Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin Biologicky aktivní aminy ve vybraných fermentovaných potravinách živočišného původu Dizertační práce Vedoucí práce: Prof. MVDr. Ing. T. Komprda, CSc. Vypracovala: Mgr. Kateřina Novická Brno 2010

Prohlášení Prohlašuji, že jsem dizertační práci na téma Biologicky aktivní aminy ve vybraných fermentovaných potravinách živočišného původu vypracovala samostatně a použila jen pramenů citovaných v přiloženém seznamu použité literatuty. Dizertační práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího dizertační práce a děkana AF Mendelovy univerzity v Brně. Dne Podpis doktoranda.

Děkuji panu prof. MVDr. Ing. Tomáši Komprdovi, CSc za odborné vedení, všestrannou pomoc a cenné rady, které mi při zpracování dizertační práce poskytoval. Dále bych ráda poděkovala za spolupráci Ing. P. Pechové, PhD.

Obsah 1 Úvod... 8 2 Literární přehled... 9 2.1 Biogenní aminy - definice, struktura... 9 2.2 Vznik BA v potravinách... 11 2.3 Fyziologický význam BA... 14 2.4 Toxicita BA... 15 2.4.1 Toxicita histaminu... 16 2.4.2 Toxicita tyraminu... 18 2.4.3 Toxicita diaminů a polyaminů... 19 2.5 Výskyt BA v potravinách... 19 2.5.1 Ryby a rybí výrobky... 20 2.5.2 Sýry... 21 2.5.3 Maso a masné výrobky... 23 2.5.4 Potraviny rostlinného původu... 24 2.5.5 Pivo a víno... 25 2.6 Hygienické limity pro BA v potravinách... 26 2.7 Metody stanovení BA v potravinách... 27 2.8 Faktory ovlivňující vznik BA v sýrech... 31 2.8.1 Kvalita suroviny a způsob jejího ošetření... 31 2.8.2 Kontaminující mikroorganizmy... 33 2.8.3 Startovací kultury... 37 2.8.4 Fyzikálně-chemické faktory... 39 2.8.5 Část sýra... 42 3 Cíl práce... 43 4 Materiál a metodika... 44 4.1 Materiál... 44 4.1.1 Přírodní zrající sýry... 44 4.1.2 Tavené sýry... 45 4.2 Analýza biogenních aminů... 46 4.3 Mikrobiologický rozbor... 49 4.4. Statistické vyhodnocení... 50

5 Výsledky a diskuze... 52 5.1 Analytická metoda... 52 5.2 Biogenní aminy v přírodních polotvrdých zrajících sýrech holandského typu (Eidam)... 53 5.2.1 Vliv doby zrání na obsah biogenních aminů... 55 5.2.2 Distribuce biogenních aminů v sýrech... 62 5.2.3 Vliv výrobce a startovací kultury na obsah biogenních aminů... 70 5.3 Biogenní aminy v tavených sýrech... 78 6 Závěry... 85 7 Seznam použité literatury... 88 8 Přílohy... 106 9 Anotace... 112

Summary Biogenic amines (BA; histamine, tyramine, tryptamine, 2-phenylethylamine, cadaverine) and polyamines (PA; putrescine, spermidine, spermine) content was determined within 6 months of ripening in the edge and core part of Dutch-type semihard cheese using the reverse phase high performance liquid chromatography method with spectrofotometric detection. Cheeses were produced by two different producers (R30 and R45 cheese) using pasteurized milk and different starter culture (FD and CH, in the case of the R30 cheeses) and differed in their fat content (30 % and 45 % of fat in dry matter). Tyramine, putrescine and phenylethylamine were quantitatively the most important amines in cheese samples, their contents after 22nd week of ripening varied in the range 15.7 299.8 and 6.0 60.8, and 1.0 54.3 mg kg 1, respectively. Tyramine content increased linearly (P<0.01) with increasing time of ripening both in R30-FD and R30-CH and R45 cheese, concentration of tyramine in the R45 cheese after 18 weeks of ripening exceeded a toxicological limit. Therefore, the R45 cheese cannot be recommended for the groups of consumers at risk (allergic individuals, patients taking monoamine oxidase inhibotors). Also sum of all BA increased significantly (P<0.01) in all cheeses within the whole ripening period. Substantially higher (P<0.01) contents of tyramine and the sum of biogenic amines were found after 8th week of ripening in the outer-part samples in comparison with the core ones in the R30 cheeses. Also higher (P<0.01) counts of lactic acid bacteria, total anaerobs and total aerobic and facultative anaerobic microorganisms were found in outer parts of the R30 cheeses within the ripening interval. Tyramine, putrescine, phenylethylamine, and sum of all BA contents in R45 cheese were significantly higher (P<0.05) after 18th and 22nd week of ripening in comparison with R30-FD and R30-CH cheeses. However, the counts of all evaluated groups of microorganisms were substantially higher (P< 0.05) in both R30 cheeses after 22nd week of ripening. Contents of biogenic amines and polyamines were also determinated in the samples of processed cheese, a possible effect of heat treatment (pasteurisation and sterilisation), storage time (22 and 57 weeks) and storage temperature (8 C and 25 C) of the samples on amines content was tested.

In all cases, tyramine was quantitatively the most important biogenic amine (1.3 29.3 mg kg -1 ), the highest level (P<0.05) was found in pasteurized processed cheese stored 22 weeks after processing at 8 C. The contents of all evaluated amines were generally very low, regardless of tyramin, the content of no biogenic amine exceeded 2.5 mg kg -1 and it can be concluded that processed cheese represents no health hazard regarding biogenic amines content even when stored long-term at room temperature.

1 Úvod V potravinách existuje řada problematických složek, které mohou představovat zdravotní rizika pro spotřebitele, a z tohoto důvodu je otázce bezpečnosti potravin věnována stále větší pozornost. Problematika potravinových reakcí vstupuje stále více i do povědomí laické veřejnosti, která velmi často hledá příčinu svých zdravotních obtíží právě v potravinách. Mezi často sledované nežádoucí složky potravin patří v poslední době i biogenní aminy, které mohou být za určitých okolností příčinou alimentárních otrav. Biogenní aminy vznikají v procesu výroby a skladování potravin jako výsledek metabolického působení mikroorganizmů, ve vyšším množství se nachází v rybách a fermentovaných výrobcích jako jsou sýry, trvanlivé salámy, pivo, víno, či kysané zelí. Sledování obsahů biogenních aminů je však významné nejen z hlediska ovlivnění zdravotní nezávadnosti potravin, ale i z hlediska možnosti posouzení kvality potravin, neboť vysoké koncentrace biogenních aminů se vyskytují u potravin v pokročilém stupni kažení. Sýry jsou významnou složkou jídelníčku většiny evropských zemí, v České republice se jejich roční spotřeba pohybuje kolem 10 kg na osobu. Jelikož rozhodující cestou vzniku biogenních aminů je dekarboxylace přirozených aminokyselin působením bakteriálních dekarboxyláz, představují sýry díky své vysokoproteinové povaze a fermentačním procesům během výroby ideální prostředí pro jejich tvorbu. S konzumací sýrů jsou tak spojovány jedny z nejčastějších intoxikací biogenními aminy. Preventivním opatřením vzniku biogenních aminů v sýrech může být jednak testování bakterií startovacích kultur na dekarboxylázovou aktivitu, ale především zamezení nežádoucí kontaminace dekarboxylačními bakteriemi. K omezení tvorby biogenních aminů v sýrech může výrazně přispět i znalost faktorů ovlivňujících růst a aktivitu těchto mikroorganizmů, stejně jako činnost jejich proteolytických a dekarboxylačních enzymů. 8

2 Literární přehled 2.1 Biogenní aminy - definice, struktura Biogenní aminy (BA) jsou nízkomolekulární bazické sloučeniny vznikající dekarboxylací přirozených aminokyselin působením živých organismů, příp. aminací a transaminací aldehydů a ketonů (Silla Santos, 1996). Jsou to dusíkaté organické báze syntetizované v rámci mikrobiálního, rostlinného i živočišného metabolizmu (Ladero et al., 2010a). V potravinách bylo identifikováno přibližně 30 vazoaktivních a psychoaktivních aminů (Standara et al., 2000). Přehled nejvýznamnějších BA uvádí obr.1. Podle struktury se uvedené BA člení na aromatické (tyramin TYR a fenylethylamin FEA), heterocyklické (histamin HIS a tryptamin TRY) a alifatické diaminy a polyaminy (putrescin PUT, kadaverin KAD, spermin SPM a spermidin SPD; Ladero et al., 2010a). Spermin, spermidin a putrescin se však vzhledem ke svým specifickým biologickým vlastnostem řadí do zvláštní skupiny označované jako přirozené (fyziologické) polyaminy (PA). Polyaminy jsou velmi stabilní sloučeniny odolné vůči teplu, kyselinám i zásadám. Jsou to flexibilní polykationty, při fyziologickém ph mohou na svých aminoskupinách vytvářet 2-4 kladné náboje. Díky nim interagují s negativně nabitými strukturami buněčného povrchu a jsou schopny řady specifických funkcí (Gugliucci, 2004; Kalač a Krausová, 2005). 9

N CH 2 CH 2 NH 2 CH 2 CH 2 NH 2 N H Histamin N H Tryptamin CH 2 CH 2 NH 2 HO CH 2 CH 2 NH 2 Fenylethylamin Tyramin H 2 N ( C H 2 ) 4 N H 2 H 2 N ( C H 2 ) 5 N H 2 Putrescin Kadaverin H 2 N C N H N H A g m a t i n ( C H 2 ) 4 N H 2 H 2 N ( C H 2 ) 3 N H ( C H 2 ) 4 N H 2 S pe r m i di n H 2 N ( C H 2 ) 3 N H ( C H 2 ) 4 N H ( C H 2 ) 3 N H 2 S pe r m i n Obrázek 1. Přehled nejvýznamnějších biogenních aminů vyskytujících se v potravinách 10

2.2 Vznik BA v potravinách Biogenní aminy v potravinách mohou být buď přirozenou součástí buněčných struktur rostlin nebo mohou vznikat v procesu výroby a skladování potravin jako výsledek metabolického působení mikroorganizmů (Greif et al, 1999). Rozhodující cestou vzniku BA je dekarboxylace přirozených aminokyselin působením bakteriálních dekarboxyláz (Křížek a Kalač, 1998; Pereira et al., 2009; obr.2). dekarboxylace R CH COOH R CH 2 NH 2 -CO 2 NH 2 aminokyselina biogenní amin Obrázek 2. Nejběžnější způsob vzniku biogenních aminů. Takto vzniká histamin z histidinu, tyramin z tyrosinu, 2-fenylethylamin z fenylalaninu, tryptamin z tryptofanu a kadaverin z lysinu. Polyaminy putrescin, spermin a spermidin jsou tvořeny z methioninu a argininu, klíčovými enzymy této biosyntézy jsou ornithin dekarboxyláza a S-adenosylmethionin dekarboxyláza (Kusano et al., 2008; obr.3). 11

Methionin ATP 5) MAT 1) S-adenosyl-methionin Argináza Arginin Ornithin ADC 3) CO 2 Agmatin AdoMetDC 2) CO 2 Dekarboxylovaný S-adenosylmethionin ODC 4) CO 2 PUTRESCIN Agmatináza SPERMIDIN 5 -methyladenosin SPERMIN Spermin syntáza Obrázek 3. Schéma vzniku polyaminů (Hillary, Pegg, 2003) 1) methioninadenosyltransferáza 2) S-adenosylmethionindekarboxyláza 3) arginindekarboxyláza 4) ornithindekarboxyláza 5) adenosin-trifosfát Významným předpokladem tvorby BA je proteolýza (autolytická či bakteriální), jež je při zrání sýrů považována za jeden z nejdůležitějších pochodů ovlivňujících kvalitu sýra. Pro tvorbu významnějšího množství biogenních aminů jsou potom nezbytné následující podmínky (Fernández et al., 2007; Landete et al., 2007; Bover-Cid et al., 2008): dostupnost volných aminokyselin jako prekurzorů, přítomnost mikroorganizmů vybavených dekarboxylázami aminokyselin, podmínky umožňující růst mikroorganizmů, biosyntézu dekarboxyláz a jejich aktivitu. Mikroorganizmy produkující dekarboxylázy mohou být přirozenou součástí produktů, popřípadě se do potravin dostávají před vlastním technologickým zpracováním, během nebo po ukončení výroby (úmyslné použití startovacích kultur, náhodná kontaminace; Shalaby, 1996; Komprda et al., 2008a). Schopnost dekarboxylovat jednu, či více aminokyselin má řada bakteriálních druhů, včetně bakterií 12

mléčného kvašení (BMK). Jedná se zejména o rody Bacillus, Citrobacter, Clostridium, Escherichia, Klebsiella, Micrococcus, Photobacterium, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Shigella a BMK rodu Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus a Streptococcus (Silla Santos, 1996; Leuschner et al, 1999; Arena et al., 2001; Wolken et al., 2006; Pereira et al., 2009). Přestože mléčné bakterie vykazují v porovnání s aerobními mikroorganizmy nižší dekarboxylační aktivitu, jejich podíl na tvorbě biogenních aminů v sýrech je vzhledem k vysokým populacím dosahovaných během zrání významný (Fernández-García et al., 2000; Settani a Moschetti, 2010). Charakteristickými mikroorganizmy produkující biogenní aminy v sýrech jsou tak především Lactobacillus buchneri, Lb. bulgaricus, Lb. plantarum, Lb. casei, Lb. acidophilus, Lb. arabinosa, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Streptococcus facieum, S. mitis, Bacillus macerans a Propionibacterium spp. (Shalaby, 1996; Bonetta et al., 2008; Komprda et al., 2008a; Buňková et al., 2010). Schopnost bakteriálních enzymů dekarboxylovat aminokyseliny se může lišit nejen v rámci jednoho rodu, ale i mezi jednotlivými kmeny daného druhu. Proto je téměř nemožné nalézt přímou korelaci mezi množstvím biogenních aminů a celkovým počtem mikroorganizmů (Halasz et al., 1994; Wolken et al., 2006). Vzhledem k různorodosti bakteriálních druhů a kmenů se potom liší i podmínky pro vlastní tvorbu biogenních aminů, jako jsou teplota, přítomnost kyslíku, ph, či obsah chloridu sodného (Křížek a Kalač, 1998). Většina aminů včetně histaminu je tepelně stálá. Rovněž některé dekarboxylázy zůstávají aktivní i po pasteraci, takže obsah BA může následně vzrůstat i během skladování potravin (Brink et al., 1990). Dle Davídka a Davídka (1995) lze obsah biogenních aminů již přítomných v potravinách snížit následujícími způsoby: přídavkem enzymu diaminooxidázy oxidovat BA za přítomnosti kyslíku na aldehydy, přídavkem sacharidů umožnit rekci s aminy vedoucí k neenzymovému hnědnutí, vyluhovat část aminů do varné lázně, pokud se nekonzumuje. Autoři Mohamed et al. (2009) sledovali vliv přidaných organických i anorganických sloučenin (kyselina askorbová, kyselina citronová, glukóza), přidaného mléka, jogurtu, různých druhů džusů a koření na snížení obsahu HIS a TYR v rajčatech, banánech, jahodách, mangu a čokoládě. Nejvýraznějších výsledků dosáhli autoři působením 13

kyseliny askorbové a citronové. Přidání mléka, jogurtu nebo limetkového džusu do jahod vedlo také k výraznému snížení obsahu HIS i TYR. Uvedené možnosti lze však využít jen v omezené míře, rozhodující je předcházet vzniku biogenních aminů. Obecně lze obsah BA v potravinách omezit používáním hygienicky nezávadných surovin a dodržováním přísné hygieny během jejich zpracování, což následně vede k potlačení kontaminujících bakterií. Při použití startérových bakteriálních kultur omezujících spontánní fermentaci je nutno vybírat takové kmeny, jež nejsou vybaveny dekarboxylázami (Carminati et al., 2010). 2.3 Fyziologický význam BA Biogenní aminy syntetizované lidským organizmem zde plní řadu důležitých metabolických funkcí. Kromě jejich biologického významu, coby zdroje dusíku a prekurzorů syntézy hormonů, nukleových kyselin a proteinů, mají i vlastní farmakologické účinky (Ladero at al., 2010a). Jedním z nejvýznamnějších biologicky aktivních biogenních aminů je histamin. Vykazuje účinky jak psychoaktivní, tak vazoaktivní. Za normálních podmínek je skladován ve speciálních granulích žírných buněk a bazofilů, v případě potřeby se uvolňuje do krevního oběhu a působí prostřednictvím vazby na histaminové receptory (H1, H2, H3, H4) buněčných membrán. Histamin hraje prvotní úlohu coby mediátor alergických reakcí a zánětu, stimuluje hladkou svalovinu dělohy, střeva a respiračního traktu, působí snížení krevního tlaku, zvyšuje permeabilitu malých cév, zvyšuje sekreci kyseliny chlorovodíkové v žaludku. HIS také přispívá k regulaci tělesné teploty, ovlivňuje denní a noční biorytmy, proces učení i paměť(maintz a Nowak, 2007, Ladero et al., 2010a). Tyramin, tryptamin a fenylethylamin patří rovněž mezi vazoaktivní aminy, oproti histaminu však působí vazokonstrikčně. Tyramin působí na uvolňování noradrenalinu ze sympatického nervového systému, což prostřednictvím periferní vazokonstrikce a zvýšením srdečního výkonu vede ke zvýšení krevního tlaku. Tyramin dále ovlivňuje dilataci zornice, sekreci slz a slin, zvyšuje respiraci a zvyšuje hladinu krevního cukru (Shalaby, 1996; Vlieg-Boerstra et al., 2005). Polyaminy putrescin, spermin a spermidin se v těle účastní řady anabolických pochodů zahrnujících syntézu DNA, RNA a proteinů, a jsou tak nepostradatelné pro 14

stabilizaci buněčných membrán, pro buněčný růst a proliferaci (Seiler, 1992; Kalač et al., 2005; Larque et al., 2007). Právě z důvodu úzkého vztahu polyaminů k rychle rostoucím a proliferujícím buňkám je v posledních letech zaměřena velká pozornost na jejich úlohu při nádorovém bujení. Organizmus využívá jak polyaminy endogenní, tak i ty přijímané potravou. Užívání léků s inhibičním účinkem na biosyntézu polyaminů (především inhibice enzymu ornithindekarboxylázy) v kombinaci s omezenou konzumací potravin obsahující vysoké hladiny polyaminů se proto jeví jako vhodná součást terapie onkologických pacientů (Seiler, 2003a, b; Gerner, E.W., 2010; Önal, A., 2010). Podle autorů Forshell et al. (2010) se jako slibný cíl terapie B-buněčného lymfomu jeví kromě výše uvedené inhibice ornithindekarboxylázy také inhibice enzymu spermidinsyntházy. Zvýšené nároky na příjem polyaminů mohou být především v období intenzivního růstu, jako jsou pooperační stavy, hojení ran či regenerace jater. Polyaminy rovněž ovlivňují správný vývoj střevní sliznice i ostatních orgánů trávicího traktu novorozenců a napomáhají udržení vysoké metabolické aktivity normálně fungujícího střeva a jeho imunologického systému u dospělých jedinců (Kalač a Krausová, 2005; Pérez-Cano, F.J. et al., 2010). Podle řady studií (Peulen et al., 2004, Weiss et al., 2004) se ovlivnění metabolismu polyaminů jeví jako slibný cíl prevence či terapie zánětlivých onemocnění trávicího traktu (např. hepatitida, pankreatitida, ulcerózní kolitida, Crohnova choroba). SPM, SPD a PUT se také výrazně podílejí na antioxidačním mechanizmu buňky, neboť jsou schopny zhášet volné radikály (Fujisawa, Kadoma, 2005). 2.4 Toxicita BA Přestože biogenní aminy jsou v lidském organizmu potřebné pro řadu fyziologických funkcí, konzumace potravin s jejich vysokým obsahem může vést až k toxickým účinkům (Ladero et al., 2010a). Klinický průběh těchto intoxikací bývá obvykle mírný a symptomy mizí během několika hodin, přesto u některých jedinců mohou vést k vážným zdravotním komplikacím. Důležitá je především velikost konzumované porce, neboť již např. minimální množství dlouho zrajícího sýra může tyto potíže zapříčinit (McCabe-Sellers et al., 2006). Za normálních okolností jsou BA přijímané potravou odbourávány účinným enzymatickým systémem monoaminooxidáz (MAO MAO A a MAO B) a 15

diaminooxidáz (DAO), v případě histaminu se účastní i N-methyltransferáza. Aminooxidázy jsou hojně přítomny ve střevním epitelu gastrointestinálního traktu, nacházejí se ale i v játrech, plících, krevních destičkách, slinivce a ledvinách (Vlieg- Boerstra, 2005). Histamin-N-methyltrasferázy se v nejvyšší míře nachází v játrech a ledvinách, tyto enzymy jsou však rovněž přítomny např. ve střevě, průduškách, či průdušnici (Maintz a Nowak, 2007). Činností výše uvedených enzymů se do systémového oběhu dostávají pouze neškodné oxidační produkty a nízké dávky BA tak nepředstavují zdravotní riziko. Aktivita aminooxidáz však může být negativně ovlivněna řadou faktorů jako je genetická porucha enzymu, zdravotní stav jedince (detoxikační schopnost organismu se zhoršuje při některých onemocněních), konzumace alkoholu (alkohol snižuje účinek DAO), či užívání některých léčiv (Wöhrl et al., 2004; Ladero et al., 2010a). Z hlediska tyraminu představují riziko např. léčiva ze skupiny psychofarmak, tzv. inhibitory MAO (označované též jako thymoeretika nebo energizéry) užívané jako antidepresiva. Neselektivně a ireverzibilně působící inhibitory MAO (např. tranylcypromin) již v České republice nejsou registrovány. V současné době se z inhibitorů MAO používají pouze antidepresiva, jež selektivně blokují pouze MAO-A (moclobemid, obchodním názvem Aurorix). Inhibitory MAO-B jsou i léčiva s účinnou látkou selegilin (Jumex, resp. Cognitiv) a rasagilin (Azilect) používaná v terapii Parkinsonovy choroby. Inhibiční efekt na MAO má také hypericin (hlavní účinná složka standardizovaného extraktu z třezalky tečkované užívaného rovněž při depresích), některé flavonoidy nebo chemoterapeutikum isoniazid (obchodním názvem Nidrazid) používané k léčbě tuberkulózy (Anders, 2009). Aktivitu enzymu DAO, jež se podílí na odbourávání KAD, PUT a HIS snižují např. léky s obsahem ambroxolu (obchodním názvem Mucosolvan, Ambrobene, Ambrosan) nebo acetylcysteinu (ACC, Mucobene, Solmucol), používané jako expektorancia, tj. pro usnadnění vykašlávání (Kalač a Křížek, 2002). Metabolizmus HIS ovlivňují i některá léčiva ze skupiny antihypertenziv (Verapamil), analgetik (Acylpyrin), diuretic (Amilorid) nebo antibiotik (Cefuroxim; Maintz a Nowak, 2006). 2.4.1 Toxicita histaminu Histamin je z BA přítomných v potravinách nejtoxičtější, histaminové otravy tak patří jednoznačně k nejzávažnějším. V lidském organizmu zasahuje HIS do řady metabolických funkcí, proto se i intoxikace projevují širokou škálou symptomů. 16

Zahrnují projevy kožní (vyrážky, kopřivka, otoky, lokalizované záněty), gastrointestinální (nevolnost, nadýmání, zvracení, průjmy, křeče v břiše) a řadu dalších jako jsou hypotenze, bušení srdce, závratě, bolesti hlavy (u osob trpících migrénami, ale i u osob zdravých), či pálení a brnění v ústech (Ekici et al., 2002). Inkubační doba histaminových otrav je velmi krátká (obvykle 5 30 minut po požití), příznaky potom odeznívají během několika hodin. Osoby s intolerancí histaminu mohou mít potíže již v průběhu konzumace potraviny, či alkoholického nápoje obsahující vysoké koncentrace tohoto aminu. Projevy mohou být mírné (sekrece z nosu, otok nosní sliznice), v extrémním případě může dojít až k astmatickému záchvatu (Maintz a Nowak, 2007). V řadě případů bývají intoxikace HIS zaměňovány s alergickými reakcemi na potraviny. Kritériem rozlišení jsou potom údaje anamnézy. Zjišťuje se dřívější výskyt alergie na stejnou potravinu, zda došlo k projevům u větší skupiny jedinců a zda u dané potraviny lze předpokládat vyšší obsah HIS (Ettlerová a Kohout, 2000). V případě intoxikace histaminem lze podat antihistaminika na bázi cetirizinu (Zodac, Zyrtec, Analergin), loratidinu (Claritin) či des-loratidinu (Xyzal), symptomy by měly odeznít do 10 až 15 minut po podání. Intoxikace mohou být následkem vysokého příjmu HIS potravou, či snížením aktivity detoxikačních enzymů (alkohol, inhibitory DAO, některá onemocnění). Rovněž současný příjem KAD a PUT může vést ke zvýšení hladiny HIS v krvi, neboť afinita DAO k oběma diaminům je ve srovnání s HIS podstatně vyšší a dochází tak k vyčerpávání kapacity DAO pro histamin (Taylor, 1986). Podle některých autorů (King et al, 2000; Vlieg-Boerstra, 2005; Meintz a Nowak, 2007) existuje navíc předpoklad, že určité potraviny a potravní doplňky mají schopnost uvolňovat HIS přímo z žírných buněk organismu. Do této skupiny se řadí např. ananas, citrusové plody, jahody, papája, rajčata, špenát, ořechy, arašídy, čokoláda, vaječný bílek, ryby, vepřové maso, ale i některé druhy koření, alkohol, či některá aditiva. V zemích s velkou spotřebou mořských ryb a mořských plodů patří otravy histaminem k nejběžnějším typům otrav z potravin (Hungerford, 2010). Např. v USA je mezi třemi nejčastějšími chorobami vyvolanými konzumací mořských plodů právě intoxikace histaminem (Den Brinker et al., 2000). Často se používá pojmu skombrotoxikóza, protože původcem otrav bývají nejčastěji ryby z čeledi Scombridae (makrelovité), představované zejména tuňáky a makrelami (Rauschner-Gabering et al., 2009). 17

Histamin přijímaný potravou může u citlivých jedinců zhoršovat již probíhající onemocnění. King (2000) ve své klinické studii uvádí vliv přísné diety neobsahující histamin u pacientů s chronickou kopřivkou a angioedémem. Po 14 dnech diety došlo k výraznému zlepšení stavu pacientů a dávkování užívaných antihistaminik mohlo být značně sníženo. Obdobný pokus provedli Wantke et al. (1993) u pacientů trpících chronickými bolestmi hlavy. Během diety trvající několik měsíců až let uváděli pacienti výrazné snížení intenzity, frekvence i délky trvání příznaků. 2.4.2 Toxicita tyraminu Tyramin je nejúčinnější ze skupiny vazoaktivních aminů (podstatně slabší účinky vykazují TRY a FEA). Hlavní význam TYR v potravinách spočívá ve farmakologické interakci s inhibitory MAO (viz. část 2.4), jež může navodit tzv. hypertenzní krizi (zvýšení krevního tlaku nad 180/120 mmhg). U pacientů užívajících právě inhibitory MAO může dojít k nahromadění TYR v systémovém oběhu s následným uvolňováním noradrenalinu z nervových zakončení a k prudkému zvýšení krevního tlaku s možným vznikem mrtvice nebo srdečního infarktu (Westfall a Westfall, 2006). Zatímco u zdravého jedince nízká dávka TYR z potravy nepředstavuje riziko (k výraznému zvýšení systolického krevního tlaku by došlo až jednorázovým požitím více než 400 mg tyraminu), pro zmíněnou skupinu osob příjem již 6 mg může způsobit mírnou krizi a příjem 10 25 mg tyraminu může vést k prudkým bolestem hlavy s nitrolebečním krvácením (McCabe, 1986; Ladero et al., 2010a). Poprvé bylo zvýšení krevního tlaku vyvolané TYR zaznamenáno v 60. letech 20. století po konzumaci sýrů u pacientů léčených inhibitory MAO, odtud se intoxikace tyraminem označuje jako reakce na sýry (z angl. cheese reaction ; Křížek a Kalač, 1998). Zatímco řada dřívějších autorů (Sandler, 1974; Peatfield, 1995; Leira a Rodriguez, 1996) na základě klinických pokusů uvádí TYR obsažený v potravě jako možný spouštěč migrén u citlivých jedinců včetně dětí, novější studie (Jansen, 2003; Holzhammer, 2005; Crawford, 2006) tyto hypotézy pro nedostatek vědeckých podkladů nepotvrzují. Podle nich může mít potrava pouze limitující roli v urychlení vzniku migrény či tenzních bolestí hlavy, popř. je neovlivňuje vůbec. Kromě výše uvedených systémových účinků může TYR také zvyšovat přilnavost E. coli 1057H k buňkám střevního epitelu (Lyte, 2004). Zvýšené koncentrace TYR 18

v mozku mohou dle autorů Coruzzi et al. (2001) a Premont et al. (2001) souviset s výskytem neurologických onemocnění, jako je schizofrenie, Parkinsonova choroba, Reyův syndrom, či deprese. 2.4.3 Toxicita diaminů a polyaminů Přímé toxické účinky putrescinu, sperminu a spermidinu popsány nebyly, diaminy PUT a KAD však mohou díky vyšší afinitě k DAO zvyšovat toxicitu HIS. Vzhledem k tomu, že PUT, SPM a SPD se v organizmu podílí na řadě důležitých buněčných pochodů (regulace buněčného růstu a buněčné proliferace) a jejich zvýšené koncentrace bývají přítomny v maligně transformovaných buňkách, příjem těchto aminů potravou by měl být do jisté míry regulován (Ladero et al., 2010a). Putrescin je také některými autory (Shah a Swiatlo, 2008) dáván do souvislosti s virulentními faktory řady grampozitivních a gramnegativních patogenních mikroorganizmů. Dle autorů Jones et al. (2007) usnadňuje přítomnost PUT v extracelulárním slizu plazivých a plovoucích buněk, typických pro rod Proteus, vzájemnou buněčnou komunikaci a významně se tak podílí na pohyblivosti těchto bakterií, jenž způsobují např. záněty močových cest. Zahříváním PUT vzniká piperidin, z KAD pyrolidin, což jsou sloučeniny, které mohou stejně jako sekundární aminoskupiny SPM a SPD raegovat s přítomnými nitráty za vzniku kancerogenních nitrosaminů (Shalaby, 1996). Kancerogenita nitrososloučenin byla prokázána u více než 40 živočišných druhů, u většiny z nich se projevoval i účinek mutagenní, popř. teratogenní. Rovněž u člověka existuje předpoklad, že právě nitrosaminy (jak endogenní, tak přijímané potravou) jsou jedním z faktorů podílejících se na vzniku rakoviny gastrointestinálního traktu (rakovina tlustého střeva, žaludku, jícnu či jater; de Kok a van Maahen, 2000; Farombi, 2004). 2.5 Výskyt BA v potravinách BA v potravinách v řadě případů poukazují na stupeň mikrobiální kontaminace, jejich koncentrace tak může být považována ze jeden z ukazatelů kvality potravin. Vyskytují se jak v potravinách fermentovaných (tj., připravovaných kvasnými pochody), tak nefermentovaných. Nejvyšší hladiny BA se nachází především v rybách a 19

rybích výrobcích, dlouhozrajících sýrech, fermentovaných masných a zeleninových výrobcích, pivě a víně (McCabe-Sellers, 2006). Hladiny TYR a HIS v mg vztažené na běžně konzumovanou porci vybraných druhů potravin dle autorů Vlieg-Boerstra et al. (2005) uvádí tabulka 1. Vzhledem k rozdílné dekarboxylační schopnosti bakteriálních kmenů podílejících se na tvorbě BA se i obsahy jednotlivých BA v potravinách značně liší. Jejich hladiny v určitém druhu potraviny tak mohou v širokém rozpětí kolísat nejen mezi různými výrobci, ale i mezi jednotlivými šaržemi téhož výrobce (Kalač a Křížek, 2002; Standarová et at., 2008). Tabulka 1. Obsah tyraminu a histaminu ve vybraných skupinách potravin (Vlieg-Boerstra et al., 2005) Potravina Tyramin (mg / porce) Histamin (mg / porce) Ryby 1,8-9,0 / 70 g 0,6-11,5 / 70 g Sýry 1,0-31,0 / 20 g 0,7-35,0 / 20 g Maso a masné výrobky 1,7-11,0 / 20 g 0,6-5,5 / 20 g Zelenina 12,2-33,0 / 200 g 5,0-23,0 / 200 g Pivo a víno 0,5-3,6 / 100 ml 0,6-1,6 / 100 ml Fermentované sojové výrobky 1,5-18,0 / 10g 0,8-21,0 / 10g 2.5.1 Ryby a rybí výrobky Ryby a výrobky z ryb patří mezi potraviny s nejvyšším obsahem BA, především však histaminu. Jedná se hlavně o mořské ryby představované tuňáky, makrelami, sledi, sardinkami nebo ančovičkami. Vyšší koncentrace HIS jsou rovněž běžné u krevet a jiných mořských plodů. Svalovina mořských ryb obsahuje velké množství volného histidinu (od 1 g kg -1 u sleďů po 15 g kg -1 u tuňáků), který je za příznivých podmínek dekarboxylován na histamin. Na této reakci se podílí endogenní histidindekarboxyláza, podle autorů Halasz et al. (1994); Bjornsdottir et al. (2009) a Tsai et al. (2009) je však pro tvorbu HIS v rybách rozhodující činnost dekarboxyláz bakteriálních. U čerstvě vylovených ryb jsou hladiny HIS obvykle nízké (do 10 mg kg -1 ), pokud však nedojde k rychlému zchlazení a udržování teploty ryb kolem 0 C, koncentrace mohou vzrůstat až na tisíce mg kg -1. Vzhledem k mezofilní povaze většiny bakterií podílejících se na vzniku BA, dochází ke značné tvorbě HIS již při teplotě nad 10 C (Křížek a Kalač, 1998). Skladováním ryb při 30 C, což je teplotní optimum právě pro 20

mezofilní bakterie, může dojít k překročení akceptovatelné dávky HIS již během 48 hodin. Během tepelných úprav (např. pečení ryb) může dojít k vytěkání časti BA, sterilací při konzervaci se však obsahy BA již nemění (Shalaby, 1996). Přídavek glukono-deltalaktonu (známého jako přídatná látka E575) výrazně potlačuje tvorbu putrescinu (Maijala et al., 1993). Kromě HIS vzrůstá při kažení ryb i koncentrace KAD a PUT, obsahy SMP a SPD naopak klesají (Baixas-Nogueras et al., 2002; Křížek et al., 2002). Pro kvalitativní posouzení ryb z hlediska poživatelnosti proto Karmas (1981) navrhl tzv. index BA (BAI). Pro obsahy BA (v mg/kg) dle něj platí: BAI = HI + PUT + KAD. 1+ SPD + SPM Při hodnotě BAI<1 je kvalita výborná, při BAI>10 velmi špatná. Dle autorů Sims et al. (1992) je však pro hodnocení poživatelnosti spolehlivějším kritériem součet obsahu PUT a KAD. Dalším z kvalitativních ukazatelů ryb a rybích výrobků je i obsah bakteriálního metabolitu trimetanolaminu, látky zodpovědné za typický zápach zkažených ryb. 2.5.2 Sýry Sýry se v četnosti otrav histaminem řadí hned za ryby a rybí výrobky. Také hypertenzní krize vyvolaná zvýšeným příjmem tyraminu je nejčastěji spojována s konzumací sýrů. Zatímco v čerstvém mléce jsou koncentrace BA nepatrné (obvykle do 1 mg kg -1 ; Petridis, Steinhart, 1996; Novella-Rodríguez, 2000), v sýrech mohou být nalezeny hodnoty až tisíců mg kg -1. Hladiny BA ve zrajících sýrech jsou obecně vyšší, než v sýrech nezrajících. U dlouhozrajících sýrů mohou být koncentrace až 2000krát vyšší v porovnání se sýry čerstvými (Novella-Rodríguez, 2003; McCabe et al., 2006). Nejvíce jsou zastoupeny HIS, TYR, KAD, PUT (desítky až stovky mg kg -1 ), FEA (jednotky až desítky mg/kg), na počátku zrání SPM a SPD, v menší míře může být přítomen i TRP. Obsahy BA u jednotlivých typů sýrů značně kolísají, jsou závislé na řadě faktorů. Výrazně vyšší koncentrace měly sýry vyrobené z nepasterovaného mléka (Schneller et al., 1997; Elsanhoty et al., 2009), podle autorů Novella-Rodríguez et al. (2002) lze vyšší hodnoty předpokládat i v případě vysokotlakého ošetření mléka, neboť zde může oproti pasteraci docházet k výraznější proteolýze a následnému vzrůstu nabídky volných 21

aminokyselin. Riziko vzniku většího množství BA představuje bakteriální kontaminace (např. laktobacily, enterokoky, Enterobacteriaceae), a to jak v původní surovině, tak během výrobního procesu (Komprda et al., 2008a). Z technologického hlediska obsah BA ovlivňuje teplota sýřeniny, doba zrání či použití startérových a plísňových kultur (Křížek a Kalač, 1998). Během zrání a skladování sýrů se koncentrace BA zvyšují, hladiny SPM a SPD naopak klesají (Novella-Rodríguez et al., 2003; Standarová et al., 2010). Nižší hladiny BA mají tvrdé sýry holandského typu, vyšší potom zrající sýry měkké a poloměkké, sýry švýcarského typu a plísňové. Jednotlivé druhy sýrů mají svá charakteristická spektra, např. histamin dosahuje nejvyšších koncentrací v sýrech švýcarského typu, naopak nízké hladiny HIS se nacházejí v eidamech nebo čedarech (Stratton et al., 1991; Degheidi et al., 1992; Standarová et al., 2008). Přehled obsahů TYR, HIS a PUT v různých typech sýrů produkovaných v Evropě je uveden v tabulce 2. Tabulka 2. Přehled kvantitativně významných biogenních aminů v různých typech sýra (Komprda a Dohnal, 2010). Typ sýra Biogenní amin (mg kg -1 ) Histamin Tyramin Putrescin Sýry švýcarského typu 750-1290 64-910 17-360 Tvrdé sýry holandského typu 2-17 3-310 6-61 Plísňové sýry ND-90 10-185 ND-117 Poloměkké sýry z pasterovaného mléka ND-124 39-770 6-109 Poloměkké sýry z nepasterovaného mléka 226-573 400-1478 76-308 Kozí sýry 10 68 34 Tradiční portugalské ovčí sýry 16 176 218 ND nedetekováno Tavené sýry, přestože jsou během výroby vystaveny vysokým teplotám, obsahují rovněž určitá množství BA, v porovnání se sýry přírodními se však jedná o hladiny nižší (Stratton et al., 1991; Degheidi et al., 1992; El-Sayed, 1996; Kung et al., 2005, Standarová et al., 2008). 22

2.5.3 Maso a masné výrobky Maso a nefermentované masné výrobky zpravidla nepředstavují z hlediska obsahu BA zdravotní rizika. V čerstvém mase teplokrevných živočichů se nachází především SPM (20-60 mg kg -1 ) a SPD (obvykle do 10 mg kg -1 ), v malém množství mohou být přítomny i PUT, KAD, HIS a TYR (Halasz et al., 1994; Kalač a Krausová, 2005). Přítomnost BA byla zjištěna ve vařeném i nevařeném hovězím a vepřovém mase (Németh-Szerdahelyi, 1993), HIS byl detekován v hovězím a jehněčím mase (Teodorović et al., 1994). Vysoké obsahy SPM a SPD byly zjištěny v hovězích, vepřových a drůbežích játrech (Krausová et al., 2006). Vzrůstající hodnoty BA během skladování masa indikují bakteriální kontaminaci a jejich obsahy tak mohou sloužit jako indikátory čerstvosti masa (Ntzimani et al., 2008). Dle autorů Chen et al. (1994) jsou tyto změny přímo závislé na teplotě. Vepřové maso skladované při 30 C obsahovalo výrazně vyšší hladiny BA než maso skladované při teplotě 4 C, zvyšovaly se hlavně koncentrace KAD, PUT, ale i HIS a TYR. Smith et al. (1993) prokázali u vakuově baleného hovězího masa tvorbu BA i při velmi nízkých teplotách. Významné hladiny BA (především tyraminu) byly detekovány již 20. den skladování při 1 C. Poněkud odlišná situace je v případě fermentovaných trvanlivých masných výrobků, u kterých je naopak tvorba BA velmi významná. Obdobně jako u sýrů, i zde dochází během zrání k proteolýze s následným zvýšením nabídky volných aminokyselin pro dekarboxylující mikroorganizmy. Spektrum BA se mění s dobou zrání. Zatímco na počátku fermentace se vyskytuje hlavně HIS a KAD, ke konci převažuje spíše TYR a PUT, vyskytovat se mohou i TRP, FEA, SPM a SPD (Komprda et al., 2009). Hladiny BA v těchto výrobcích se obvykle pohybují v rozmezí jednotek až desítek mg kg -1, popř. desítek až stovek mg kg -1. Výsledný obsah BA v konečném výrobku závisí na ošetření původní suroviny, dodržování přísné hygieny výrobního procesu, použití startérových kultur, ale i na použité technologii Důležitými fyzikálně chemickými faktory ovlivňující obsah BA ve fermentovaných masných výrobcích jsou především ph, vodní aktivita, teplota a doba zrání, průměr salámu. (Suzzi a Gardini, 2003; Komprda et al., 2009; Latorre-Moratalla et al., 2010). 23

2.5.4 Potraviny rostlinného původu BA jsou běžnou součástí rostlinných orgánů, plní řadu fyziologických funkcí. U některých rostlinných druhů (např. Acacia berlandieri z čeledi Fabaceae) mají BA pravděpodobně i funkce obranné, předpokládá se, že rostlinu chrání před hmyzem a býložravci (Forbes et al., 1995). Pro potraviny rostlinného původu je typický vyšší obsah SPD oproti SPM, u potravin živočišného původu je tomu přesně naopak (Kalač a Krausová, 2005). V čerstvém ovoci a zelenině je obsah BA obvykle nízký (McCabe et al. 2006), vyšší hladiny TYR byly zjištěny např. u banánů (výrazně vyšší hladiny přitom obsahuje slupka), švestek, jahod a manga (Halasz et al., 1994; Mohamed et al., 2009). Zvýšené koncentrace PUT zaznamenali Kalač et al. (2005) v jablkách, mrkvi a cibuli. Během mechanického zpracovávání však může dojít ke kontaminaci především dekarboxylujícími bakteriemi čeledi Enterobacteriaceae (Valero et al., 1998; Simon- Sarkadi et al., 1994) a k následnému zvýšení hladin BA (zejména PUT). Právě PUT byl ve vyšších koncentracích (přesahujících 130 mg kg -1 ) stanoven v řadě ovocných džusů (pomerančovém, mandarinkovém, grepovém nebo jahodovém). V malinové šťávě byl dominantní TYR, HIS se oproti tomu vyskytoval minimálně (Maxa a Brandes, 1993; Kalač a Krausová, 2005). Vyšší hladiny BA byly zaznamenány u rajčat (TYR, TRP, HIS), špenátu (HIS), čínského zelí a ledového salátu (PUT; Moret et al., 2005). Během vaření zeleniny dochází k částečnému vyluhování BA do vroucí vody naopak během skladování hladiny BA (především PUT) stoupají (Kolesárová, 1995). Fenylethylamin je běžnou součástí kakaových bobů, nachází se proto i v čokoládě, čokoládových výrobcích a cukrovinkách obsahujících čokoládu. Vysoké hladiny FEA byly rovněž zjištěny u některých druhů hub (Silla-Santos, 1996). Stejně jako v případě fermentovaných živočišných produktů, i u potravin rostlinného původu připravovaných fermentací je předpoklad tvorby BA vysoký. Obsahy značně kolísají v závislosti na podmínkách fermentace, množství prekurzorů a přítomné mikroflóře (Peñaz et al., 2010). U kvašeného zelí v počátku fermentace převažuje tvorba PUT, ke konci rostou hladiny TYR a HIS (udávají se hodnoty desítek až stovek mg kg -1 ; Moret et al., 2005). Dle autorů Kalače a Křížka (2001) by bylo možné výrazně snížit obsahy BA v nakládaném zelí naočkováním vybranými kulturami mléčných bakterií. 24

Fermentované výrobky ze sóji (sojové omáčky, miso, tempeh) rovněž obsahují různě vysoké hladiny BA, především TYR a HIS (Yongmei et al., 2009; Shukla et al., 2010). 2.5.5 Pivo a víno Zatímco jednorázová konzumace sýrů a fermentovaných masných výrobků není obvykle příliš vysoká, u piva a vína je situace odlišná. Pivo i víno jsou získávány alkoholovým kvašením, pokud se ale uplatní kontaminující mléčné bakterie, může obsah aminů představovat zdravotní riziko. To je dáno jak konzumací větších množství v krátkém časovém úseku, tak schopností alkoholu snižovat účinek střevních aminooxidáz, podílejících se na odbourávání BA Obsahy BA v pivech mohou být ovlivněny kvalitou sladu a čistotou kvasného procesu. Typický je vzrůst jejich obsahu během hlavního kvašení, zatímco v dalších fázích výroby se již významněji nemění (Kalač et al., 1997). Riziko vzniku BA v pivech představuje hlavně kontaminace mléčnými bakteriemi (Křížek a Kalač, 2005). Indikátorem kontaminace bývají zvýšené hladiny TYR a KAD (Izquierdo-Pulido et al., 1996; Kalač et al., 1997). Z BA se v pivech nejčastěji vyskytuje právě TYR (Halasz et al., 1994) a HIS (Dumont et al., 1992), přičemž hladiny nad 10 mg l -1 mohou být dosaženy jak v pivech běžných, tak nealkoholických (Kalač a Křížek, 2002). Nejvyšší obsahy byly zjištěny u spontánně kvašených belgických piv. Vzorky převážné většiny (90 %) sledovaných značek tuzemských piv však obsahovaly méně než 2 mg l -1 histaminu (Kalač et al., 1997). Ve víně se nejčastěji vyskytuje HIS, TYR a PUT, v menší míře i KAD, etanolamin a agmatin. HIS a TYR bývají obvykle detekovány v jednotkách mg l -1, v řadě případů však byly zjištěny i hodnoty vyšší (10-30 mg l -1 pro HIS, desítky stovky mg l -1 pro TYR; Ancín-Azpilicueta et al., 2008; Costantini et al., 2009). Obsahy BA ve víně značně kolísají a mohou být ovlivňovány např. podmínkami fermentace. Koncentrace BA ve víně se mohou lišit mezi různými odrůdami vinné révy nebo dokonce různými oblastmi, ve kterých se vinná réva stejných odrůd pěstuje (Marques et al., 2008). Červená vína obsahují obecně vyšší hladiny BA než vína růžová, či bílá. Autoři Ancín-Azpilicueta et al. (2008) tuto skutečnost vysvětlují působením rozdílných faktorů během výroby červeného a bílého vína. 25

2.6 Hygienické limity pro BA v potravinách Stanovení maximálních přípustných koncentrací BA v potravinách je značně obtížné, neboť vnímavost vůči BA je velice individuální. Jak již bylo řečeno, detoxikační schopnost organismu závisí na zdravotním stavu jedince, genetických predispozicích, současném podávání některých léků a dalších faktorech. Pro osoby z rizikových skupin (např. pacienti léčení inhibitory MAO) mohou již relativně nízké dávky BA způsobit vážné zdravotní komplikace. Existují proto přísná doporučení, podle kterých by se tito jedinci měli potravinám s vyššími obsahy BA vyhýbat úplně, nebo alespoň jejich konzumaci omezit. Zatímco jednorázový příjem HIS do 40 mg způsobuje pouze lehké a nad 40 mg střední potíže, orální příjem 70 a více mg HIS může vést k projevům intoxikace. Závažné intoxikace jsou spojovány s jednorázovým příjmem HIS nad 1000 mg kg -1. (Rauscher-Gabering et al., 2009). Ve většině sledovaných případů histaminových otrav po konzumaci sýrů (hlavně sýry švýcarského typu a čedary) na Novém Zélandu (Australia-New Zealand Standards code, 2006) a ve Spojených státech amerických (Stratton et al., 1991) byly zjištěny koncentrace HIS právě nad 1000 mg kg -1. Autoři Rauscher-Gabering et al. (2009) považují obsahy 100 400 mg kg -1 HIS v sýrech za bezpečné (při konzumaci 60 g sýra za den), v salámech udávají odpovídající hodnoty 120 500 mg kg -1 HIS (při konzumaci 50 g salámu za den). Pokud by došlo také ke konzumaci ryb (150 g ryby za den), doporučují uvedení autoři snížit limity pro HIS u sýrů i salámů až o dvě třetiny. Podle citovaných autorů je velikost konzumované porce, a četnost konzumace těchto porcí během dne, důležitým kritériem pro posouzení toxikologického významu dané potraviny z hlediska obsahu BA. U jedinců užívajících inhibitory MAO se doporučuje udržovat jednorázový příjem TYR pod 5 mg, neboť již dávka 6 mg může u těchto osob vyvolat střední krizi, 10 25 mg TYR může mít za následek těžké bolesti hlavy s nitrolebečním krvácením (McCabe-Sellers et al., 2006; Ladero et al., 2010a). Za přijatelný obsah TYR v potravinách považuje řada autorů hladiny do 100 mg kg -1, pro FEA 30 mg kg -1. Suma uvedených aminů do 100 200 mg kg -1 by rovněž neměla představovat riziko (Halasz et al., 1994, Nout et al, 1994). Podle autorů Spanjer et al. (1991) by suma HIS, PUT a KAD v rybách a rybích výrobcích neměla přesáhnout hladinu 300 mg kg -1, u sýrů a kvašeného zelí by celkový součet obsahů TYR, HIS, KAD a PUT neměl být vyšší než 900 mg kg -1 výrobku. Pro ostatní BA zatím limity nebo doporučení nebyly stanoveny. 26

Řada zemí zákonem stanovila maximální přípustné koncentrace v rybách, rybích výrobcích, ale i v dalších potravinách. Americká FDA (2001), australský Food Standard Code (2006) a legislativa řady dalších zemí (Německo, Španělsko, Izrael, Turecko) stanovili přípustné hladiny histaminu v rybách a rybích výrobcích v rozmezí 50 200 mg kg -1. V evropské unii je legislativní limit stanoven Nařízením EP a Rady (ES) č. 2073/2005 O mikrobiologických kritériích pro potraviny jen pro obsah histaminu. Mezní hodnoty se vztahují na ryby z čeledí Scombridae, Clupeidae, Engraulidae, Coryfenidae, Pomatomidae a Scombraesosidae. V devíti odebraných vzorcích nesmí být průměrný obsah HIS nad 100 mg kg -1. Ve dvou vzorcích může obsah překročit tuto hodnotu, ale nesmí být vyšší než 200 mg kg -1. V žádném vzorku nesmí obsah překročit 200 mg kg -1. U ryb uvedených druhů, jenž byly ošetřeny enzymatickým zráním v láku, mohou být hladiny HIS vyšší, ne však víc než dvojnásobně. Výrobci nejsou povinni deklarovat obsah biogenních aminů na obalech. 2.7 Metody stanovení BA v potravinách Pro stanovení BA existuje řada analytických postupů, vypracovaných podle typu materiálu, v němž mají být aminy sledovány. V praxi se BA nejčastěji stanovují v potravinách, potravinových doplňcích, nápojích a krmivech, ale i v biologickém materiálu (např. v oblasti medicíny ve vzorcích tělních tekutin). Pro potravinářské účely jsou důležité jak metody zaměřené na stanovení aromatických a heterocyklických aminů (právě vysoké hladiny TYR a HIS představují možné riziko), tak na biogenní aminy (včetně polyaminů) jako celek (Křížek a Kalač, 1998). Využívají se především metody chromatografické, enzymatické a elektroforetické. Největší uplatnění pro analýzu BA v poživatinách mají vysokotlaková kapalinová chromatografie na reverzní fázi (RP-HPLC), plynová chromatografie (GC) a iontově výměnná chromatografie (IEC), své postavení si zachovává i tenkovrstvá chromatografie (TLC). Všechny výše uvedené metody zahrnují dva následující kroky (Innocente et al., 2007) : extrakce aminů z původního materiálu, vlastní analytické stanovení BA. 27

Vzhledem k bazické povaze aminů jsou nejpoužívanějšími extrakčními činidly anorganické i organické kyseliny (kyselina chlorovodíková, chloristá, trichloroctová). Při extrakci v kyselém prostředí dojde k vyizolování jak volných aminů, tak aminů vázaných na komponenty původní matrice. Výběr kyseliny závisí na materiálu, v němž mají být BA analyzovány. K extrakci BA ze sýrů se nejčastěji používá 0,1M kyselina chlorovodíková nebo 0,2M a 0,6M kyselina chloristá (Komprda a Dohnal, 2010), pro salámy a ryby je nejvhodnějším extrakčním činidlem kyselina trichloroctová (Moret a Conte, 1996). Po izolaci aminů ze vzorku následuje zpravidla alkalizace alikvotního podílu extraktu (Křížek a Kalač, 1998). V závislosti na charakteru původního materiálu a přirozeném obsahu volných aminokyselin (vysoký je jejich obsah např. ve zrajících sýrech), jež by mohly být rušivou složkou stanovení, jsou někdy kromě základní extrakce nezbytné i další předseparační kroky (Innocente et al., 2007). Nejčastěji se volí extrakce do organického rozpouštědla (butanol, butanol/chloroform, diethyleter), během níž přecházejí volné aminy do organické fáze, zatímco aminokyseliny zůstávají ve fázi vodné (Moret a Conte, 1996). Lipidy, jež by také mohly být rušivou složkou stanovení BA, lze ze vzorků eliminovat zamražením nebo centrifugací za snížené teploty (obvykle 4 C; Gianotti et al., 2008; Gosetti et al., 2007). Aby bylo možné stanovit pomocí kapalinové chromatografie i nearomatické biogenní aminy, jež neabsorbují záření v UV/VIS oblasti, je nezbytné vzorek před vlastní detekcí vhodně derivatizovat. Nejrozšířenějším derivatizačním činidlem je tzv. dansylchlorid (5-dimethylaminonaftalen-1-sulfonylchlorid; DCl). Dansylderiváty lze po HPLC separaci detekovat jak UV/VIS detektorem, tak fluorimetricky, výhodou jsou poměrně krátké eluční časy a možnost využití i u TLC. Dansylaci lze použít při stanovení BA v sýrech (Moret a Conte, 1996; Schneller et al., 1996; Vale a Gloria, 1997a; Pinho et al., 2001; Innocente et al, 2007; Martuscelli et al., 2005; Lanciotii et al., 2007; Komprda et al. 2008a), v mase a masných výrobcích (Komprda et al., 2009) v rybách (Park et al., 2010), ve víně (Dugo et al., 2006), v zelenině (Moret et al., 2005) a dalších materiálech. Derivatizační činidlo se nejčastěji připravuje rozpouštěním v acetonu v slabě zásaditém prostředí. Následná derivatizace probíhá při teplotě 40 60 C po dobu 20 60 minut, nižší teploty a kratší doba derivatizace vedou k nízké výtěžnosti i opakovatelnosti. Nevýhodou dansylderivátů může být nižší stabilita při uchovávání a rovněž jejich fotolabilita. Nižší detekční limity umožňuje derivatizace o- ftaldialdehydem (OPA), oproti dansylchloridu je ale nutná delší doba analýzy a možnost 28

pouze spektrofluorimetrické detekce (Moret et al., 2005). Velkou nevýhodou je i to, že OPA nereaguje se sekundárními aminoskupinami sperminu a spermidinu, stanovit tak lze pouze primární aminy. Další možností předkolonové derivatizace je např. reakce s benzoylchloridem, 9- fluorenylmethyloxycarbonylchloridem (FMOC), deriváty fluoresceinu (dichlorotriazinylaminofluorescein) nebo fenylthioisokyanátem (Gosetti, 2007). Derivatizace pomocí FMOC umožňuje stanovení primárních i sekundárních aminů. Velkou výhodou tohoto činidla je stabilita vzniklých derivátů při pokojové teplotě a především možnost detekovat i velmi nízké koncentrace sledovaných aminů (Lozanov et al., 2007). Biogenní aminy lze na reverzní fázi HPLC separovat i nederivatizované, a to ve formě iontových párů (Izquierdo-Pulido, 1993). Derivatizace následuje až po separaci, nejčastěji ninhydrinem, za tvorby barevných produktů nebo již zmíněným o- ftaldialdehydem v přítomnosti 2-merkaptoethanolu za tvorby fluorescenčních produktů (Alberto et al., 2002; Novella-Rodríguez et al., 2003). Kromě nejčastěji používané RP-HPLC, lze pro stanovení BA v sýrech využít i micelárni kapalinovou chromatografii (MLC), jako mobilní fáze u této metody se používají vodné roztoky povrchově aktivních látek (Gil-Agustí et al., 2007). Pro rychlá kontrolní stanovení BA lze využít klasickou TLC, její výhodou je jednoduchost, použitelnost pro velká množství vzorků v minimálním čase a cenová dostupnost (Shalaby, 1996). I zde je však nutná předseparace a vhodná derivatizace. TLC pro analýzu BA v tavených sýrech využil El-Sayed (1996). Srovnání TLC a HPLC pro stanovení BA v rybách a rybích výrobcích provedli Shakila et al. (2001), podle autorů je TLC velmi vhodnou metodou pro sledování HIS, PUT a KAD právě v rybím průmyslu. Pro stanovení aminů v sýrech, ale i ostatních potravinách lze využít i ionexovou chromatografii (IEC). Výhodou IEC je jednoduchá příprava vzorku bez nutnosti derivatizace a možnost stanovení primárních i sekundárních aminů (Standara et al., 2000). Nevýhodou jsou delší retenční časy, vznikající zadržováním aminů v koloně díky silným hydrofóbním interakcím. Dle autorů De Borba a Rohrer (2007) lze hydrofóbní interakce mezi aminy a stacionární fází minimalizovat použitím slabě kyselých iontoměničů. Výhodu je podle posledně citovaných autorů i možnost použití konduktometrické detekce. 29