Protilátky proti Borrelia burgdorferi (IgM). Návod k testu pro WESTERN BLOT OBJEDNACÍ PROTILÁTKY IG-TŘÍDA SUBSTRÁT FORMÁT ČÍSLO PROTI DY2132-1601 M Borrelia burgdorferi IgM WESTERN BLOTové 16x01(16) (kompletní antigeny) stripy potažené antigenem Indikace: Infekce Borrelia burgdorferi. Související onemocnění: Erythema chronicum migrans, Lymphadenosis cutis benigna, acrodermatitis chronica atrophicans, artritis, carditis, neuroborreliosis. Principy testu: Testovací souprava pro WESTERN BLOT umožňuje kvalitativní, in vitro zkoušku lidských protilátek proti Borrelia burgdorferi.testovací souprava obsahuje testovací stripy s extraktem elektroforeticky oddělených antigenů Borrelia burgdorferi. V prvním kroku reakce se tyto stripy blokují a inkubují s ředěným sérem pacienta. Jde-li o positivní vzorek, váží se specifické protilátky třídy IgM (i IgG a IgA) na antigeny. Detekce navázaných protilátek se provádí další inkubací s protilátkou proti lidským IgM označenou enzymem (konjugát), která dávají barevnou reakci. Součásti testovací soupravy: Testovací stripy s elektroforeticky separovanými antigeny Borrelia burgdorferi: 16 testovacích stripů Kontrolní strip na vyhodnocovací šabloně: 1 testovací strip inkubovaný s pozitivním kontrolním sérem Alkalickou fosfatázou značené protilátky (kozí) proti lidským IgM: 1x3 ml 10x koncentrované, t.j. množství dostačující pro přípravu 30 ml konjugátu hotového k použití Universální pufr: 1 x 50 ml 10 x koncentrovaného pufru, t.j.množství dostačující pro přípravu 500 ml universálního pufru hotového k použití Roztok substrátu: 1 x 30 ml, připravený k použití Nitrobluetetrazoliumchloride/5-Bromo-4-chloro- 3-indolylphosphate (NBT/BCIP) Vyhodnocovací šablona a vyhodnocovací protokol: 1 papír Vaničky k inkubaci: 2 x 8 kanálků Plastová folie Pracovní návod Uskladnění: Skladujte testovací soupravu při +2 C až + 8 C. Upozornění k použití: Používejte pouze součásti se stejným číslem šarže. Varování: Kontrolní sérum, které se používá k inkubaci kontrolního proužku, bylo testováno na negativitu HBSAg, anti-hiv-1 a anti-hiv-2 s použitím EIA a nepřímé imunofluorescence. Přesto musí být s veškerým materiálem nakládáno jako s možným zdrojem infekce, a proto s ním zacházejte opatrně. Některé reagencie jsou potenciálně toxické (pufr, roztok substrátu). Vyvarujte se jejich kontaktu s kůží. Dojde-li ke kontaktu s kůží, umyjte ji mýdlem a proudem vody.
Příprava reagencií Pozor: Všechny složky nechte před použitím vytemperovat na laboratorní teplotu. Potažené testovací stripy: Připraveny k použití. Skleněnou zkumavku s testovacími stripy otvírejte teprve, když stripy mají laboratorní teplotu, aby se předešlo kondenzaci vodní páry na stripech. Po vyjmutí stripů zkumavku těsně uzavřete a skladujte při teplotě +2 C až +8 C. Universální pufr: Universální pufru je dodán 10 x koncentrovaný. K přípravě pracovního universálního pufru odpipetujte čistou pipetou potřebné množství a zřeďte jej v poměru 1 : 10 destilovanou nebo deionizovanou vodou. K inkubaci jednoho testovacího stripu nařeďte 1,5 ml koncentrovaného pufru 13,5 ml destilované nabo deionisované vody. Zředěný pufr je stálý maximálně jeden týden při teplotě +2 C až +8 C. UPOZORNĚNÍ: Jestliže dojde v koncentrovaném pufru ke krystalizaci, zahřejte ho před ředěním na 37 C a dobře promíchejte. Konjugát: Enyzmový konjugát je 10 x koncentrovaný. K přípravě pracovní koncentrace konjugátu odpipetujte čistou pipetou potřebné množství a zřeďte 1 : 10 universálním pufrem. Pro jeden testovací strip nařeďte 0,15 ml koncentrátu 1,35 ml ředěného universálního pufru. Roztok substrátu: Připravený k použití. Uzavřete lahvičku ihned po použití, komponenty jsou citlivé na světlo. Příprava vzorků Vzorky séra pro analýzu jsou naředěny 1:51 universálním pufrem (30 µl séra se přidá k 1,5 ml universálního pufru a dobře promíchá.) Blokování: Inkubace se sérem: (1.krok) Promývání: Inkubace s konjugátem: (2.krok) Promývání: Inkubace se substrátem: (3.krok) Zastavení Inkubace Počet kanálků inkubační vaničky shodný s počtem testovaných sér se naplní 1,5ml universálního pufru. Ze skleněné zkumavky vyjměte požadovaný počet testovacích stripů a dejte do každého kanálku jeden tak, aby se citlivá vrstva nedotýkala dna vaničky (značka a číslo stripů musí být viditelné). Inkubujte na kývavé třepačce 15 minut při laboratorní teplotě. Potom všechen pufr odsajte. Naplňte každý kanálek 1,5 ml předem zředěného vyšetřovaného séra a inkubujte na kývavé třepačce 30 minut při laboratorní teplotě. Odsajte sérum z každého kanálku a promývejte je 3 x po pěti minutách na kývavé třepačce vždy 1,5 ml ředěného universálního pufru.. Napipetujte 1,5 ml předem zředěného konjugátu do každého kanálku a inkubujte 30 min na kývavé třepačce při laboratorní teplotě. Odsajte konjugát z každého kanálku a promývejte je 3 x po pěti minutách na kývavé třepačce vždy 1,5 ml ředěného universálního pufru. Napipetujte 1,5 ml roztoku substrátu do každého kanálku a inkubujte 10 min na kývavé třepačce při laboratorní teplotě. Odsajte substrát z každého kanálku a promyjte každý strip třikrát v deionizované nebo destilované vodě.
Borrelia burgdorferi - WESTERN BLOT Postup provedení testu 1. PŘÍPRAVA: umístěte blotovací stripy do inkubačních kanálků obsahujících 1,5 ml universálního pufru 15 min třepat 2. INKUBACE VZORKU: odsajte, napipetujte 1,5 ml zředěného séra (1:51) do inkubačních kanálků 30 min třepat 3. PROMÝVÁNÍ 4. INKUBACE S KONJUGÁTEM: odsajte, napipetujte 1,5 ml konjugátu (1:10) do inkubačních kanálků 30 min třepat 5. PROMÝVÁNÍ 6. INKUBACE SE SUBSTRÁTEM: odsajte, napipetujte 1,5 ml roztoku substrátu do inkubačních kanálků 10 min třepat 7. ZASTAVENÍ: odsajte, propláchněte vodou 8. VIZUÁLNÍ HODNOCENÍ Vyhodnocení a interpretace výsledků Anti-Borrelia-burgdorferi- WESTERN BLOTu (IgM) Manipulace: Položte inkubované blotovací stripy na filtrační papír, opatrně je přetřete savým papírem a pomocí čistého adhesivního pásku připevněte na plastový film. Nyní přilepte plastový film s blotovacími stripy k vyhodnocovacímu protokolu. (Upozornění: Jestliže bylo inkubováno méně než 16 stripů, je možné plastový film odstřihnout a část se stripy připevnit k protokolu.) Přiložte vyhodnocovací šablonu k blotovacím stripům a umístěte ji tak, že černá čárka nad číslem blotovacího stripu tvoří linii s orientační čárkou na vyhodnocovací šabloně. Číslo šarže na vyhodnocovací šabloně musí být shodné s číslem na zkumavce s používanými blotovacími stripy. Zřetelně rozpoznatelné proužky na blotovacích stripech, které se shodují se značkami na vyhodnocovací šabloně, zaneste do protokolu. Antigeny: Antigen pro Anti-Borrelia-burgdorferi-WESTERN BLOT firmy EUROIMMUN je získán ze zvláště vhodného kmene Borrelia burgdorferi (1, 2). Vykultivovaná borrelie byla převedena do roztoku pomocí sodium dodecyl sulfátu. Rozpuštěné proteiny byly diskontinuální polyacrylamidovou gelovou elektroforézou rozděleny podle molekulové hmotnosti a přeneseny na nitrocelulózu. Z každé testovací soupravy byly 2 testovací stripy inkubovány s referenčním sérem. Jeden z těchto barvených stripů obsahuje souprava, druhý zůstává ve výrobním závodě EUROIMMUN k dokumentaci.
Specifita antigenů na testovacích stripech:(3,4,5) Band Antigen Specifita 83 kda membránový-vesikální protein, p 83 degradační produkt p 100, vysoce specifický 75 kda heat shock protein, p 75 nespecifický 62 kda heat shock protein, p 62 nespecifický 57/59 kda p 57 a p 59 nespecifický 50 kda p 50 nespecifický 47 kda p 47 pravděpodobně genově specifický 43 kda p 43 nespecifický 41 kda flagellin, p41 rodově specifický, zkřížená reakce s ostatními spirochaetaceae a bakteriemi s bičíkem 39 kda p 39 vysoce specifický 36 kda p 36 specifita nejistá 34 kda Osp B, p 34 zevní povrchový protein B, vysoce specifický 32 kda p 32 nespecifický 31 kda Osp A, p 31 zevní povrchový protein A, vysoce specifický 29 kda p 29 pravděpodobně specifický, málo prozkoumaný 28 kda p 28 nespecifický 25 kda Osp C, p 25 zevní povrchový protein C, vysoce specifický 21/22 kda Osp C část komplexu Osp C, vysoce specifický 18 kda p 18 pravděpodobně specifický 17 kda p 17 nedefinovaný IgM třída protilátek proti Borrelia burgdorferi K vyhodnocení výsledků musí být brána v úvahu pozice a intenzita zabarvení proužků, protože negativní séra mohou vyvolat na stripech slabý signál. Antigeny Borrelia burgdorferi mohou být obecně rozděleny do tří kategorií (6). Kategorie Antigeny 1 Zkříženě reagující a nedefinované antigeny s molekulovou hmotností 15 kda, 17 kda, 28 kda, 32 kda, 36 kda, 43 kda, 47 kda, 50 kda, 57 kda, 59 kda, 62 kda a 75 kda. 2 Rodově specifické antigeny s molekulovou hmotností 41 kda (flagellin). 3 Druhově specifické a vysoce specifické antigeny s molekulovou hmotností 18 kda, 21/22 kda, 25 kda, 31 kda, 34 kda, 39 kda a 83 kda.
Iterpretace výsledků: Pro detekci IgM protilátek se postupuje stejně jako při detekci IgG protilátek, ale za použití jiného enzymového konjugátu (protilátky proti lidským IgM s navázanou alkalickou fosfatázou). IgM protilátky se pokládají za časný marker infekce Borrelia burgdorferi. Často nacházíme IgM-protilátky proti flagellinu (p41) a Osp C (p 21/22 a p25). IgM protilátky proti flagellinu (p41) jsou často první odpovědí imunitního systému po kontaktu s Borrelií burgdorferi. Na druhé straně nelze v případě tohoto antigenu vyloučit nespecifické reakce (díky dobře známé zkřížené reaktivitě protilátek proti flagllinu, který se vyskytuje také u ostatních mikroorganismů majících bičík). Proto také jediný proužek v pozici flagellinu (p41) není specifickým indikátorem infekce Borrelií burgdorferi. V případě, kdy se vyskytne jediný proužek v této pozici doporučujeme odebrat po několika týdnech nový vzorek séra a test opakovat. Výsledek Negativní Suspektní Pozitivní Charakteristika Žádné hodnotitelné antigenní proužky nebo slabá intenzita některých proužků z kategorie 1. Jeden antigenní proužek z kategorie 2 (flegellin, p 41). Doporučujeme po několika týdnech odebrat nový vzorek a test opakovat. Alespoň jeden zřetelný proužek z kategorie 3 (antigeny z kategorie 3 mají ve vyhodnocovacím protokolu šedý odstín). Klinické projevy infekce Borrelia burgdorferi Borrelia burgdorferi je druh bakterie patřící do čeledi spirochaetaceae. Tato čeleď zahrnuje pět rodů: borrelia, spirochetes, cristispira, treponema a leptospira. Borrelia burgdorferi je patogenem onemocnění borelioza (Lymská borelioza nebo Lymská nemoc; 7, 8), které se přenáší přisátím klíštěte. Protilátky proti Borrelia burgdorferi se objevují převážně u specificky infikovaných osob. Prevalence těchto protilátek v normální populaci v Německu je v průměru méně než 15% - nepočítaje endemické oblasti. U osob pracujících v zalesněných oblastech nalézáme protilátky ve 40% případů. Infekce Borrelia burgdorferi se může manifestovat v oblastech dermatologie, neurologie, oftalmologie a interní medicíny. Klinické projevy boreliozy se dělí do tří stádií: I.stadium: Typickou primární manifestací infekce Borrelia burgdorferi je erythema chronicum migrans, cirkulární zčervenání kůže v okolí klíštěcího kousnutí. Erytém je doprovázen celkovými chřipkovými symptomy s horečkou, zimnicí a třesavkou, s bolestí hlavy a zvracením. V některých případech se může objevit lymfadenopatie (lymphadenosis cutis benigna). Ve stadiu I. může dojít ke spontánnímu uzdravení nebo se může rozvinout generalisovaná borreliosa. Přechodná fáze je asymptomatická: IgM protilátky proti antigenům Borrelia burgdorferi jsou sérologicky detekovatelné u 50% až 90% pacientů. Prevalence IgG protilátek je významně nižší. Přesto v tomto stádiu jsou serologické výsledky často negativní. Jsou-li přítomny odpovídající symptomy, doporučujeme sledovat pacienta několik týdnů. II.stadium: Několik týdnů až měsíců po kousnutí klíštětem se může rozvinout množství symptomů. V popředí jsou neurologické symptomy: meningitida, encefalitida, asymetrická polyneuritida, parézy hlavových nervů, Bannwarthova lymfocytární meningoradiculoneuritida. Rovněž nacházíme často artritidu, především kolenního kloubu, nelokalizované bolesti kostí, kloubů a svalů. Méně časté jsou kardiologické projevy - myokarditida a perikarditida. Protilátky proti Borrelia burgdorferi jsou detekovatelné u 50% až 90% pacientů. V časné fázi tohoto stadia nalézáme hlavně IgM protilátky, v pozdní fázi pak často pouze IgG. Přesto IgM protilátky mohou dlouho přetrvávat. III.stadium: Typickými projevy infekce Borrelia burgdorferi ve stadiu III. jsou chronická relapsující erosivní artritida, acrodermatitis chronica atrophicans a progresivní encefalomyelitida, která může přejít ve sclerosis multiplex. Bez léčby se může terciární stadium rozvíjet během let až dekád po původní infekci. V tomto stadiu IgG protilátky významně narůstají u 90% až 100% pacientů, zatímco IgM jsou detekovatelné jen zřídka.
Infekce Borrelia Burgdorferi může být serologicky diagnostikována u mnoha pacientů s různou symptomatologií (např. rozsáhlé artritické potíže nebo závažné neurologické symptomy), jejichž příčina byla dříve nejasná. Pro diagnozu neuroboreliosy je rozhodující nález protilátek v mozkomíšním moku, protože zde zřídka (narozdíl od séra) dochází ke zkřížené reakci, která by mohla ovlivnit výsledky testu, proto je pozitivní reakce očekávána pouze v případě neuroboreliozy. K detekci protilátek proti Borrelia burgdorferi přicházejí v úvahu různé techniky: ELISA, imunofluorescence, pasivní hemaglutinace a WESTERN BLOT. ELISA test je často používán paralelně s nepřímou imunofluorescencí k předběžnému zhodnocení vzorku séra. Substráty používané v EUROIMMUN Anti-Borrelia-burgdorferi-imunoflorescence-testu, objednací číslo: FI 2132 a v EUROIMMUN Anti-Borrelia-burgdorferi-ELISA, objednací číslo: EI 2132 poskytují úplné antigenní spektrum této bakterie. Soudí se, že používání přípravků tohoto typu poskytuje vyšší úroveň diagnostické přesnosti než použití jednotlivých antigenů. EUROIMMUN Anti-Borrelia-burgdorferi- WESTERN BLOT, objednací číslo: DY 2132, je zvláště vhodný k diferenciaci pozitivních vzorků séra. Literatura 1. Johnson, R., Schmid, G.P., Hyde, F.W., Steigerwald,A.G., Brenner, D.J.: Borrelia burgdorferi sp. nov.: Etiologic agent of lyme disease. Int. J. Syst. Bacteriol.34:496-497 (1984). 2. Burgdorfer, W., Barbour, A.G., Hayes, S.F., Benach, J.L., Grunwaldt, E., Davis, J.P.:Lyme disease - A Tick - Borne Spirochetosis? Science 216: 1317-1319 (1982). 3. Ma, B., Cristen, B., Leung, D., Vigo-Pelfrey, C.: Serodiagnosis of Lyme Borreliosis by Western Immunoblot: Reactivity of varius significant antibodies agains Borrelia burgdorferi. J. Clin. Microbiol. Feb./92: 370-376. 4. Zöller, L., Burkard, S., Schäfer, H.: Validity of Western Immunoblot band patterns in the serodiagnosis of Lyme Borreliosis. J. Clin. Microbiol. Jan./91: 174-182. 5. Moskophidis, M., Luther, B.: Wertigkeit des Immunoblots in der Serodiagnostik der Lyme- Borreliose. LAB-med 19: 231-237 (1995). 6. Tilton, R.C., Ryan, R.W.: The laboratory diagnosis of Lyme disease. J. Clin. Immunoassay. 16: 208-214 (1993). 7. Horst, H.: Einheimische Zeckenborreliose (Lyme-Krankeit) bei Mensch und Tier. perimed- Fachbuch-Verlagsgesellschaft mbh, Erlangen (1991). 8. Kienholz, S., Ohly, C., Kienholz, M,: Zecken: Infektionen mit Borrelia burgdorferi. Diagnose und Labor 42: 74-82 (1992).