15. APLIKACE ANALYTICKÝCH METOD PODLE OBLASTÍ 15.1. Klinická biochemie Luděk Dohnal Klinická biochemie je společně s hematologií, mikrobiologií, virologií, toxikologií a dalšími jedním z mnoha laboratorních oborů mediciny. Zabývá se stanovením převážně organických ale i anorganických látek a tím přispívá ke stanovení diagnosy, prognosy, míry závažnosti a průběhu onemocnění. Analysují se převážně tělní tekutiny (nejčastěji krev a moč), sekrety (sliny, pot aj.) eventuelně další biologické materiály získané odběrem od pacienta. Při analyse krve se nejčastěji odebraná krev nechá srazit, poté se odstředí a k analyse se pouižije kapalná fáze krevní sérum. Dříve se většina analytů v krevním séru stanovovala po jeho deproteinaci, tedy po vysrážení bílkovin, jichž je v séru kolem 7%, a oddělení jejich sraženiny odstředěním. V současnosti se analysa séra provádí většinou bez deproteinace pomocí specifických enzymových metod. V tomto oboru existuje vysoký stupeň automatisace rutině prováděných analys. Klinická biochemie je pravděpodobně největším producentem analytických dat. V České republice se provádí řádově 100 milionů analys za rok. Stanovují se stovky analytů s použitím známých technik jako absorpční spektrofotometrie UV VIS, fluorimetrie, nefelometrie a turbidimetrie, radiochemické a imunochemické techniky, iontově selektivní a enzymové elektrody, plynová a kapalinová chromatografie, elektroforesa a další. Některé z technik, např. polarografie, imunodifuse v gelu, stanovení dusíku podle Kjeldahla, acidobasické a komplexometrické volumetrické titrace, které se ještě před 30 lety hojně používaly, jsou dnes již zastaralé. Budeme se zabývat stanovením několika vybraných organických analytů. Zmíníme též dvě historické techniky a to Brdičkovu filtrátovou reakci (polarografie) a Fehlingovu reakci na přítomnost redukujících cukrů. Obě reakce jsou empirické, definované postupem. Nestanovuje se určitý analyt. 15.1.1. Glukosa v krvi (v séru) Fysiologická koncentrace glukosy v krvi (séru)je 3,5 až 5,6 mmol/l. Zvýšená koncentrace bývá u úplavice cukrové (diabetes mellitus), snížená hodnota ohrožující život bývá u hypoglykemického komatu. Téměř výlučně užívaným principem stanovení je enzymová oxidace glukosy. Fotometrické stanovení s hexokinasou (HK) a glukosa 6 fosfátdehydrogenasou (G6PDH)
Enzym HK katalysuje reakci glukosa + ATP > glukosa 6 fosfát + ADP. Následně enzym G6PDH katalysuje reakci glukosa 6 fosfát + NAD + > glukonolakton 6 fosfát + NADH + H +. Měří se přírůstek absorbace při 340 nm. Fotometrické stanovení s glukosaoxidasou (GOD) a peroxidasou (POD) Enzym GOD katalysuje reakci glukosa + O 2 + H 2 O > glukonolakton + H 2 O 2. Následně enzym POD katalysuje oxidační kopulaci H 2 O 2 + C 6 H 5 OH + R NH 2 > R N=C 6 H 4 =O. R NH 2 bývá nejčastěji 4 aminoantipyrin. Měří se přírůstek absorbance v okolí 500 nm. Elektrochemické stanovení s glukosaoxidasou (GOD) Enzym GOD katalysuje reakci glukosa + FAD > glukonolakton + FADH 2. Následně FADH 2 silně vázaný na GOD je anodicky oxidován zpět na FAD a amperometrická odezva je úměrná koncentraci glukosy. Tento způsob stanovení se velmi často používá především v tzv. glukometrech. 15.1.2. Močovina v séru Fotometrické stanovení s ureasou a Berthelotovou reakcí Fysiologická koncentrace močoviny v séru je 3,6 až 8,9 mmol/l. Zvýšená koncentrace bývá u ledvinové nedostatečnosti, snížená koncentrace u závažného poškození jater a v těhotenství. Stanovení lze popsat rovnicemi: H 2 N CO NH 2 + H 2 O > CO 2 + 2 NH 3 (katalysa ureasou) NH 3 + HClO > Cl NH 2 + H 2 O Cl NH 2 + C 6 H 5 OH + O 2 > O=C 6 H 4 =N Cl + 2 H 2 O (katalysa nitroprussidem sodným) O=C 6 H 4 =N Cl + C 6 H 5 OH > O=C 6 H 4 =N C 6 H 4 OH + HCl Prvním krokem je enzymová hydrolysa močoviny. Vzniklý amoniak je chlornanem oxidován na chloramin. Chloramin oxidačně kopuluje s fenolem nebo jeho vhodným derivátem (kys. salicylová: 2 karboxyfenol, thymol: 2 isopropyl 5 methylfenol) a vzniklý chinonchlorimid reaguje s další molekulou fenolu či jeho derivátu za vzniku modrého indofenolu. Měří se absorbance reakční směsi při 600 nm. 15.1.3. Kreatinin v séru Fysiologická koncentrace je cca do 100 µmol/l. Zvýšená koncentrace bývá podobně jako u močoviny při ledvinové nedostatečnosti a též u rozsáhlého poranění kosterního svalstva. Za účelem zjištění filtrační schpnosti ledvin očišťovat krev od nežádoucích odpadních látek se stanovuje kreatinin v krvi a v moči, měří se objem moče vyloučené za 24 hodin a z těchto údajů
se počitá tzv. kreatininová clearance. Její fysiologické (normální) meze jsou závislé na věku, pohlaví, výšce a váze pacienta. Fotometrické stanovení Jaffého reakcí bez deproteinace 20 µl séra se smíchá s 1 ml pracovního roztoku činidla, který obsahuje kys. pikrovou 4,4 mmol/l, NaOH 150 mmol/l a disodiumhydrohenfosfát 13 mmol/l. Vznilý červeno oranžový adukt kreatininu s pikrátem v poměru 1:1 se měří většinou kineticky při 500 nm. Jaffého reakce je nespecifická, kromě kreatininu reagují též další chromogeny jako bílkoviny, glukosa, kys. askorbová, guanidin, aceton, acetoacetát, pyruvát. 15.1.4. Kyselina močová v séru Fysiologická koncentrace je cca 140 až 420 µmol/l. Zvýšená koncentrace bývá u dny, ledvinových urátových konkrementů, urátové nefropatie. Fotometrické stanovení s urikasou a katalasou (Kageyama) Stanovení můžeme popsat následujícími rovnicemi: kys. močová + 2 H 2 O + O 2 > allantoin + CO 2 + H 2 O 2 H 2 O 2 + CH3 OH > HCH=O + H 2 O (katalysa urikasou) (katalysa katalasou) HCH=O + NH 3 + 2 CH 3 CO CH 2 CO CH 3 > 3,5 diacetyl 1,4 dihydrolutidin + 3 H 2 O Oxidací kyseliny močové vzdušným kyslíkem za katalysy enzymem urikasou vzniká peroxid vodíku. Ten oxiduje methanol na formaldehyd za katalysy enzymem katalasou. Formaldehyd kondensuje s acetylacetonem a amonnými ionty a vzniká žlutý derivát lutidinu. Měří se absorbance reakční směsi při 410 nm. 15.1.5. Cholesterol celkový v séru Fysiologická koncentrace je cca 4 až 6 mmol/l a silně závisí na věku. Zvýšená koncentrace bývá ukazatelem zvýšeného rizika ateroskleosy, též snížení funkce štítné žlázy. Snížená koncentrace je u těžkého poškození jaterní funkce, též při zvýšené funkci štítné žlázy. Fotometrické enzymové stanovení s oxidační kopulací Princip ilustruje toto schema: estery cholesterolu + H 2 O > cholesterol + volné mastné kyseliny cholesterol + O 2 >delta 4 cholesten on + H 2 O 2 R NH 2 + C 6 H 5 OH > 2 H 2 O 2 R N=C 6 H 4 =O + 4 H 2 O (katalysa CHE (katalysa CHO) (katalysa POD)
Cholesterolestarasa (CHE) uvolní cholesterol z esterů, volný cholesterol je oxidován vzdušným kyslíkem za katalysy cholesteroloxidasou (CHO) a vzniklý peroxid vodíku za katalysy peroxidasou (POD) oxidačně kopuluje 4 aminoantipyrin s vhodným derivátem fenolu a vzniká chinoniminové barvivo, které se měří při 500 nm. 15.1.6. Bilirubin celkový v séru Fysiologická koncentrace je do cca 20 µmol/l. Zvýšená koncentrace bývá u hemolytické anemie, onemocnění jater a žlučníku. Fotometrické stanovení s diazotovanou kyselinou sulfanilovou Princip ilustruje následující schema: bilirunin + kys. sulfanilová + NaNO 2 + HCl > červený azobilirubin Ke vzorku se přidává tzv. akcelerátor (obsahuje kofein, octan sodný a benzoan sodný), který solubilisuje volný bilirubin. Při 430 až 460 nm se měří červeně zbarvený azobilirubin (ph slabě kyselé), nebo při 580 až 620 nm modře zbarvený azobilirubin (ph cca 12) po přídavku roztoku směsi NaOH a vinanu sodno draselného. 15.1.7. Gamaglutamyltransferasa (GMT) v séru Fysiologická koncentrace je do 1,5 µkat/l. Zvýšená koncentrace bývá při abusu alkoholu, akutním zánětu jater, intoxikaci. Fotometrické stanovení dle IFCC Princip ilustruje schema: L γ glutamyl 3 karboxy 4 nitroanilid + glycylglycin > L γ glutamyl Gly Gly + 5 amino 2 nitrobenzoát Vznikající nitrobenzoát, který je za reakčních podmínek žlutý, se měří se při 410 nm. 15.1.8. Alaninaminotransferasa a aspartátaminotransferasa (ALT a AST) v séru Fysiologická koncentrace ALT je do 0,45, AST do 0,52 µkatl/l. Zvýšená koncentrace ALT bývá při poškození jater (hepatitida), při intoxikacích, AST při poškození srdečního svalu, při jaterní cirhose. Fotometrické stanovení ALT s NADH dle IFCC L alanin + 2 oxoglutarát > pyruvát + L glutamát (koenzym pyridoxal 5' fosfát)
pyruvát + NADH + H + > L laktát + NAD + (katalysa LD) L alanin je substrátem, z něhož ALT za spolupůsobení koenzymu pyridoxal 5' fosfátu přenáší aminoskupinu na 2 oxoglutarát. Vzniklý pyruvát je redukován pomocí NADH za katalysy laktátdehydrogenasou (LD) na L laktát. Měří se úbytek absorbace NADH při 340 nm. Fotometrické stanovení AST s NADH dle IFCC L aspartát + 2 oxoglutarát > oxalacetát + L glutamát oxalacetát + NADH + H + > L malát + NAD + (koenzym pyridoxal 5' fosfát) (katalysa MD) L aspartát je substrátem, z něhož AST za spolupůsobení koenzymu pyridoxal 5' fosfátu přenáší aminoskupinu na 2 oxoglutarát. Vzniklý oxalacetát je redukován pomocí NADH za katalysy malátdehydrogenasou (MD) na L malát. Měří se úbytek absorbance NADH při 340 nm. Poněvadž v analysovaném séru je vždy přítomný endogenní pyruvát, který by falešně zvyšoval koncentraci AST, přidává se v preinkubační fázi ke vzorku LD, která tento pyruvát převede před vlastním stanovením na laktát. 15.1.9. Albumin v moči (mikroalbuminurie) Zatímco v krvi (séru) je klinicky relevantním údajem koncentrace příslušného analytu, v moči je klinicky relevantní množství analytu vyloučeného za určitý čas většinou za 24 hodin. Fysiologická exkrece albuminu močí je do cca 0,03 g/den. Už mírné zvýšení (mikroalbuminurie do 0,3 g/den) preklinicky signalisuje poškození ledvin a to nejčastěji jako následek diabetu. Hodnota větší než 0,3 g/den je (většinou klinicky manifestní) proteinurie. Imunoturbidimetrické stanovení Se specifickou protilátkou (AB), např s králičím delipidovaným antisérem proti antigenu (AG) lidskému albuminu, vzniká v pufrovaném prostředí s eventuelním přídavkem detergentu precipitát (zákal) imunokomplexu. Měří se turbidita reakční směsi při 340 nm. AG + AB > (AG AB) Kompetitivní ELISA na mikrotitračních destičkách Stejný antigen AG, jaký má být stanoven ve vzorku (lidský albumin), se naváže na pevnou fázi (stěna jamky mikrotitrační destičky). Stěna jamky je nyní vysycena lidským albuminem. Do jamky se nadávkuje vzorek a přidá se králičí protilátka, která je značená např. peroxidasou (AB POD). Protilátka se váže na albumin na stěně jamky tím se imobilisuje a též na albumin ze vzorku a to ve stejném poměru, v jakém je množství albuminu na stěně jamky a albuminu ve vzorku. Po inkubaci se jamka mikrotitrační destičky opakovaně promyje pufrem a alikvotní část protilátky značené peroxidasou zůstává fixována na stěně jamky. Přidá se substrát pro POD (leukobase a H 2 O 2 ) a po inkubaci se měří absorbance výsledného zabarvení. Schematicky to vypadá takto (AG je v našem píadě albumin):
AG + AG(vzorek) + ABPOD > (AG ABPOD) + (AG ABPOD) Po promytí zůstane jen komplex navázaný na stěnu (AG ABPOD). (AG ABPOD) + leukobase + H 2 O 2 > oxidovaná leukobase (barevná) Tedy čím více je albuminu ve vzorku, tím méně protilátky se naváže na imobilisovaný albumin a tím nižší bude výsledná absorbance. 15.1.10. Celková bílkovina v séru Fysiologická koncentrace je 65 až 85 g/l. Zvýšená koncentrace bývá u plasmocytomu (zhoubné nádorové onemocnění plasmocytů, což jsou krevní buňky produkující protilátky), u makroglobulinemie (patologická nadprodukce monoklonálního imunoglobulinu M, která m.j. nadměrně zvyšuje viskositu krve). Snížená koncentrace (snížen bývá především albumin) při závažném nedostatku bílkovin ve stravě, při nefrotickém syndromu nebo po velké či opakované ztrátě krve. Spektrofotometrické stanovení biuretovým činidlem Principem je reakce peptidových vazeb CO NH s biuretovým činidlem, což je vodný roztok CuSO 4 12 mmol/l, vinan sodno draselný 32 mmol/l, NaOH 0,6 mmol/l, KJ 30 mmol/l. Vzniká červenofialový komplex, který se měří kolem 550 nm. S biuretovým činidlem nereagují aminokyseliny a dipeptidy. Ostatní peptidy a bílkoviny reagují. V přítomnosti vyššího obsahu zmýdelnitelných tuků poskytuje reakce v důsledku tvorby meďnatých mýdel falešně vyšší výsledky. 15.1.11. Elektroforesa bílkovin krevního séra Fysiologické koncentrace jednotlivých elektroforetických frakcí (v % celkové bílkoviny) jsou následující: albumin 56 až 66%, alfa1 globulin 3 až 6%, alfa2 globulin 5 až 10%, beta globulin 9 až 41%, gama globulin 12 až 20%. (Pravopisná poznámka: Můžete se též setkat s transkripcí gamma globulin. Původní slovní řecký název písmene γ je.) Existuje řada typů patologicky změněného elektroforetického obrazu bílkovin. Níže jsou uvedeny příklady. akutní zánět zvýšení alfa1 a alfa2 frakce zánět jater zvýšení silné zvýšení beta a gama frakce cirrhosa jater nápadné současné zvýšení beta a gama frakce nefrotický syndrom nápadné současné snížení albuminu a gama frakce a zvýšení alfa a beta frakce
Isoelektrické body většiny bílkovin krevního séra jsou slabě kyselé ph 5 až 6. Proto v prostředí alkalického pufru (typicky ph kolem 8,6) jsou molekuly bílkovin převážně záporně nabtié a v elektrickém poli se pohybují k anodě. Nejrychleji se pohybuje albumin. Rutinně se provádí výhradně tzv. zónová elektroforesa, kde nosičem je acetylcelulosová folie nebo vrstva agarosového gelu. Elektroforesa na acetylované celulose Elektroforetické dělení probíhá na folii acetylcelulosy vložené v elektroforetické vaně v prostředí tris barbitalového pufru ph=8,6. Aplikátorem se nanese řádově několik mikrolitrů séra. Dělení probíhá v uzavřené vaně po dobu cca 20 až 40 min. při konstantním napětí cca 100 V a počátečním proudu cca 40 ma. V průběhu dělení je žádoucí, aby docházelo k co možná nejmenšímu odpařování vody z folie a nedocházelo k významnějšímu zvýšení její teploty. Po skončení dělení a vypnutí proudu se bílkoviny fixují ponořením folie do lázně, která má složení ethanol 60%, ledová kys. octová 10% a voda 30%. Poté se pro zviditelnění frakcí bílkovin ponoří na 5 minut do barvícího roztoku (roztok amidočerni v kys. octové 10%) a pak se odbarví pozadí opakovaným vypíráním ve vodném roztoku kys. citronové 0,05%. Po usušení folie je možno elektroforeogram densitometricky vyhodnotit. Na obrázku je ukázka normálního elektroforeogramu bílkovin krevního séra a jeho densitometrický záznam [8]. 15.1.12. Brdičkova filtrátová reakce Reakce je positivní (zvýšená) u nádorových ale též zánětlivých onemocnění. Zcela jistě není specifická pro zhoubné nádory, jak se původnně předpokládalo. Positivní reakce u pacienta bez klinických příznaků nutí pomýšlet na skrytý chorobný proces nebo nádor, negativní reeakce však takový stav nevylučuje. Snížená Brdičkova reakce je příznakem těžkého postižení jater.
Brdičkovou reakcí je vznik polarografické bílkovinové dvojvlny v puftrovaném roztoku solí kobaltu. Podstatou je katalysa vzniku vodíku vlivem sulfhydrylových ( S H) a disulfidických ( S S ) skupin v bílkovinách. Bílkoviny krevního séra se nejprve denaturují roztokem KOH a poté se působí 20% kys. sulfosalicylovou. Vzniklá sraženina se oddělí filtraci. K filtrátu se přidá činidlo obsahující Co(NH 3 ) 6 Cl 3 1mmol/l, NH 4 Cl 0,1 mol/l a NH 3 0,1 mol/l. Po promíchání se roztok polarografuje rtuťovou kapkovou lelektrodou na vzduchu od 0,8 V. Výška katalytické dvojvlny se měří od difusního proudu, který odpovídá redukci kobaltu, k nejvyššímu bodu dvojvlny. 15.1.13. Fehlingova reakce Smíchá se jeden díl roztoku Fehling I (roztok síranu měďnatého 7%) s jedním dílem roztoku Fehling II (10g NaOH a 35 g vinanu sodno draselného ve 100 ml vody). K tomuto roztoku se přidá jeden díl zkoušené moči a směs se zahřeje k varu. V přítomnosti redukujících látek např. glukosy vzniká sraženina oxidu měďného. Tato reakce byla ještě před 30 lety používána pro nespecifický semikvantitativní průkaz glukosy v moči především v souvislosti se záchytem úplavice cukrové (diabetes mellitus). Kromě glukosy způsobují její positivitu další redukující látky jako laktosa, fruktosa, galaktosa, pentosy, kyselina močová a řada léků. Použité zkratky: AB protilátka (antibody ADP adenosindifosfát AG antigen ALT alaninaminotransferasa AST aspartátaminotransferasa ATP adenosintrifosfát CHE cholesterolesterasa CHO cholesteroloxidasa ELISA Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (synonymum: EIA = Enzyme Immunosorbent Assay FAD flavinadenindinukleotid, oxidovaná forma FADH 2 flavinadenindinukleotid, redukovaná forma G6PDH glukosa 6 fosfátdehydrogenasa GMT gamaglutamyltransferasa GOD glukosaoxidasa HK hexokinasa IFCC International Federation of Clinical Chemstry and Laboratory Medicine
LD MD NAD + NADH POD UV VIS laktátdehydrogenasa (dehydrogenasa kyseliny mléčné) též LDH malátdehydrogenasa (dehydrogenasa kyseliny jablečné) též MDH nikotinamidadenindinukleotid, oxidovaná forma nikotinamidadenindinukleotid, redukovaná forma peroxidasa ultrafialová a viditelná oblast Klin. Biochem. Metab. je zkratka Klinická biochemie a metabolismus časopis České společnosti klinické biochemie České lékařské společnosti Jana Evangelisty Purkyně Literatura [1] Chromý V., Fischer J.: Analytické metody v klinické chemii. Masarykova universita, fakulta přírodovědecká, Brno 2000. [2] Lothar T.:Clinical laboratory diagnostics. TH Books Verlagsgesellschaft mbh, Frankfurt/Main, 1. English Edition, Germany 1998, ISBN 3 9805215 4 0. [3] Strassner W.: Laborwerte und ihre klinische bedeutung. VEB Verlag Volk und Gesundheit, Berlin 1980. [4] Homolka J.: Klinické biochemické vyšetřovací metody. Avicenum, Zdravotnické nakladatelství, Praha 1971. [5] Zuman P.: Organická polarografie, metodika a použití. Státní nakladatelství technické literatury, Praha 1966. [6] Schneiderka P., Kajabová M., Štern P., Dohnal L., Juklová M., Zápecová M., Benáková H., Zima T.: Problematika řízené POC glukometrie a zkušenosti se sítěmi glukometrů ve dvou fakultních nemocnicích. Část I. Přehled a výchozí stav. Klin. Biochem. Metab. No.3, vol. 18 (BCB 39), 149 160 (2010). Část II. Zkušenosti z provozu. Klin. Biochem. Metab. No.4, vol. 18 (BCB 39), 200 209 (2010). [7] Rapoport S. M., Raderecht H. J.: Physiologish chemisches Praktikum. VEB Verlag Volk und Gesundheit, Berlin 1977. [8] http://www.wikiskripta.eu/images/3/3c/elektrofor%c3%a9za.jpg (15.8.2014) Klíčová slova do rejstříku: klinická biochemie, glukosa, močovina, kreatinin, kyselina močová, cholesterol, bilirubin, gamaglutamyltransferasa, alaninaminotransferasa, aspartataminotransferasa, albumin, bílkovina, elektroforesa, Brdičkova filtrátová reakce, Fehlingova reakce.