Diagnostika monogenní obezity Josef Včelák, Olga Lischková, Hana Zamrazilová Endokrinologický ústav, Praha
SPRINT MOLEKULÁRNĚ GENETICKÝCH METOD SEKVENOVÁNÍ 1990-2003 Human Genome Project (HGP) (300 sekvenačních jednotek, 3 miliardy dollarů) x komerční projekt f. Celera Lidský genom 80 000 genů nástup sekvenátorů nové generace není nutná elektroforéza 2007 odsekvenován genom J. D. Watsona 2008 začal Projekt 1000 genomů (podprojekt 2500 exomů) Lidský genom 3 Gb, ale jen 1% tvoří geny s translací cca 21 500 genů, které obsahujících cca 180 000 exonů 2012 začal Projekt 100 000 genomů JANUARY 10, 2012 Life Technologies Benchtop Ion Proton Sequencer will sequence human genomes in one day for less than $1000!!!
Next generation sequencing (NGS) Fragmentace DNA Hybridizace s adaptory Knihovny Ukotvení Sekvenace v klastrech
Mendelovsky děděné syndromy spojené s obezitou - vzácné > 20 syndromů - autozomálně dominantní/recesivní; X-vázané - u většiny identifikována chromozómová aberace - Prader-Williho s. 1:25 000 - Bardet-Biedlův syndrom 1:100 000 - Alströmův syndrom - Albrightova hereditární osteodystrofie - Syndrom fragilního X - Cohenův syndrom. Polygenní obezita Monogenní obezita (1 : 800) > 10 genů - narušení leptin-melanokortinové osy - podstata: mutace v jednom genu (velkého účinku) - následek: strukturní nebo kvantitativní odchylka genového produktu - platí dědičnost mendelovského typu - výskyt v obézní populaci: jednotky % * 1 gen hlavní a několik genů vedlejších > 5% silně obézních dětí WHO (2015): 1,9 miliard BMI>25kg/m 2 ; 600 miliónů BMI>30kg/m 2 Personifikovaná medicína, personifikovaná celogenomová genetická analýza
Geny kódující hormony (neuropeptidy a jejich receptory) uplatňující se v neuronální diferenciaci nucleus paraventricularis a leptin-melanokortinové ose leptin z adipocytů LEPR hypotalamu aktivace řady drah např. ovlivnění exprese proopiomelanokortinu (POMC) Barsh a Schwartz, 2002 POMC je štěpěn konvertázamy PC1 a PC2 vzniklé peptidy aktivují MC4R redukce příjmu potravy
Odpověď na léčbu leptinem u kongenitální leptinové deficience
MC4R 18q22 ovlivňuje centrum sytosti v hypotalamu podílí se na odpovědi organismu na příjem vysoko-tukové stravy podílí se na regulaci metabolismu (glukózové a lipidové homeostázy) podílí se na regulaci termogeneze, kardiovaskulárního systému podílí se na reprodukčních a sexuálních funkcích, vnímání bolesti a strachu řada polymorfismů asociovaných s obezitou u GWAS Pacienti s mutací MC4R nejčastější forma monogenní obezity (ČR 2-4% silně obézních dětí = ) normální porodní hmotnost hyperfágie rozvoj obezity již během 1. roku života akcelerovaný růst, zvětšení tukové i netukové hmoty, denzity kostí bývá přítomný hyperinzulinismus většinou bez porušené gluk. tolerance pubertální vývoj, fertilita, intelekt v normě
MC4R a bariatrie Effect of vertical sleeve gastrectomy in melanocortin receptor 4-deficient rats. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2012 Apr 24. Taken together, these data suggest that the beneficial effect of VSG on body weight and glucose metabolism is not mediated by alterations in MC4R activity. Melanocortin-4 Receptor Signaling Is Required for Weight Loss after Gastric Bypass Surgery. J Clin Endocrinol Metab. 2012 Apr 6. MC4R is the first gene identified that is required for the sustained effects of bariatric surgery. Weight loss after Roux-en-Y gastric bypass in obese patients heterozygous for MC4R mutations. Obes Surg. 2011 Jul;21(7):930-4. This study suggests that patients with heterozygous MC4R mutations also benefit from RYGB and that weight loss may be independent of the presence of such mutations. Bariatric surgery in a patient with complete MC4R deficiency. Int J Obes (Lond). 2011 Mar;35(3):457-61. Our experience with this patient suggests that complete MC4R deficiency impairs response to gastric banding and results in poor weight loss after this surgery.
Vliv 2 promotorových a 2 nesynonymních variant v genu MC4R 6 měsíců po bandáži žaludku (LAGB) Ref: 13 žen po LAGB bez varianty -178A/C: počáteční m:142kg, 60 % EWL, zlepšená senzitivita k inzulínu (IS) ve srovnání s Ref.; 184 cm (!) -220G/A: poč. m: 122kg, 27 % EWL zlepšená IS ve srovnání s Ref. I251L: poč. m: 91kg, 58 % EWL zlepšení IS a lipidového metabolismu ve srovnání s Ref. V103I: poč. m: 127kg, +2 kg, bez efektu bariatrické operace - - - + Úbytek hmotnosti [kg] % EWL excess weight loss, úbytek nadměrné hmotnosti Laparoskopická adjustabilní gastrická bandáž
Molekulárně genetická diagnostika monogenní obezity Endokrinologický ústav HaloPlex Target Enrichment Custom Kit 2014 I. verze panelu na monogenní obezitu 2016 II. vylepšená verze panelu 53 genů známých z literatury ABCC8; ADIPOQ; ALMS1; ARL13B; ARL6; BBS1; BBS10; BBS12; BBS2; BBS4; BBS5; BBS7; BBS9; BDNF; CEP290; DYRK1B; EHMT1; FLCN; GABRD; GHRL; GLP1R; GNAS; GPR35; HDAC4; INSIG2; LEP; LEPR; MAGEL2; MC3R; MC4R; MKKS; MKS1; MTMR9; NDN; NR0B2; NTRK2; PAX6; PCSK1; PHF6; POMC; PPARG; RAI1; SDCCAG8; SH2B1; SIM1; SNRPN; TBX6; TRIM32; TTC8; VPS13B; WDPCP; WT1 Sekvenace MiSeq (Illumina)
Molekulárně genetická diagnostika monogenní obezity Endokrinologický ústav 1. MC4R sekvenace 3 PCR produktů (ověření 2 Long PCR) 2. MC3R, LEP, POMC, LEPR, BDNF sekvenace exonů (včetně UTR) PCR produkty sekvenace celých genů a promotorů Long PCR Příprava knihoven Nextera XT (Illumina) Sekvenace MiSeq (Illumina)
DNA 1391 leptin 21182C/T (47%, 119 reads) - není SNP ani popsaná mutace!? interpretace? hladina leptinu v krvi vyšetření rodičů (trio), rodokmen funkční studie (in vitro, tkáňová kultura)
Molekulárně genetická diagnostika monogenní obezity Endokrinologický ústav částečná automatizace přípravy knihoven automatizace purifikací Agencourt AMPure XP
Děkuji za pozornost. Čas. Lék. čes. 2014; 153: 200 206