Metody molekulární genetiky v mikrobiologii Pavel Dřevínek
Plán semináře: rozdíly mezi klasickou a molekulární mikrobiologií výhody a nevýhody molekulárního přístupu jak funguje detekce a identifikace přes DNA: PCR kdy uvažovat o indikaci k molekulárnímu vyšetření - detekce jednoho určitého agens - detekce jakéhokoli agens - kvantifikace agens PCR diagnostika hledá se konkrétní patogen hledá se patogen, předem není stanoveno jaký
Plán semináře: rozdíly mezi klasickou a molekulární mikrobiologií výhody a nevýhody molekulárního přístupu jak funguje detekce a identifikace přes DNA: PCR kdy uvažovat o indikaci k molekulárnímu vyšetření - detekce jednoho určitého agens - detekce jakéhokoli agens - kvantifikace agens jak funguje identifikace přes MALDI TOF molekulární epidemiologie - genotypizace příklady ze života
Klasická mikrobiologie: přímý průkaz - kultivace, mikroskopie, antigeny nepřímý průkaz - protilátky zjišťování citlivosti na antibiotika Molekulární mikrobiologie: přímý průkaz - DNA či RNA; proteiny žádný nepřímý průkaz detekce jednotlivých genů rezistence, popis genomu
Kultivace vs. molekulární genetika Princip detekce a identifikace Klasika celý organismus, metabolicky aktivní MG DNA či RNA Výhody MG: vyšší rychlost provedení záchyt organismů, které nelze kultivovat, jejichž kultivace je náročná záchyt bez ohledu na způsob růstu (biofilm) záchyt při podávané ATB léčbě Nevýhody MG: často chybí informace o tom, zda jsou bakterie živé není k dispozici živý izolát, např. pro určení ATB citlivosti
Kultivace vs. molekulární genetika Klasika MG ATB citlivost komplexní jednotlivé geny rezistence Nevýhody MG: chybí komplexní obraz, MIC meca: MRSA vana: VRE karbapenemázy - KPC - NDM-1 - IMP - VIM
VanA-type glycopeptide resistance. Van operon přenášený na transpozonu
Kultivace vs. molekulární genetika Sensitivita Klasika MG srovnatelná či vyšší u mol. gen. vyšetření Výhody MG: záchyt malého počtu agens (infekce dříve diagnostikována) Nevýhody MG: riziko falešné pozitivity (kontaminace)
Kultivace vs. molekulární genetika Klasika MG Kvantifikace orientační absolutní Výhody MG: určení infekční nálože sledování dynamiky infekce
Souhrn výhod molek. genetiky Výhody Rychlost vyšetření Vysoká specificita Často vyšší senzitivita Úskalí Ale nebývá non-stop provoz laboratoří Stačí PCR nález ke změně ATB léčby? Nelze detekovat ty mikroby, které nejsou součástí diagnostické soupravy Riziko falešné pozitivity Kvantifikace Záchyt při podávané ATB te Nejedná se o záchyt DNA z rozpadlých buněk? Záchyt pomalu rostoucích mikrobů Chybí izolát Nelze stanovit citlivost ke všem ATB
Plán semináře: rozdíly mezi klasickou a molekulární mikrobiologií výhody a nevýhody molekulárního přístupu jak funguje detekce a identifikace přes DNA: PCR kdy uvažovat o indikaci k molekulárnímu vyšetření - detekce jednoho určitého agens - detekce jakéhokoli agens - kvantifikace agens jak funguje identifikace přes MALDI TOF molekulární epidemiologie - genotypizace příklady ze života
Detekce zaměřena na nukleotidovou sekvenci primer ACGGCATTCGGCAACTGTGCACTTGGACATATACA TGCCGTAAGCCGTTGACACGTGAACCTGTATATGT Jak vypadá výsledek PCR primer Jak vypadá výsledek sekvenace
Jaké jsou možné cílové oblasti DNA pro PCR? varianta A primery mikrob 1 mikrob 2 mikrob 3 ACGGCATTCGGCAACTGTGCACTTGGACATATACA TATACA ACGGCATTCGGCAACTGTGCACTTGGACATATACA TATACA ACGGCATTCGGCAACTGTGCACTTGGACATATACA TATACA
Jaké jsou možné cílové oblasti DNA pro PCR? varianta B primery mikrob 1 mikrob 2 mikrob 3 ACGGCATTCGGCAACTGTGCACTTGGACATATACA TATACA ACGGCATTCGATTACTGTACACTTGCCCATATACA TATACA ACGGCATTCGTCCACAGTGCACTTGGACATATACA TATACA
Jaké jsou možné cílové oblasti DNA pro PCR? varianta C primery mikrob 1 mikrob 2 mikrob 3 ACGGCATTCGGCAACTGTGCACTTGGACATATACA TATACA ACTGCATT ACGGCATTCGATTACTGTACACTTGCCCATATACA AATACA ACGGCAAA ACGGCATTCGTCCACAGTGCACTTGGACATATACA GATACA
Jaké jsou možné cílové oblasti DNA pro PCR? varianta D primery mikrob 1 ACGGCATTCGGCAACTGTGCACTTGGACATATACA TATACA mikrob 2 mikrob 3
A B C D mikrob 1 mikrob 2 mikrob 3
Plán semináře: rozdíly mezi klasickou a molekulární mikrobiologií výhody a nevýhody molekulárního přístupu jak funguje detekce a identifikace přes DNA: PCR kdy uvažovat o indikaci k molekulárnímu vyšetření - detekce jednoho určitého agens - detekce jakéhokoli agens - kvantifikace agens jak funguje identifikace přes MALDI TOF molekulární epidemiologie - genotypizace příklady ze života
PCR diagnostika hledá se konkrétní patogen Patogen specifické PCR
Důvod použití patogen specifického PCR pomalý (žádný) růst složitá identifikace vysoká citlivost biohazard Příklad Mycobacterium tuberculosis Bordetella pertussis Pneumocystis jiroveci Původci bakter. meningitid Chlamydia trachomatis Neisseria gonorrhoeae Clostridium difficile Staphyloccocus aureus (MRSA) respirační viry (influenza)
Nemá náhodou pacient černý kašel? (potřeba detekovat bordetelu, ostatní mikroorganismy mě nezajímají)
A B C D bordetela chlamydia mycoplasma cílová sekvence pro primery musí být unikátní pro bordetelu PCR DETEKCE + IDENTIFIKACE bordetely
Plán semináře: rozdíly mezi klasickou a molekulární mikrobiologií výhody a nevýhody molekulárního přístupu jak funguje detekce a identifikace přes DNA: PCR kdy uvažovat o indikaci k molekulárnímu vyšetření - detekce jednoho určitého agens - detekce jakéhokoli agens - kvantifikace agens jak funguje identifikace přes MALDI TOF molekulární epidemiologie - genotypizace příklady ze života
PCR diagnostika hledá se patogen, předem není stanoveno jaký Broad range PCR Broad range PCR neboli panbakteriální PCR
Důvod použití broad range PCR rychlá detekce vysoká citlivost pomalý (žádný) růst Příklad sepse endokarditidy
Horečka. Jedná se o infekční proces? Co je jeho příčinou? (potřeba detekovat kteroukoliv bakterii, protože kterákoli bakterie může způsobit sepsi)
A B C D S. aureus S. epidermidis E. faecalis cílová sekvence pro primery je přítomna u všech bakterií
A B C D S. aureus S. epidermidis E. faecalis PCR (16S rdna ) + sekvenace DETEKCE IDENTIFIKACE
Výsledek sekvenace PCR produktu: S. aureus C T G A
Výsledek sekvenace PCR produktu: C T G A
Výsledek broad range 16S PCR vzorky z kardiovaskulární chirurgie: ID materiál 16S / 18S sekvenace kultivace 1 trikuspidální chlopeň Staphylococcus aureus negativní 2 aortální chlopeň Bartonella quintana negativní 3 aortální chlopeň Enterococcus faecalis negativní 4 trikuspidální chlopeň Staphylococcus aureus negativní 5 mitrální chlopeň Streptococcus anginosus negativní 6 mitrální chlopeň Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus 7 trikuspidální chlopeň negativní negativní 8 trikuspidální chlopeň Staphylococcus aureus negativní 9 aortální chlopeň Bartonella quintana negativní 10 mitrální chlopeň Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis 11 aortální chlopeň Enterococcus faecium negativní 12 trikupidální chlopeň Enterococcus faecium negativní 13 mitrální chlopeň Candida glabrata Candida glabrata 14 aortální chlopeň Enterococcus faecalis negativní 15 mitrální chlopeň Staphylococcus aureus negativní 16 chlopeň Bartonella quintana negativní
Pacientka 65 let OA: před 11 měsíci reimplantace TEP kyčle NO: bolest v místě kyčle trvající 4 dny Fyzikální vyšetření: fluktuující ložisko 5x5 cm laboratoř: CRP 195 klindamycin + levofloxacin po výsledku kultivace ampicilin/sulbaktam + levofloxacin datum materiál 16S sekvenace kultivace 30.1.2015 punkce ložiska - hnis nezasláno k vyšetření E. coli 5.2.2015 tkáň během operační revize kloubu negativní S. epidermidis po pomnožení 5.2.2015 punktát během operační revize E. coli negativní 11 dní po operaci dimise; CRP 69
Plán semináře: rozdíly mezi klasickou a molekulární mikrobiologií výhody a nevýhody molekulárního přístupu jak funguje detekce a identifikace přes DNA: PCR kdy uvažovat o indikaci k molekulárnímu vyšetření - detekce jednoho určitého agens - detekce jakéhokoli agens - kvantifikace agens jak funguje identifikace přes MALDI TOF molekulární epidemiologie - genotypizace příklady ze života
Důvod kvantifikace cestou MG exaktní Příklad herpesviry u imunosuprimovaných HIV HCV
Kolik má pacient po transplantaci kostní dřeně kopií viru EBV?
přístroje real time PCR (kvantitativní PCR) primer sonda ACGGCATTCGGCAACTGTGCACTTGGACATATACA TGCCGTAAGCCGTTGACACGTGAACCTGTATATGT primer
přístroje real time PCR (kvantitativní PCR)
ředicí řada (standardy o definované kvantitě) 10 7 10 6 10 5 10 8 10
EBV detekce pomocí PCR Log of viral qu uantity in 100 000 GE Log virové nálo ože na 100 000 g.e. 1.E+077 1.E+066 1.E+05 5 1.E+04 4 1.E+03 3 1.E+02 2 1.E+011 1.E+000 1.E-01 ND LPD 0 20 40 60 80 100 120 Days Dny after po HSCT DNA DNA from z plné whole krve blood
Plán semináře: rozdíly mezi klasickou a molekulární mikrobiologií výhody a nevýhody molekulárního přístupu jak funguje detekce a identifikace přes DNA: PCR kdy uvažovat o indikaci k molekulárnímu vyšetření - detekce jednoho určitého agens - detekce jakéhokoli agens - kvantifikace agens jak funguje identifikace přes MALDI TOF molekulární epidemiologie - genotypizace příklady ze života
Nový fenomén v klinické mikrobiologii: Hmotnostní spektrometrie Identifikace přes proteiny
MALDI-TOF Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight - identifikace narostlé bakteriální kultury - rychlost identifikace v minutách - zrychlení diagnostiky o desítky hodin - široká škála mikroorganismů (2150 rodů) - přesnost, reprodukovatelnost nálezu - v ČR 35 přístrojů
Plán semináře: rozdíly mezi klasickou a molekulární mikrobiologií výhody a nevýhody molekulárního přístupu jak funguje detekce a identifikace přes DNA: PCR kdy uvažovat o indikaci k molekulárnímu vyšetření - detekce jednoho určitého agens - detekce jakéhokoli agens - kvantifikace agens jak funguje identifikace přes MALDI TOF molekulární epidemiologie - genotypizace příklady ze života
Epidemiologie infekcí: Odhalení epidemie Odhalení přenosného (epidemického) kmene?
Taxonomie Rod Druh Kmen
Druh Kmen strain strain strain strain strain
Identifikace kmene sekvence je jedinečná pro daný kmen kmen 1 kmen 2 kmen 3 A B C D genotypizace
Princip genotypizace Analýza bakteriálních genů (genomu) Odhad příbuznosti mezi izoláty téhož druhu Geneticky Klinicky + = Epidemický blízké izoláty blízké izoláty kmen
Metody genotypizace Gel (image)-based - Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) - PCR metody - Random amplified polymorphic DNA analysis (RAPD) - rep-pcr (repetitive elements: ERIC, REP, BOX) - Amplified fragment length polymorphism analysis (AFLP) - Ribotypizace
Metody genotypizace Sequence-based - Multilocus sequence typing (MLST)
Plán semináře: rozdíly mezi klasickou a molekulární mikrobiologií výhody a nevýhody molekulárního přístupu jak funguje detekce a identifikace přes DNA: PCR kdy uvažovat o indikaci k molekulárnímu vyšetření - detekce jednoho určitého agens - detekce jakéhokoli agens - kvantifikace agens jak funguje identifikace přes MALDI TOF molekulární epidemiologie - genotypizace příklady ze života
Centrum cystické fibrózy (300 pacientů) 2001 - zavedena PCR diagnostika bakterií Burkholderia cepacia - 30 % pacientů s pozitivním nálezem 1998 - kultivační diagnostika odhalila cca 15 % pozitivních pacientů - vyčleněna samostatná ambulance jen pro cepaciové pacienty infikovaných pacientů do 1999 - pořádání letních táborů pro nemocné CF 30%
RAPD
MLST ID atpd gltb gyrb reca lepa phac trpb ST 1 16 11 10 14 11 6 79 32 2 16 11 10 14 11 6 79 32 3 16 11 10 14 11 6 79 32
infikovaných pacientů Kmen ST-32 30% 96%
Princip izolačního režimu v centrech CF: Žádný pacient s CF by se neměl setkat s druhým pacientem s CF. Zvláště rizikové je setkání dvou pacientů s odlišným mikrobiologickým nálezem. 1. pacienti bez infekce (nekolonizovaní) 2. pacienti s infekcí Pseudomonas aeruginosa 3. pacienti s infekcí Burkholderia cepacia
Globální rozšíření ST32
Vysvětlení jevu?
Vysvětlení jevu?
Vysvětlení jevu?
Další příklady ze života
Epidemie P. aeruginosa Hematoonkologie (Itálie), oddělení otevřeno v březnu 2006 červen 2007: 2 zemřelí v jednom týdnu - kmen PA, shodný ATBgram uzavření jednotky epidemiologické šetření - retrospektivní studie - prospektivní studie - identifikace asymptomatických případů - HCW - audit hygienických pravidel - kontrola prostředí
Retrospektivní analýza březen 2006 - červen 2007 78 pts 10 případů hetegenní profil 3 izoláty stejný profil
Prostředí: 29 vzorků (desinfekce, odpady, umyvadla, sprchy ) P. mendocina P. aeruginosa P. aeruginosa P. aeruginosa P. stutzeri
pacienti dávkovač mýdla odpady umyvadla
Epidemie E. coli E. coli O104:H4 ~ (EHEC, EAEC), STEC květen 2011 Německo 3,842 případů - 2,987 GI 18 úmrtí - 855 HUS 35 úmrtí
STEC O104:H4 příčina: klíčky/výhonky? (nikoli maso x EHEC 0157:H7) časem zaznamenán i interhumánní přenos sekvenovaný genom: původ v EAEC, ovšem zde navíc gen stx horizontální transfer - kombinace faktorů virulence EHEC (profág) a EAEC (plazmid) specifické PCR
EAEC + profág s genem pro Shiga toxin = STEC O104:H4
Závěrem V klinické praxi mají molekulární metody své místo v předem definovaných situacích - toho, co se špatně kultivuje - tam, kde se jedná o rychlost: infekce u kritických stavů - tam, kde zůstává podezření na infekční etiologii, ale bez pozitivního nálezu