F. Jistě namítnete, že v tom případě musí existovat ještě jedno ohnisko pro paprsky letící opačným směrem. Máte pravdu. Druhé ohnisko také existuje a označujeme je písmenem F. Vzdálenost mezi optickým středem čočky a ohniskem je nazvána ohnisková vzdálenost a značíme ji symbolem f, pro opačný směr opět s apostrofem f. Jestli ohnisko skutečně existuje, se můžete jednoduše přesvědčit. Jakoukoli spojnou čočku postavte plochou ke slunci a tam, kde je ohnisko, uvidíte zářivý bod. Promítnete-li ohnisko na ruku, popálí Vás. Tímto způsobem se v Řecku tradičně zapaluje olympijský oheň. Jak je to s paprsky, které neběží rovnoběžně s osou, ale přesto čočkou projdou? Z hlediska zobrazení nás zajímají paprsky, které procházejí ohniskem. Ty po průchodu čočkou změní směr a dále jdou rovnoběžně s optickou osou (také obrázek 05). Paprsky, které projdou středem optického členu, se nezmění a pokračují dále svým původním směrem (také obrázek 05). Něco jsme se dozvěděli o třech základních směrech průchodu paprsků (tzv. konstrukčních paprsků), které budeme potřebovat pro vysvětlení, jak se zobrazí předmět. Věnujme se tedy zobrazování předmětu spojnou čočkou. Tu si pro zjednodušení nějak označíme v průmětu optické roviny. Pro náš výklad potřebujeme definovat ještě dvojnásobnou ohniskovou vzdálenost (2F, resp. 2F ) a určit si rovinu předmětovou a obrazovou. Tím si určíme směr paprsků, aby nás to nemýlilo (viz obr. 05). Předmět si označíme jako tradičně šipkou, ale může to být třeba slon, anebo bacil. Teď se ještě podíváme na obrázek 05, kdy je předmět umístěn v dvojnásobné ohniskové vzdálenosti. Jak vidíte, jeho skutečný obraz existuje v obrazové rovině také ve dvojnásobné ohniskové vzdálenosti. Je skutečný, převrácený a má stejnou velikost jako zobrazovaný předmět. PŘED MĚT Obrazová rovina 2F F f O f F 2F Předmětová rovina OBRAZ Obrázek 05: Konstrukční paprsky jak je předmět zobrazován spojnou čočkou. 7

Obrázek 06 ukazuje předmět za dvojnásobnou ohniskovou vzdáleností (směrem k nekonečnu). Jeho obraz existuje v obrazové rovině mezi dvojnásobnou ohniskovou vzdáleností a ohniskovou vzdáleností. Je skutečný, převrácený a zmenšený (to je případ běžné fotografie, kdy tento skutečný, převrácený a zmenšený obraz zachytíme na film nebo čip). PŘEDMĚT Obrazová rovina f F 2F 2F F f O Předmětová rovina OBRAZ Obrázek 6: Jak je předmět obrazově zmenšen (případ fotografie krajiny). Obrázek 07 znázorňuje stejnou situaci, je-li předmět mezi dvojnásobnou ohniskovou vzdáleností a ohniskovou vzdáleností. Obraz předmětu je v tomto případě v obrazové rovině za dvojnásobnou ohniskovou vzdáleností směrem k nekonečnu. Obraz je skutečný, převrácený a zvětšený. To je pro změnu případ makrofotografie, kdy tento skutečný, převrácený a zvětšený obraz zachytíme na film nebo čip. A je to i případ mikroskopie, kdy tento skutečný, převrácený a zvětšený obraz pozorujeme okulárem jako lupou. 2f 2F F f O Předmětová rovina Obrazová f F 2F rovina 2f Obrázek 07: Jak je předmět obrazově zvětšen (případ makrofotografie). 8

1.2.2 Rozptylka Zobrazování rozptylkou není pro nás jako uživatele tak důležité. Přesto si je ukážeme, abychom si alespoň zopakovali to, co zde již bylo řečeno o zobrazování čočkou. Obrázek 08 schematicky ukazuje zobrazení rozptylkou. Nyní je na vás, abyste si je zdůvodnili. f F optická osa Obrázek 08: Čočka rozptylná. 1.2.3 Vady optických členů Vady optických členů jsou pro zobrazování velmi důležité. Teorií optických vad a jejich odstraňováním se zabývá věda zvaná optika. Výklad optických vad a jejich odstranění je velmi rozsáhlý a odchyloval by se od tématu této příručky. Zájemce odkážeme na specializovanou literaturu. 9

1.3 Lupa Lupa tak se nazývá nejjednodušší, tolik potřebný, optický nástroj pro biologa. Můžete namítnout, že lupa je také spojná čočka a musí tedy zobrazovat stejně. To je sice pravda, rozdíl je ale v tom, že pozorovaný předmět je umístěn mezi ohniskovou vzdáleností a optickou rovinou spojné čočky, které teď říkáme lupa. V tomto uspořádání se reálný obraz nevytvoří. Obraz vznikne v naší mysli. Představa zobrazování lupou (tedy představa o vytvoření neskutečného, zvětšeného a nepřevráceného obrazu) je schematicky uvedena na obrázku 09. Lupa je tedy ono zvětšovací sklo, které umožní pozorovat předměty velikosti špendlíkové hlavičky, anebo nám zvětší písmenka, která jsou tak malá, že je bez lupy nepřečteme. Existují například knižní miniatury, které se prodávají i s příslušnou lupou. Je to ale i případ mikroskopu, kdy skutečný, převrácený a zvětšený obraz pozorujeme okulárem (což je vlastně lupa). V naší mysli ho pozorujeme jako neskutečný, přímý a zvětšený odraz. zdánlivý obraz předmět POZOROVATEL O f F F f Obrázek 09: Zobrazení lupou předmět je umístěn do prostoru ohniskové vzdálenosti. 10

1.4 Mikroskop Se znalostí zobrazování spojné čočky v obou variantách, tedy i lupy, a se znalostí lomu a odrazu si nyní můžeme rozebrat i chod paprsků v mikroskopu. Nejprve jeho hlavní prvky. Jak jsou umístěny, ukazuje obrázek mikroskopu s popisem (obr. 10). Obrázek 10: Kde najít jednotlivé části mikroskopu kritické osvětlení. 11

Stativ dříve se říkalo noha mikroskopu, ale můj učitel říkával: Pokud má mikroskop nohu, pak pouze proto, aby tě kopl, že mu ubližuješ. A měl pravdu. Hlavní mechanickou částí mikroskopu je stativ. Je to ono železo, na němž jsou vázány všechny ostatní části, ať již optické nebo mechanické. Stativ Světelný zdroj zajišťuje dobré osvětlení zorného pole mikroskopu, tedy té části preparátu, kterou právě zkoumáme. Může být pevně spojen se stativem mikroskopu, může být odnímatelný a znovu pevně nastavitelný ve stejné poloze, anebo u starších a starých typů nespojený pevně s mechanikou mikroskopu. V posledním případě je nutno světlo před prací nastavit a seřídit podle toho, co nám příslušný zdroj, např. slunce, dovolí. Součástí mechaniky světelného zdroje bývá tzv. polní clona. Ta vymezuje optimální svazek paprsků přicházejících ke kondenzoru (viz níže). Všechny nadbytečné paprsky odstraňuje, protože by svými odrazy dělaly obraz méně kvalitní. Zrcadlo zajišťuje odraz světelného zdroje (např. vlákna žárovky) k další optické soustavě, kterou je obvykle kondenzor (viz níže). Pochopitelně v mikroskopu může být zrcadel více. Obvykle jsou ve formě hranolů, polopropustných hranolů, polopropustných destiček - to záleží na výbavě mikroskopu. Protože se zabýváme pouze základy, mějme za zrcadlo pouze to, co nám vede cestu paprsků od světelného zdroje ke kondenzoru. Není-li světelný zdroj pevně spojen s mechanikou mikroskopu, pak zrcadlo vidíme obvykle jako kulaté a otáčivé v obou potřebných rovinách. Otáčení je nutné, hledáme-li vhodné světlo z cizího světelného zdroje. (Pochopitelně nemusíme hledat jenom světelný zdroj. Velmi brzy jsme ve škole dokázali seřídit mikroskop tak, že jsme pozorovali, jak pracují naše spolužačky (spolužáci)). Kondenzor Kondenzor je velmi důležitou optickou částí a říká se, že je tvůrcem dobrého obrazu s optimálním osvětlením a rozlišením. Jeho úkolem je promítnout obraz světelného zdroje do roviny preparátu a to v patřičné síle a bez zbytečných paprsků. Součástí kondenzoru bývá i aperturní clona, o které se zmíníme později. Existuje celá řada kondenzorů. Dělí se podle užití. My se pravidelně setkáváme s kondenzorem pro procházející světlo, někdy s kondenzorem pro fázový kontrast. To je již specielní zobrazování, pro nás však důležité, neboť nám umožňuje pozorovat organismy za živa, bez nutného barvení. Vidět řasy za 12

živa, sledovat jejich životní projevy a zaznamenávat změny během jejich životního cyklu, to je na laboratorní práci algologa to nekrásnější. Tím nechci podceňovat barvící techniky, ke kterým se také dostaneme. Stolek Stolek mikroskopu je ta část, na kterou klademe objekt ve formě preparátu. Musí zajistit rovinu a kolmost vzhledem k optické ose mikroskopu. To je jeho hlavní úkol. Tak byl také v minulosti chápán. Preparát byl držen svorkami a pohyb preparátem zajišťovaly ruce pozorovatele. Později přišly křížové stolky, které umožňují jemný pohyb preparátu ve směru podélném i příčném. A tak je známe dodnes. Preparát tak a teď budete v rozpacích. Copak je preparát optickým členem mikroskopu? Vidíte a je! Jen s tím rozdílem, že jeho optickou kvalitu určujeme sami svou Stolek šikovností při jeho přípravě. U ostatních optických členů nastavil optickou kvalitu někdo již při výrobě. Jak udělat kvalitní preparát si povíme v dalších kapitolách. Objektiv má výhradní postavení. Čím je kvalitnější, tím je naše pozorování přesnější. Musíme brát v úvahu, že jeho kvalita se musí shodovat s kvalitou ostatních Objektiv optických systémů mikroskopu. Vždyť nač by nám byl kvalitní objektiv bez kvalitního kondenzoru nebo s chybně nastaveným osvětlením? A to nemluvím o kvalitně zhotoveném preparátu, co nejtenčím a bez zbytečných přebytků zalévacího media, s čistým podložním i krycím sklem. Okulár je vlastně optický výstup mikroskopu, pomocí okulárů pozorujeme předmět na preparátu. Okulár Tubus je vzdálenost mezi objektivem a okulárem. U mikroskopu monokulárního je to jen trubka a pozorujeme pouze jedním okem. Tubus 13

Tubus u binokulárního mikroskopu je dán hranolovým systémem, který paprsky dělí do dvou okulárů. My potom pozorujeme oběma očima. Existuje ještě mikroskop trinokulární, kde je třetí výstup určen pro kameru. Obrázek 10a: Kde najít jednotlivé části mikroskopu osvětlení dle Köhlera. 14

1.4.1 Jak vzniká v mikroskopu obraz V předchozím textu jsme si vysvětlili úlohu optických členů pro konstrukci obrazu na základě pravidel geometrické optiky. To nám postačí pro pochopení vzniku obrazu v mikroskopu a k tomu, abychom uměli mikroskop dobře seřídit. Schéma chodu konstrukčních paprsků je na obr. 11. okulár předmět F objektiv F Fok skutečný obrácený zvětšený obraz O f POZOROVATEL F ok POZORUJEME zdánlivý obrácený zvětšený obraz Obrázek 11: Zobrazení mikroskopem jak pozorujeme obraz předmětu okulárem mikroskopu. 1.4.1.1. Zvětšení mikroskopu S pojmem rozlišovací schopnost a pojmem celkové zvětšení mikroskopu se setkáme velmi často. Je všeobecným omylem, že kvalita mikroskopu se pozná podle celkového zvětšení. To se určí snadno. Hodnota zvětšení uvedená na objektivu se vynásobí hodnotou zvětšení okuláru, popřípadě dalším faktorem uvedeným na binokulárním tubusu, a máme zvětšení daného optického páru. To nám ovšem nic neřekne o tom, jaké nejmenší detaily můžeme ještě rozlišit a jaké detaily už nerozlišíme. Z předchozího můžeme vyvodit, že velká zvětšení vyžadují, aby okulár i objektiv měly krátké ohniskové vzdálenosti. 15

1.4.1.2. Rozlišovací schopnost Rozlišovací schopnost závisí na rozlišovací schopnosti objektivu. Tu si můžeme přečíst na každém objektivu. Je to číslo uvedené pod zvětšením objektivu. Kvalitu mikroskopu (použitého zvětšení) charakterizuje tzv. rozlišovací mez. To je nejmenší vzdálenost dvou bodů, které ještě od sebe při pozorování rozlišíme. Na maličkých částicích mikroskopového preparátu se totiž světlo ohýbá, a tak se bod nezobrazuje jako bod, ale jako světelný kroužek. Z teorie ohybu vyvodil pan Abbe, že vzdálenost d mezi dvěma rozlišitelnými body je závislá na délce vlny záření, které dopadá na preparát kolmo a vyvodil vztah: d = vlnová délka / A, kde A je tzv. numerická apertura, daná dalším vztahem A= n * sin u, kde n je relativní index lomu prostředí mezi preparátem a objektivem, u je úhel mezi osou objektivu a krajním paprskem, který vystupuje z preparátu a je ještě zachycen objektivem. Z toho je zřejmé, že mikroskop rozliší blízké body tím lépe, čím užíváme kratší vlnové délky a čím větší je numerická apertura vyjadřující světelnou účinnost objektivu. To vysvětluje, proč se pro velká zvětšení klade mezi preparát a přední čočku objektivu kapalina o větším indexu lomu světla tzv. olejová imerze. 16

1.4.1.3. Dobré osvětlení a jeho nastavení Princip chodu paprsků v mikroskopu je uveden na obrázku 11. Ten ukazuje, že zrakem (pomocí okuláru) pozorujeme obrázek zdánlivý, obrácený a zvětšený. Plyne to z minulých zobrazení, kdy vlastně pozorujeme obraz skutečný, převrácený a zvětšený lupou, jejímž výsledkem je obraz zvětšený a zdánlivě přímý. 17

Praktické nastavení osvětlení a tím celého mikroskopu je poněkud komplikovanější. Rozeznáváme dva druhy osvětlení. Kritické a osvětlení podle Köhlera. Kritické osvětlení zobrazuje obrázek 12. zdroj světla aperturní clonka preparát objektiv ZRCADLO kondenzor Obrázek 12: Kritický způsob osvětlení aperturní clona kondenzoru slouží zároveň jako polní clona, omezující krajní paprsky. Osvětlovací systém je složen ze zrcátka, aperturní clony a kondenzoru. Zrcátko poskytuje pomocí odrazu rovnoběžný svazek paprsků, který je omezen aperturní clonou a kondensorem soustředěn do místa předmětu. Někdy je užíváno zrcátko vyduté, působící jako čočka, která soustřeďuje svazek paprsků ke kondenzoru. Nastavení je jednoduché. Na stolek mikroskopu vložíme preparát a pohybem hrubého ostření zaostříme na nějakou strukturu při menším zvětšení. Poté pohybem zrcátka nastavíme maximální osvětlení, které optimalizujeme pohybem kondenzoru. Poté vyjmeme okulár a ze vzdálenosti asi 25 cm pozorujeme zorné pole na zadní čočce objektivu. Pohneme-li aperturní clonou, uvidíme její pohyb do středu zorného pole. Rozevřeme ji tak, aby otevřela alespoň 9/10 zorného pole. Okulár vrátíme a pozorujeme, měníme zvětšení a světlo dále upravujeme. Osvětlení podle Köhlera (obr. 13) je dokonalý způsob, který zajišťuje při dobrém seřízení optimální osvětlení co do kvality i kvantity. Osvětlovací systém je složen ze světelného zdroje (obvykle speciální žárovka), sběrné čočky světelného zdroje, polní clony, aperturní clony a kondenzoru. 18

polní clonka aperturní clonka preparát zdroj světla objektiv sběrná čočka světelného zdroje Obrázek 13: Köhlerův princip osvětlení. obraz zdroje světla kondenzor Nastavení předpokládá několik kroků. Na stolek mikroskopu vložíme preparát a pohybem hrubého ostření zaostříme na nějakou strukturu při menším zvětšení. Pohybem sběrné čočky světelného zdroje promítneme obraz vlákna žárovky do roviny polní clony, přitom si pomáháme průsvitkou. Díváme se do okuláru (POZOR světlo může být příliš silné, je nutno je tlumit šedým filtrem) a posunem kondenzoru zaostříme obraz polní clonky v zorném poli. Je-li její obraz mimo střed zorného pole, provedeme její vycentrování justičními prvky na kondenzoru. Rozevřeme polní clonku tak, aby její okraj právě opustil zorné pole. Vyjmeme okulár a ze vzdálenosti asi 25 cm pozorujeme zorné pole na zadní čočce objektivu. Pohneme-li aperturní clonou, uvidíme její pohyb do středu zorného pole. Rozevřeme ji tak, aby otevřela alespoň 9/10 zorného pole. Okulár vrátíme a pozorujeme. Pro každé zvětšení je nutno tento postup korigovat v případě, že je naší snahou vidět všechny detaily, které nám užitá optika umožňuje svou rozlišovací schopností. Zvláště významné je to při pořizování fotozáznamů. 1.4.2 Neobvyklé způsoby mikroskopování Optická mikroskopie zaznamenala velký rozvoj, což je dáno rozvojem věd obecně. Pro naše skromné účely zatím postačí popsaná mikroskopie v procházejícím světle, která je pro algologa experimentátora v oblasti fyziologie řas nejdůležitější. Pozorujeme-li živé mikroorganismy, je užitečná 19

technika fázového kontrastu. Ta umožní pozorovat struktury buňky bez obarvení, a to během celého životního cyklu. Vyžaduje zvláštní optiku, kterou nahrazujeme optiku běžně užívanou. Podrobnostmi o této technice se nebudeme zabývat, jsou běžně k nalezení v literatuře. 1.4.3 Mikrofotografie Dokumentovat pozorované je součástí práce každého výzkumníka. Vedle kreslení, což je velmi důležitá technika, dnes poněkud podceňovaná, je mikrofotografie technikou nejobvyklejší. Schéma toho, jaký obraz pozorujeme (zdánlivý) a jaký obraz fotografujeme (skutečný) je uveden na obr. 14. Jistě si všechna pravidla na tomto obrázku zopakujete a uvědomíte si, co je k pořízení snímku potřeba. Asi si také vyvodíte, že máte-li fotoaparát zaostřen na nekonečno a výstupní pupila okuláru je přibližně stejných rozměrů jako vstupní pupila objektivu fotoaparátu (obvykle jako co největší ohnisková vzdálenost-teleobjektiv), můžeme pořídit snímek, sice nepříliš kvalitní, ale sloužící k hrubé orientaci a předloze pro kresbu. předmět objektiv skutečný obrácený zvětšený obraz okulár projektiv F ok SNÍMÁME KAMEROU F Fok 2F proj F 2F projektivu zdánlivý obrácený zvětšený obraz F projektivu POZORUJEME OKULÁREM Obrázek 14: Konstrukce reálného obrazu pro mikrofotografii co pozorujeme a co fotografujeme. Kvalitní fotografickou dokumentaci ovšem pořídíme pouze tehdy, jestliže jsme si vědomi, že snímáme reálný obraz v reálné vzdálenosti a reálným rozlišením. Dnes je možno pořídit pro fotografii nástavce na běžné digitální fotoaparáty, které zachytí obraz ve výborné kvalitě. Nástavec obvykle obsahuje optickou soustavu, která všechny požadavky na kvalitní záznam rozřeší. 20

Jinou oblastí je pořízení kinematografického záznamu technikou, které se říká mikrokinematografie. Jak název vypovídá, jde o techniku záznamu pohybu. Vědecká kinematografie se vyvíjela paralelně s vývojem technik filmu a její význam tkví zejména v popularizaci výsledků získaných v jiných vědeckých odvětvích. Na druhé straně je faktem, že celá řada buněčných mechanismů, zejména jejich dynamiky a kinetiky, byla objevena právě za pomoci mikrokinematografie. Můžeme se zařadit mezi výzkumníky, kteří budou navazovat na bohatou tradici a skvělé výsledky svých předchůdců? Jednoznačně můžeme konstatovat, že ano. Chce to pouze trpělivost, vůli stále se vzdělávat a sledovat literaturu oboru, který jsme si zvolili. Pochopitelně, že je nutné mít k disposici zařízení, které nám umožní pořizovat kontinuální záznam. Dále popíšeme postup a metodiky potřebné k pořízení časosběrného záznamu růstu mikroorganismů (např. řas, sinic, kvasinek, probiotických kultur). Pomůcky: (o vlastní laboratorní technice je pojednáno dále) mikroskop vybavený záznamem obrazu (fotoaparát ukládající snímky ve formátu JPG, či TIFF), pořizujeme-li záznam přesahující kapacitu paměťové karty, je třeba propojení s počítačem. kultivační komůrka (je možné sestavit na místě nebo využít hotových konstrukcí) kultivovanou suspenzi řasové kultury (možno i z přírodního, čerstvého sběru) počítač se softwarem skládajícím jednotlivé obrázky do sekvencí. Nejobtížnější je zajistit dobré kultivační podmínky během delší doby sledování. V případě některých organismů jsou to přibližně dva dny, během kterých dojde k dělení alespoň jedné buňky coenobia. Obr. 15 ukazuje schematicky několik jednorázových kultivačních komůrek, pomocí nichž můžeme pořídit krátkodobý záznam. Obrázek 15A ukazuje složení visuté kapky. Ta se hodí na pozorování při menším zvětšení. Ke stěnám distanční vložky je možno umístit kapku vody, aby preparát nevysychal. Montovaný preparát na obr 15B umožňuje pozorování při větších zvětšeních. Je-li pečlivě zhotoven, je možno dělat záznam i při imersním objektivu. Obrázek 15C ukazuje schéma Ranvierovy komůrky, která je vhodná pro dlouhodobější pozorování. Je-li těleso komůrky vysoké do dvou milimetrů, je možno použít i objektivy o větším zvětšení. Možností tvorby a konstrukce kultivačních komůrek je celá řada, některé jsou patentově chráněny. To platí zejména o konstrukcích, které umožňují průtok kultivačního media, měření teplot, ph a jiných parametrů, které jsou pro některé výzkumné úlohy nezbytné. Naše práce se však odehrává v prostředí, v němž pozorujeme životní projevy krátkodobě, zaznamenáváme je a obraz vyhodnocujeme pomocí statistických metod. 21

visutá kapka A krycí sklo suspenze organismů vazelínové těsnění podložní sklo organismy přirostlé na krycím skle montovaný preparát B suspenze organismů krycí sklo kapka vody vazelína tělo komůrky Ranvierova komůrka C Obrázek 15: Schéma jednoduchých kultivačních komůrek pro krátkodobou kultivaci v mikroskopu a pořízení kinematografického záznamu. 22

Obrázek 15a: Ukázka Ranvierovy komůrky vysoké 10 mm. Na obrázku 16 vidíte sestavu mikroskopu, kamery a kultivační komůrky, která umožnila výzkum životního cyklu mnoha mikroorganismů. Výsledek je možno vidět v přiloženém časosběrném záznamu. 23

Obrázek 16: Sestava mikroskopu, kamery, kultivační komůrky, eventuelně počítače se softwarem na časové ovládání kamery. Současné kamery umějí použít časosběrný režim bez nutnosti zapojení do počítače. Správně seřídit mikroskop a udělat kvalitní preparát je základem jakékoli mikroskopické práce. Jak ale správně připravit preparát pro optickou mikroskopii? Schéma je uvedeno na obrázku 17. objektiv krycí sklo cca 0,15 mm silné objekt v kapce vody kondenzor Obrázek 17: Schéma uložení preparátu na stolek optického mikroskopu Základem je podložní sklíčko. Sklo řádně očistíme a vyleštíme do sucha, neboť na čistotě použitých skel závisí kvalita výsledného obrazu. Na podložní sklo, asi doprostřed, umístíme malou kapku zkoumané buněčné suspense, nebo do kapky vody přeneseme zkoumaný objekt. Opatrně přiklopíme řádně očištěným a vyleštěným krycím sklíčkem a dbáme přitom na to, aby byl preparát bez bublin. Ty by byly vidět jako ostře ohraničené kruhy. Takto udělaný preparát vložíme na stolek mikroskopu, krycím sklem nahoru, směrem k objektivu. Jak jste asi z předchozího zjistili, použití objektivů o vysoké numerické apertuře je vázáno na přestup paprsků v podobném prostředí, tedy na prostředí o podobném indexu lomu, pokud chceme využít 24

rozlišovací schopnosti optiky. Imerzní technikou zvýšíme světelnost objektivu. Tato technika využívá imerzní tekutiny (imerzního oleje, vody přidané na podložní sklíčko), do které se vnoří objektiv optického mikroskopu. Tato technika je možná pouze s imerzním objektivem. paprsky, které jsou díky shodnému indexu lomu oleje a skla zachyceny optikou optika sklo objektivu index lomu 1,25 paprsek, který není optikou zachycen, protože index lomu vzduchu jej láme přechodové médium olej index lomu 1,51 olej vzduch index lomu 1,00 sklo Obrázek 18: Použití imerzního oleje. 25

2 Terénní odběry mikroorganismů Sběr přírodního materiálu a jeho dokumentace vyžadují naši pečlivost. Je nutné připravit si všechny pomůcky potřebné ke sběru materiálu a řádně je udržovat. Doporučujeme vytvořit si speciální odběrovou soupravu do terénu, včetně zápisníku a tužky. 2.1 Pomůcky ke sběru Pomůckou k odběru přírodního materiálu, může být jakýkoli nástroj, kterým oddělíme část vzorku, za účelem jeho pozdějšího podrobného studia. Během sběru vzorků jde vždy o (1) odběr na místě výskytu, (2) přemístění do vzorkovnice a (3) transport do laboratoře. Pokud nepředpokládáme studium živého materiálu a jeho následnou kultivaci, pak vzorek ve vzorkovnici ihned fixujeme (usmrtíme). Typem odběrových pomůcek se zabývá specializovaná literatura, pro naše účely postačí vyjmenovat několik základních. 1. Odběrové lahvičky (vzorkovnice, odběrovka) pro naše účely jsou vhodné pěti až desetimililitrové skleničky, někdy nazývané lékovky. Jsou skladné a mají obvykle dobře těsnící plastovou zátku. Můžeme ale použít i jiné lahvičky nebo zkumavky. Pro těsné uzavření může posloužit vhodná korková, či gumová zátka. Dbáme na to, aby hrdlo nebylo příliš úzké, abychom do odběrovky snadno vkládali větší části vzorku i delší vlákna. Pokud odebíráme vzorek vody s planktonem, pak je vhodnější asi půllitrová láhev, nejlépe z umělé hmoty, ta je nerozbitná. Opět by měla mít široké hrdlo pro pozdější snadnou manipulaci se vzorkem. 2. Miska na dělení vzorku - je velmi užitečná, potřebujeme-li si odebraný vzorek rozdělit, předběžně prohlédnout (třeba lupou) a do odběrovky přemístit jen tu část, která se nám zdá nejlepší. Pro tento účel skvěle vyhovuje petriho miska, ale může to být i jakákoli jiná miska, např. fotografická. 3. Lžička na škrábání nánosů na kamenech (bentosu). Vhodná je nerezová polévková lžíce, ale poslouží dobře nožík i pinzeta. 4. Pipetka na odběry planktonu výhodou je nerozbitná pipeta z umělé hmoty, která má zároveň i sací balonek. Pro odběry planktonu postačí menší pěti mililitrová. Pokud nemáme pipetu z plastu, postačí obyčejná skleněná, zakončená sacím balonkem, což může být obyčejný dětský dudlík. 5. Pinzeta pro odběr stačí hrubší pinzeta asi 15 cm dlouhá, seženeme-li delší, bude snadnější odebrat vzorek z nepřístupných míst. 6. Preparační tyčinky dobré pro práci v misce, když dělíme vzorek. Je vhodné mít alespoň dvě, dobře poslouží obyčejné špejle, ale preparační jehly jsou lepší. Ty si nakonec můžeme udělat sami. 26