Syphilis Total Ab 1 destička- 96 72530 5 destiček- 480 72531

Syphilis Total Ab 1 destička- 96 72530 5 destiček- 480 72531 SOUPRAVY PRO KVALITATIVNÍ DETEKCI PROTILÁTEK NA TREPONEMA PALLIDUM V LIDSKÉM SÉRU NEBO PLAZMĚ ZA POUŽITÍ IMUNOLOGICKÉHO TESTU 883679-2014/11

OBSAH 1. ÚČEL POUŽITÍ... 2 2. SHRNUTÍ A VYSVĚTLENÍ PRINCIPU TESTU... 2 3. ZÁSADY POSTUPU... 2 4. REAGENCIE... 3 5. VAROVÁNÍ A UPOZORNĚNÍ... 4 6. VZORKY... 5 7. POSTUP... 6 8. OMEZENÍ TESTU... 9 9. CHARAKTERISTIKY ÚČINNOSTI... 9 10. LITERATURA... 12 [CZ] 1

1. ÚČEL POUŽITÍ Tyto soupravy jsou určeny pro použití řádně proškolenými a kvalifikovanými pracovníky pro kvalitativní detekci protilátek na Treponema pallidum v lidském séru a plazmě. Výrobek lze použít pro screening dárců krve a jako diagnostická pomůcka u pacientů s podezřením na syfilis. 2. SHRNUTÍ A VYSVĚTLENÍ PRINCIPU TESTU Syfilis je chronická infekce, jejíž vývoj probíhá v několika stadiích: primárním, sekundárním, terciálním a kvartérním. Tato stadia se vyznačují různými klinickými příznaky, typicky se nejprve objeví boláky známé jako tvrdé vředy, poté syfilitická vyrážka, po které následuje dlouhé období klidu. Neléčená infekce může nakonec vést ke kardiovaskulárním problémům a neurosyfilis. Infekce je způsobena spirochetou Treponema pallidum a obvykle se přenáší pohlavním stykem, ačkoli je možný i přenos transfuzí nakažené krve. Rovněž dochází k přenosu z matky na nenarozené dítě (intrauterinní nákaza). Ukázalo se, že organismus nelze prakticky kultivovat v umělém médiu a diagnóza obvykle záleží na prokázání protilátek v krvi, které se objeví brzy po prvotní nákaze a mohou přetrvávat po mnoho let. Testy na syfilis se dělí do 4 kategorií: přímé mikroskopické vyšetření, test na treponemové protilátky, testy na netreponémové protilátky a přímé testy na antigeny. Kvůli dlouhému období latentní fáze onemocnění a nespecifické povaze netreponémových testů se metody, které odhalí specifické antitreponemální protilátky ve vzorcích krve, stávají pro účely screeningu stále populárnějšími. Syphilis Total Ab je jedním z těchto testů. 3. ZÁSADY POSTUPU Syphilis Total Ab používá tři rekombinantní antigeny v sandwichovém typu reakce. Antigeny odhalí IgG, IgM, a IgA specifické pro T. pallidum, což umožňuje odhalit protilátky během všech stadií nemoci. Jamky jsou potaženy směsí rekombinantních antigenů T. pallidum 15Kd, 17Kd a 47Kd. Specifické protilátky ve vzorcích séra nebo plazmy se váží na tyto antigeny a na stejné antigeny konjugované s křenovou peroxidázou, když je konjugát přidán do jamky, ve které byl inkubován vzorek. Po odstranění nezreagovaného materiálu promýváním je přítomnost vázaného enzymu indikujícího přítomnost specifických protilátek ve vzorku detekována změnou barvy v substrát/chromogenní směsi. Intenzita zabarvení je porovnána s intenzitou zabarvení v kontrolních jamkách pro stanovení přítomnosti či nepřítomnosti specifických protilátek. [CZ] 2

4. REAGENCIE 4.1. Popis Označení na štítku R1 R2 Mikrotitrační destička Koncentrovaný promývací roztok (20X) Popis Mikrotitrační destička 12 stripů v každém 8 jamek potažených rekombinantními antigeny (rag) T. pallidum Specifické ident. číslo = 97 Koncentrovaný promývací roztok (20X) Tris pufr NaCl, ph 7,4 Konzervant: ProClin 300 (0,04 %) Provedení / příprava 72530 1 destička Připraveno k použití 70 ml Ke zředění Provedení / příprava.72531 5 destiček Připraveno k použití 235 ml Ke zředění R3 Negativní kontrola Negativní kontrola Tris pufr obsahující BSA (hovězí sérový albumin) Konzervant: ProClin 300 (0,1 %) 2,1 ml Připraveno k použití 2,1 ml Připraveno k použití R4 R6 Pozitivní kontrola Konjugát Pozitivní kontrola (humánní) Humánní sérum obsahující protilátky na T. pallidum negativní na HIV1/2, HBs Ag a HCV rozředěné v tris pufru obsahujícím BSA Konzervant: ProClin 300 (0,1 %) Konjugát T. pallidum rag / peroxidáza Konzervant: ProClin 300 (0,05 %) 1,6 ml Připraveno k použití 8 ml Připraveno k použití 1,6 ml Připraveno k použití 30 ml Připraveno k použití R8 Substrátový pufr Substrátový pufr roztok kyseliny citronové a octanu sodného o ph 4,0 obsahující H 2 O 2 (0,015 %) a DMSO (4 %) 60 ml K rekonstituci 60 ml K rekonstituci R9 R10 Chromogen: roztok TMB (11X) Zastavovací roztok Chromogen: roztok TMB (růžový) Roztok obsahující 3,3, 5,5 tetrametylbenzidinu (TMB) Zastavovací roztok Roztok kyseliny sírové (H 2 SO 4 1N) 5 ml Ke zředění 28 ml Připraveno k použití 5 ml Ke zředění 28 ml Připraveno k použití 4.2. Požadavky na skladování a manipulaci Souprava by měla být uchovávána při teplotě +2 8 C. Každá jednotlivá položka soupravy, která byla uchovávána při doporučené teplotě, může být použita až do data exspirace uvedeného na obalu (pokud není uvedeno jinak). Po otevření a v případě, že nedošlo ke kontaminaci, mohou být reagencie R3, R4, R6, R8, R9 a R10, které byly uchovávány při předepsané teplotě, použity až do data exspirace uvedeného na obalu. [CZ] 3

Označení R1 R2 R8+R9 Uchovávání Po otevření vakuově uzavřeného balení mohou být mikrotitrační stripy uchovávány při teplotě 2 8 C po dobu 1 měsíce v pečlivě uzavřeném originálním balení. Připravený promývací roztok může být uchováván při teplotě +2 30 C po dobu 2 týdnů. Koncentrovaný promývací roztok (R2) může být uchováván při +2 30 C. Po rekonstituci lze reagencie, které byly uchovávány v temnu, použít po dobu 6 hodin při pokojové teplotě (18 30 C). 5. VAROVÁNÍ A UPOZORNĚNÍ Pro diagnostické použití in vitro. Pouze pro odborné použití. 5.1. Zdravotní a bezpečnostní opatření: Tato testovací souprava by měla být používána pouze kvalifikovanými pracovníky znalými laboratorních postupů a seznámenými s potenciálními riziky. Noste patřičné ochranné oblečení, rukavice a ochranu očí/obličeje a řiďte se nezbytnými pravidly správné laboratorní praxe. Testovací souprava obsahuje komponenty z lidské krve. Materiály lidského původu použité při přípravě reagencií byly testovány a byly shledány nereaktivními na povrchový antigen hepatitidy B (HBs Ag), protilátky proti virům lidské imunodeficience (HIV-1 a HIV-2) a protilátky proti viru hepatitidy C (HCV). Žádná známá metoda nedokáže poskytnout úplnou jistotu, že neobsahují infekční látky. Proto by se všemi deriváty lidské krve, reagenciemi a humánními vzorky mělo být nakládáno jako s potenciálně infekčními a dodržovat doporučená obecná opatření pro krevní patogeny, jak jsou definována místními, regionálními a národními předpisy. Únik biologického materiálu: s uniklým materiálem lidského původu by mělo být nakládáno jako s potenciálně infekčním. V případě úniku, pokud materiál neobsahuje kyselinu, by měla být okamžitě provedena dekontaminace místa úniku a jakýchkoli kontaminovaných povrchů nebo vybavení, a to patřičným chemickým dezinfekčním přípravkem, který je účinný pro případná biologická rizika související s danými vzorky (obecně přípravek typu Savo při ředění 1:10, 70 80% etanol nebo izopropanol, iodofor [jako 0,5% Wescodyne Plus] atd.), a poté usušení. Úniky obsahující kyselinu by měly být řádně absorbovány (vysušeny) nebo neutralizovány, místo opláchnuto vodou a vysušeno; materiály použité k absorbování uniklého materiálu může být nutné likvidovat v souladu s předpisy pro likvidaci nebezpečného odpadu. Poté by místo mělo být dekontaminováno některým z chemických dezinfekčních přípravků. POZNÁMKA: Nedávejte roztoky obsahující chlornan do autoklávu! Všechny vzorky a materiály použité pro provedení testu by měly být zlikvidovány jako potenciálně infekční materiál. S laboratorním, chemickým nebo biologickým odpadem musí být nakládáno a musí být likvidován v souladu s místními, regionálními a národními předpisy. Ohledně doporučení týkajících se rizik a prevence v souvislosti s některými chemickými složkami v této testovací soupravě odkazujeme na piktogram/y uvedené na štítcích a informace uvedené na konci návodu k použití. Bezpečností list je dostupný na www.bio-rad.com. [CZ] 4

5.2. Výstrahy týkající se postupu 5.2.1. Příprava Spolehlivost výsledků závisí na správné implementaci následujících osvědčených laboratorních postupů: Nepoužívejte reagencie po datu exspirace. V průběhu testu nemíchejte a nekombinujte reagencie různých šarží. Před použitím počkejte 30 minut, než se reagencie vytemperují na pokojovou teplotu (18 30 C). Název testu a specifické identifikační číslo pro test jsou napsány na rámečku každé mikrotitrační destičky. Toto specifické identifikační číslo je také uvedeno na každém stripu. Syphilis Total Ab: specifické identifikační číslo = 97 Před použitím ověřte specifické identifikační číslo. Pokud chybí nebo se liší od uvedeného čísla odpovídajícího analýze, která má být provedena, neměli byste tento strip použít. POZNÁMKA: Pro promývací roztok (R2, označení štítku: 20X, zabarvený zeleně), peroxidázový substrátový pufr (R8, označení štítku: pufr TMB, zabarvený modře), chromogen (R9, označení štítku: TMB 11X, zbarvený fialově) a ukončovací roztok (R10, označení štítku: 1N, zabarvený červeně), je možné použít jiné šarže než šarže obsažené v soupravě za předpokladu, že je stejná šarže použita v rámci probíhajícího testu. Tyto reagencie mohou být použity s některými dalšími produkty naší společnosti. Pro bližší informace kontaktujte náš technický servis. Reagencie pečivě rekonstituujte a zabraňte případné kontaminaci. Používejte skleněné nádoby, které jste důkladně umyli a opláchli deionizovanou vodou, nebo ještě lépe jednorázový materiál. Nedopusťte, aby mikrotitrační destička mezi ukončením promytí a distribucí reagencií uschla. Enzymatická reakce je velmi citlivá na kovové ionty. Nedopusťte tedy, aby se jakékoli kovové částice dostaly do kontaktu s roztoky konjugátu nebo substrátu. Vyvíjecí roztok (substrátový pufr + chromogen) musí být růžově zbarven. Změna této růžové barvy do několika minut po rekonstituci značí, že reagencii nelze použít a je třeba ji vyměnit. Přípravu vyvíjecího roztoku lze provést na čisté jednorázové plastové misce nebo skleněné nádobce, která byla nejprve předmyta 1 N HCl a důkladně opláchnuta destilovanou vodou a usušena. Tato reagencie musí být uchovávána v temnu. Nikdy nepoužívejte stejnou nádobku pro distribuci konjugátu a vyvíjecího roztoku. 5.2.2. Zpracování Neměňte postup analýzy. Neprovádějte test v přítomnosti reaktivních výparů (výpary kyselin, zásad, aldehydů) nebo prachu, které by mohly změnit enzymatickou aktivitu konjugátu. Pro každý vzorek použijte novou pipetovací špičku. Promytí jamky je kritickým krokem v této proceduře: dbejte doporučeného počtu promývacích cyklů a ujistěte se, že jsou všechny jamky zcela naplněny a poté zcela vyprázdněny. Nesprávné promytí může vést k nepřesným výsledkům. Pro dosažení maximální účinnosti testu dodržujte pečlivě popsaný promývací postup. Pro některé přístroje může být nutné optimalizovat promývací proces (vyšší počet cyklů promývání a/nebo objem promývacího pufru pro každý cyklus) za účelem dosažení přijatelné úrovně optické hustoty pozadí pro negativní vzorek. Ohledně adaptací a speciálních postupů kontaktujte naši společnost. 6. VZORKY Vzorky krve odebírejte v souladu s běžnou praxí. Testy by měly být provedeny na nezředěném séru nebo plazmě (odebrané na EDTA, citronan sodný, heparin sodný nebo ACD). Vzorky obsahující agregáty musí být před testováním vyčištěny v odstředivce. Vzorky by měly být uchovávány při teplotě +2 8 C, pokud je třeba testování provést do 7 dnů nebo při -20 C pro delší období. Neopakujte více než 5 cyklů zmrazení/rozmrazení. Lze použít vzorky, které byly tepelně ošetřeny při 56 C po dobu 30 minut. [CZ] 5

Vzorky obsahující až 120 g/l albuminu, 200 mg/l bilirubinu, 33 g/l trioleinu nebo 2 g/l hemoglobinu nikterak neovlivňují výsledky. Nicméně se nedoporučuje používat silně lipidemické nebo hemolyzované sérum či plazmu. Vzorky by před testováním měly být rozmrazeny a dobře promíchány. Pokud je třeba vzorky odeslat, musí být zabaleny v souladu s platnými předpisy týkajícími se přepravy etiologických činidel a přednostně ve zmrazeném stavu. 7. POSTUP 7.1. Potřebné materiály, které nejsou součástí dodávky destilovaná voda chlornan sodný (bělidlo) a bikarbonát sodný absorpční papír jednorázové rukavice bezpečnostní brýle jednorázové zkumavky automatické nebo poloautomatické, nastavitelné nebo přednastavené pipety nebo multipipety pro měření a dávkování 50 μl, 1 ml a 10 ml odměrné válce o objemu 100 ml a 1 l automatická, poloautomatická nebo manuální promývačka mikrotitračních destiček(*) inkubátor mikrotitračních destiček termostaticky nastavený na 37 C ±1 C (*) nádoba na biologický odpad spektrofotometr pro mikrotitrační destičky vybavený filtry 450, 490 nm a 620-700 nm (*) (*) Obraťte se na nás pro bližší informace ohledně vybavení doporučeného naším technickým oddělením. 7.2. Příprava reagencií 7.2.1. Reagencie připravené k použití Reagencie 1 (R1): Mikrotitrační destička Každý podpůrný rámeček, který obsahuje 12 stripů, je zabalen v hermeticky uzavřeném foliovém sáčku. Sáček rozstřihněte nebo rozřízněte skalpelem ve vzdálenosti 0,5 až 1 cm nad uzávěrem. Otevřete sáček a vyjměte rámeček. Vložte nepoužité stripy zpět do sáčku. Pečlivě jej uzavřete a vložte jej zpět na místo uchovávání při teplotě +2 8 C. Reagencie 3 (R3): Negativní kontrola Reagencie 4 (R4): Pozitivní kontrola Reagencie 6 (R6): Konjugát Před použitím homogenizujte převracením. Reagencie 10 (R10): Zastavovací roztok 7.2.2. Reagencie k rekonstituci Reagencie 2 (R2): Koncentrovaný promývací roztok (20X) Rozřeďte v poměru 1:20 v destilované vodě a získejte promývací roztok připravený k použití. Připravte 800 ml na jednu destičku s 12 stripy. Reagencie 8 (R8) + Reagent 9 (R9): Enzymatický vyvíjecí roztok Nařeďte chromogen (R9) v substrátovém pufru v poměru 1:11 (tedy 1 ml reagencie R9 + 10 ml R8) za předpokladu, že pro 12 stripů je třeba 10 ml. Homogenizujte. 7.3. Postup testování Bezpodmínečně dodržujte postup. Použijte negativní i pozitivní sérové kontroly pro každý test s cílem validovat kvalitu testu. [CZ] 6

Dodržujte následující zásady správné laboratorní praxe: 1) Pečlivě připravte distribuci vzorků a plán identifikace. 2) Připravte si rozředěný promývací roztok R2. 3) Z ochranného balení vyjměte podpůrný rámeček a nezbytný počet stripů (R1). Nepoužité stripy vložte zpět do obalu. Obal zavřete a vraťte na místo s teplotou +2 8 C. 4) Napipetujte do jamek v následujícím pořadí (doporučená distribuce): 50 µl negativní kontroly (R3) do A1, B1, C1 50 µl pozitivní kontroly (R4) do D1, E1 50 µl nerozředěného vzorku do každé jamky F1, G1 atd. 50 µl konjugátu (R6) do každé jamky V závislosti na použitém systému je možné upravit pozici kontrol nebo pořadí pipetování. Homogenizujte reakční směs pomocí minimálně 3 nasátí nebo pomocí míchačky na mikrotitrační destičky po dobu 5 vteřin. POZNÁMKA: Pipetování vzorku a kontrol může být během tohoto kroku vizuálně zkontrolováno. Je rozdíl ve zbarvení mezi prázdnou jamkou a jamkou obsahující vzorek. Konjugát dávkujte během 5 minut po pipetování vzorků. Je zde jasný rozdíl ve zbarvení mezi prázdnou jamkou a jamkou obsahující červený roztok konjugátu (R6) (viz 7.7) 5) Pokud je to možné, zakryjte destičku novým přilnavým filmem. 6) Inkubujte mikrotitrační destičku po dobu 30 až 35 minut při 37 C ± 1 C. 7) Pokud je to nutné, odstraňte adhezivní film. Odsajte obsah všech jamek do nádobky na tekutý odpad a do každé jamky přidejte minimálně 370 μl promývacího roztoku. Znovu odsajte a minimálně 4krát opakujte promývání (celkem 5 promývacích cyklů). Zbytkový objem musí být nižší než 10 μl (pokud je to nutné, vysušte stripy tím, že je položíte dnem vzhůru na absorpční papír). Pokud máte automatickou promývačku, dodržte stejný provozní cyklus. POZNÁMKA: Přistupte k promytí do 20 minut. 8) Připravte si vyvíjecí roztok (reagencie R8 + R9). 9) Rychle nadávkujte do každé jamky 50 μl připraveného vyvíjecího roztoku (R8 + R9), který jste připravili těsně před použitím. Nechte reakci probíhat v temnu po dobu 25 až 35 minut při pokojové teplotě (18 30 C). Nepoužívejte přilnavý film po dobu inkubace. POZNÁMKA: Během tohoto kroku lze vizuálně kontrolovat pipetování růžového vyvíjecího roztoku. Je zde jasný rozdíl ve zbarvení mezi prázdnou jamkou a jamkou obsahující růžový roztok (viz 7.7). 10) Přidejte 50 μl zastavovacího roztoku (R10) a použijte stejné pořadí a rychlost pipetování jako pro substrátový roztok. Homogenizujte reakční směs. POZNÁMKA: Pipetování bezbarvého zastavovacího roztoku lze v této fázi manipulace vizuálně kontrolovat. Barva substrátu růžová (pro negativní) nebo modrá (pro pozitivní vzorky) se z jamek ztratí a po přidání zastavovacího roztoku se změní na bezbarvou (pro negativní vzorky) nebo žlutou (pro pozitivní vzorky). 11) Pečlivě osušte dna všech destiček. Počkejte alespoň 4 minuty po přidání zastavovacího roztoku a do 30 minut po ukončení reakce odečtěte optickou hustotu 450/620 690 nm za použití spektrofotometru. 12) Zkontrolujte shodu mezi spektrofotometrickým a vizuálním odečtem a oproti distribuci destičky a vzorku a plánu identifikace. [CZ] 7

7.4. Kontrola kvality Použijte negativní (R3) a pozitivní (R4) kontroly pro každou sérii s cílem validovat výsledky testů (viz 7.5). 7.5. Kritéria validace testu Tento test je validní, pokud jsou splněny podmínky uvedené níže: 1) Pro negativní kontrolu R3: OD (optická hustota) R3 0,080 Pokud jedna kontrola přesahuje tuto hodnotu, můžete ji vyloučit a proveďte výpočet se dvěma zbývajícími hodnotami negativní kontroly. 2) Pro pozitivní kontrolu R4: OD R4 0,700 7.6. Výpočet / interpretace výsledků Hodnota cut-off se určuje pomocí negativní kontroly R3: Vypočtěte průměrnou naměřenou hodnotu absorpce pro negativní kontrolu R3 a hodnotu cut-off (COV) následujícím způsobem: COV = průměr OD R3 + 0,100 Vzorky s OD nižší než COV jsou považovány u Syphilis Total Ab za negativní. Výsledky těsně pod hodnotou COV (COV -10 % < OD < COV) by však měly být interpretovány opatrně. Doporučuje se provést opětovné testování odpovídajících vzorků v dubletu, pokud to systémy a laboratorní postupy dovolí. Vzorky s OD vyšší než nebo rovnou COV jsou považovány u Syphilis Total Ab za pozitivní a měly by být opětovně testovány v dubletu před konečnou interpretací. Opětovně testované vzorky, které přesahují COV alespoň v jednom duplikátu jsou považovány za pozitivní a měly by být dále zkoumány. Vzorky, které jsou pod COV v obou duplikátech, jsou považovány za negativní. V případě velmi nízké optické hustoty pro testované vzorky (negativní OD), a pokud je kontrolována přítomnost vzorků stejně jako reagencie, mohou být výsledky interpretovány jako negativní. Doporučuje se provést konfirmaci pozitivních vzorků podle platných národních doporučení a algoritmů. 7.7. Spektrofotometrická verifikace pipetování vzorku a konjugátu (volitelné) Vzorky a kontroly Přítomnost vzorků a kontrol v jamkách může být ověřena automatickým odečtem při 450/620 nm. Jamka s přidaným vzorkem bude mít OD mezi 0,050 a 1,100. Konjugát Konjugát je zbarven červeně. Přítomnost konjugátu v jamkách může být kontrolována automatickým odečtem při 450/620 nm. Jamka se vzorkem a konjugátem bude mít OD 1,200. Ověření pipetování vyvíjecího roztoku Je možné ověřit přítomnost růžového vyvíjecího roztoku v jamce automatickým odečtem při 492 nm. Jamka s vyvíjecím roztokem musí mít optickou hustotu >0,100 (nižší OD indikuje chybné pipetování vyvíjecího roztoku) [CZ] 8

8. OMEZENÍ TESTU Jako u všech sérologických testů na syfilis musí být interpretace výsledků získaná analýzou Syphilis Total Ab EIA použita ve spojení s klinickými symptomy pacienta, jeho anamnézou a jinými laboratorními nálezy pro vytvoření celkové klinické diagnózy. Pro každý stupeň nemoci není k dispozici žádný jednotlivý test nebo konečný referenční standard. Diagnóza syfilis tudíž spoléhá převážně na sérologické testování, což vyžaduje výsledky získané netreponemovými a treponemovými metodami. Žádný diagnostický test neposkytuje absolutní jistotu, že vzorek neobsahuje nízké hladiny protilátek proti T pallidum, a to takové, jaké se nacházejí u velmi raného stadia infekce. Kdykoli získaný negativní výsledek tedy nevylučuje možnost ohrožení infekcí syfilis. Metoda ELISA může vést ke vzniku falešně pozitivní reakce. Doporučuje se zkontrolovat specifičnost reakce všech vzorků, které se projevují jako opakovaně pozitivní, a to podle interpretačních kritérií soupravy Syphilis Total Ab za použití vhodné metody: hemaglutinační test Treponema pallidum. Všechny výsledky treponemového testu zůstávají i nadále reaktivní u probíhající treponemové infekce, tudíž by neměly být používány pro hodnocení odezvy na léčbu. Kvůli přetrvávající reaktivitě, zpravidla po celý život pacienta, nemají treponemové testy žádný význam při určování relapsu nebo opětovné infekce u pacienta, který měl reaktivní výsledek. V tomto případě se doporučuje použít jiné testy: Syphilis IgM EIA, RPR a TPHA. Spektrofotometrická metoda ověřující nadávkování vzorku, konjugátu a vyvíjecího roztoku neumožňuje ověřit přesnost napipetovaného množství vzorku a konjugátu. Tato metoda ukazuje pouze na přítomnost vzorku a konjugátu. Stupeň chyby této metody je úzce spojen s přesností použitého systému (kumulovaný variační koeficient nad 10 % pro pipetování a odečet výrazně snižuje kvalitu tohoto kroku). 9. CHARAKTERISTIKY ÚČINNOSTI 9.1. Preciznost měření Opakovatelnost a mezilehlá preciznost byly určeny za použití vzorků s různými koncentracemi protilátek proti syfilis. Tyto vzorky byly testovány 30krát během stejné série testů pro stanovení opakovatelnosti. Vzorky byly rovněž testovány v dubletu během 20 dnů při četnosti 2 testy za den. Byl proveden výpočet poměru středních hodnot, standardních odchylek a variačních koeficientů (CV). 9.1.1. Opakovatelnost: Vzorky N Střední hodnota podílů Standardní odchylka CV % Slabě negativní 30 0,14 0,014 9,5 % Silně negativní 30 0,68 0,051 7,5 % Slabě pozitivní Syphilis ab 30 1,90 0,070 3,7 % Pozitivní Syphilis ab 30 3,76 0,130 3,5% Hodnoty CV získané z pozitivních vzorků jsou nižší než 10 %. [CZ] 9

9.1.2. Mazilehlá preciznost Vzorky Slabě negativní Silně negativní Slabě pozitivní Syphilis ab Pozitivní Syphilis ab N Střední hodnota podílů Opakovatelnost (intra-assay) Reprodukovatelnost (inter-assay) Mezi následujícími dny Celková reprodukovatelnost SD CV % SD CV % SD CV % SD CV % 80 0,15 0,035 22,5 % 0,023 14,7 % 0,017 10,9 % 0,045 29,0 % 80 0,74 0,038 5,1 % 0,074 10,0 % 0,006 0,8 % 0,084 11,2 % 80 2,30 0,112 4,9 % 0,312 13,5 % 0,099 4,3 % 0,346 15,0 % 80 4,13 0,180 4,3 % 0,543 13,1 % 0,195 4,7 % 0,604 14,6 % Hodnoty CV získané z pozitivních vzorků jsou nižší nebo rovny 15 %. 9.2. Klinická účinnost Klinická účinnost testu Syphilis Total Ab je určena testováním vzorků z prospektivních a retrospektivních studií: Prospektivní studie: - 5195 vzorků od náhodně vybraných dárců krve; - 460 vzorků od pacientů, u kterých bylo podezření na syfilis Retrospektivní studie: - 350 pozitivních od pacientů STD Studie byly prováděny na 2 pracovištích pro darování krve, v centru pro sexuálně přenosné choroby (STD centrum) a na pracovišti Bio-Rad. 9.2.1. Diagnostická specificita Studie byla provedena na vzorcích séra a plazmy EDTA odebraných ve 2 krevních bankách od náhodně vybraných dárců ve Francii. Rovněž byla provedena studie specificity na vzorcích od pacientů. Všechny výsledky byly porovnány s výsledky získanými pomocí jiných testů na syfilis se značkou CE. Tabulka1: Test specificity (IR = reaktivní na počátku; RR= opakovaně reaktivní) Populace Pracovišt ě Typ vzorku Celkový počet vzorků IR RR RR specificita (%) 95% CI (%) Sérum SST 3127 2 2* 3125/3125 Dárci krve #1 + #2 Plazma EDTA K2 2068 2 2* 2066/2066 Celkem 5195 4 4* Pacienti #3 Sérum 351 1 1 100 % 5191/5191 99,72 % 350/351 99,93 % - 100% 98,42 100% *Opakovaně reaktivní vzorky, jež byly shledány pozitivní pomocí testu EIA Syphilis se značkou CE byly vyloučeny z kalkulace diagnostické specifičnosti. [CZ] 10

9.2.2. Diagnostická citlivost Retrospektivní studie: Studie byla provedena na 350 zmrazených vzorcích, z nichž 2 byly prohlášeny za negativní a 348 potvrzeno jako pozitivní pomocí testů na syfilis se značkou CE. Mezi těmito 348 pozitivními vzorky bylo 7 vzorků od pacientů v rané fázi onemocnění. Všech 348 vzorků bylo shledáno pozitivními pomocí testu Bio-Rad Syphilis Total Ab. Prospektivní studie: Testem Bio-Rad Syphilis Total Ab bylo vyhodnoceno celkem 460 čerstvých vzorků a porovnáno s testy na syfilis se značkou CE. 348 bylo shledáno negativními jak pomocí testu Bio-Rad, tak i pomocí testů referenčních (se dvěma vzorky vyhodnocenými jako falešně pozitivní pomocí referenční metody EIA) 109 bylo shledáno pozitivními pomocí obou testů. 3 vzorky ukázaly rozdílné výsledky (po opětovném testování pomocí testu Bio-Rad): 1 vzorek pozitivní pomocí testu Bio-Rad a vysoce negativní pomocí referenčních testů. Tento vzorek s nízkým podílem syfilis byl na limitní hodnotě cut-off pro oba testy EIA: 1 vzorek pozitivní pomocí referenčních testů, negativní pomocí testu Bio-Rad (od jednoho pacienta bez příznaků) 1 vzorek pozitivní pomocí referenčních testů, negativní IR a pozitivní opakovaný test pomocí testu Bio-Rad Retrospektivní a prospektivní studie: Celková diagnostická citlivost se rovná 99,56 % (457/459) s intervalem spolehlivosti 95 % [98,44 99,95 %]. Klinická citlivost Na 3 komerčních panelech a 1 sérokonverzním panelu byla rovněž provedena studie klinické citlivosti. Test Bio-Rad Syphilis Total Ab byl porovnán s testem na syfilis se značkou CE. Detekce každého vzorku z panelů je ekvivalentní mezi testem Bio-Rad a referenčním testem na syfilis. 9.3. Analytická citlivost Analytická citlivost byla zhodnocena na 2 standardech NIBSC a vypočítána na hodnotu cut-off pomocí regresní analýzy. 1. Limit detekce pro IgG / IgM byl stanoven na 3 šaržích testu Syphilis Total Ab assay a odhadnut na 0,53 miu/ml s CI 95 % [0,10 miu/ml 1,30 miu/ml] za použití standardu IgM/IgG dle WHO (kód NIBSC: 05/132). 2. Limit detekce pro IgG byl stanoven na 1 šarži Syphilis Total Ab Assay a odhadnut na 0,11 miu/ml s CI 95% [0,02 miu/ml 0,27 miu/ml] za použití standardu WHO pro IgG (kód NIBSC: 05/122). 9.4. Analytická specificita / studie zkřížené reaktivity Testem Syphilis Total Ab bylo testováno celkem 125 potenciálně interferujících vzorků obsahujících protilátky proti patogenům, které by mohly vést k infekčním nemocem (lymská borelióza, toxoplazmóza, EBV, leptospiróza, SLE (lupus), hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, HTLV I/II a HIV), vzorky od pacientů z rizikové skupiny (těhotné a vícerodičky) nebo vzorky od pacientů s onemocněním imunitního systému (revmatoidní faktory) Mezi 125 testovanými vzorky byl shledán 1 vzorek opakovaně pozitivní pomocí testu Syphilis Total Ab; tento vzorek byl konfirmován jako pravdivě pozitivní pomocí dalších konfirmačních testů a metodou Syphilis EIA se značkou CE. Specificita zjištěná u cílové populace se rovná 100 % (124/124) s 95% intervalem spolehlivosti [97,1 100,0%]. [CZ] 11

9.5. Hook efekt Existence možného hook efektu byla studována testováním 6 vzorků pozitivních na syfilis s vysokými titry při různém ředění. Ekvivalence výsledků zjištěná mezi neředěnými a ředěnými vzorky ukazuje, že hook efekt není na testovaných vzorcích přítomen. 10. LITERATURA 1. Levinson SS. The Nature of Heterophilic Antibodies and Their Role in Immunoassay Interference. J. Clin. Immunoassay 15: 108-115,1992. 2. Norris S.J. Plypeptides of Treponema pallidum: Progress toward understanding their structural, functional and immunological role. Microbiological Reviews, Setpt. 1993 Vol 57. 3. Larsen SA, Steiner BM, and Rudolph AH. Laboratory diagnosis and interpretation of tests for syphilis. Clin Microbiol Rev. 1995 Jan; 8(1):1 21. 4. Zrein M, Maure I, Boursier F, Soufflet L. Recombinant antigen-based enzyme immunoassay for screening of Treponema pallidum antibodies in blood bank routine. J Clin Microbol. 1995 Mar; 33(3):525 7. 5. Singh AE and Romanowski. Syphilis: Review with emphasis on clinical, epidemiological, and some biologic features. Clin Microbiol Rev. 1999 Apr; 12(2):187 209. 6. Stability of selected serum proteins after long-term storage in the Janus Serum Bank. Clin Chem Lab Med. 2009. 47:596-606. 7. International Journal of STD & AIDS 2009; 20: 300 309. 8. Screening donated Blood for Transfusion-Transmissible infections. World Health Organization. 2009 9. M. J. Loeffelholz, and M. J. Binnicker, It Is Time to Use Treponema-Specific Antibody Screening Tests for Diagnosis of Syphilis, J Clin Microbiol, 50 (2012), 2-6. [CZ] 12

[CZ] 13

[CZ] 14

[CZ] 15

[CZ] 16

Bio-Rad 3, Boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette Francie Tel.: +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax: +33 (0) 1 47 41 91 33 2014/11 www.bio-rad.com 883679 [CZ] 17