Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Část 22 Analytická HPLC Kvalitativní analýza Cílem kvalitativní analýzy je identifikovat pík chromatogramu nebo konkrétní složku v eluentu. Pokud je chemické složení zcela neznámé, můžeme využít při identifikaci některou ze speciálních analytických technik. Další možností je získání většího množství materiálu semi-preparativní nebo preparativní HPLC a ten potom analyzovat off-line různými analytickými metodami. Jestliže naopak ve vzorku předpokládáme přítomnost několika komponent, můžeme pro nejjednodušší určení porovnat hodnoty k neznámých píků a referenčních látek, které byly naměřeny za stejných chromatografických podmínek. Jestliže se shodují retenční časy píků, mohlo by se jednat o stejné látky. Nicméně měly by být provedeny ještě další experimenty, aby byla identifikace spolehlivější: a) Referenční látka je přimíchána do vzorku. Zkoumaný pík by měl být vyšší, bez toho aniž by byla přítomna raménka nebo se projevilo rozšiřování píku. Kolona s větším

počtem teoretických pater má větší schopnost rozlišit dvě podobné látky se srovnatelným chromatografickým chováním. b) Stejný test by měl být proveden i s jinou mobilní a nejlépe i jinou stacionární fází. Fáze by měly mít diametrálně rozdílné vlastnosti (třeba normální vs reverzní fáze). Pokud sledovaný pík nejeví ani při jedné analýze známky separace, je velmi pravděpodobné, že se jedná o identické látky. Už jsme zmínili, že zkoumaný pík musí být důkladně analyzován, aby mohl být určen s potřebnou jistotou. K dalšímu zlepšení kvalitativní analýzy můžeme dospět i bez větších výdajů následujícími postupy: a) Specifičtější detektor přispívá k identifikaci píku. RI detektor je univerzální a zachytí všechny složky, ale UV detektor dává odezvu jen pro absorbující látky a fluorescenční detektor reaguje jen na fluoreskující sloučeniny. Ještě vyšší specificity (u fluoreskujících látek) může být dosaženo nastavením excitační a emisní vlnové délky. b) Změna zaznamenávané vlnové délky UV detektoru musí být doprovázena stejnou odezvou signálu vzorku i reference. To znamená, že relativní nárůst i pokles by měl být stejný. Poměr absorbancí při dvou vlnových délkách je specifický pro každou látku. c) Poměr signálů UV a za ním zapojeného RI detektoru (nebo jiné dvojice detektorů) je za daných podmínek pro látku charakteristický. Průkaznější, nicméně náročnější, jsou speciální metody. Zejména diodové pole a spřažené techniky s hmotností spektrometrií jsou v kvalitativní analýze využívány. Vlivem použitého rozpouštědla vzorku mohou vznikat píky související se změnou indexu lomu eluentu (tzv. refractive index peaks) a nesmí být zaměňovány za píky analytu (obr. níže). Vždy je lepší vzorek rozpouštět v samotné mobilní fázi, abychom se těmto neočekávaným píkům vyhnuli. Nicméně pokud není možné vzorek rozpouštět v mobilní fázi, můžeme provést slepý pokus s čistým solventem. Porovnání retenčních časů je významně ovlivněno stabilitou průtoku mobilní fáze kolonou a je tak méně citlivé než metoda nástřiku směsi reference se vzorkem.

Stopová analýza Jestliže je cílem analýzy kvantitativní nebo kvalitativní analýza látek v nízkých koncentracích, je nezbytná optimalizace chromatografického systému. Při izokratické eluci vždy platí, že je koncentrace v maximu píku c max nižší než koncentrace v nástřiku c i. kde: V i je objem nastříknutého vzorku, V R je retenční objem, V R = t R F, a N je počet teoretických pater kolony. (S gradientovou elucí je c max vyšší než vychází z výpočtu pomocí tohoto vzorce.) Příklad Je nastříknuto 10 µl roztoku s koncentraci zkoumaného analytu 1ppm (10-6 g ml -1 ). Retenční objem odpovídajícího píku je 14 ml. K tomuto píku je vyčíslen počet teoretických pater kolony na 10 000. Jaká je koncentrace v maximu píku (c max )? Řešení Pro stopovou analýzu je nezbytné získat nejvyšší signál, to znamená nejvyšší možnou koncentraci v maximu píku. Jak toho docílit? Příklad Pro separaci z úlohy výše byla použita kolona o délce 15 cm, vnitřním průměru 4,6 mm a náplní 5 µm. Koncentrace v maximu píku 0,028 ppm poskytla signál 1mV na UV detektoru. Vypočtěte intenzitu signálu při následujících podmínkách (všechny ostatní parametry zůstávají nezměněny). a) délka kolony je 25 cm,

b) vnitřní průměr kolony je 3 mm, c) náplň kolony tvoří částice o průměru 3,5 µm. Řešení a) Jestliže je náplň nové kolony identické kvality, je výška teoretického patra H stejná. Proto je počet teoretických pater N, stejně tak retenční objem V R, 25 cm dlouhé kolony 1,7 násobně vyšší (25 : 15 = 1,7). b) odpovídající signálu 0,8 mv. odpovídající signálu 2,4 mv. c) S identickou náplní kolony s částicemi 3,5 µm bude teoretický počet pater 1,4 krát vyšší (5,0 : 3,5 = 1,4). odpovídající signálu 1,2 mv. Je jasné, že nejmenšího ředění a nejvyššího píku je dosaženo, jestliže je použita krátká a hlavně úzká kolona s největším možným počtem teoretických pater. Separační účinnost kolony je důsledkem její kvality, použití dobré náplně, ale nikoliv její délky. Delší kolona dává nižší koncentrace v maximech píků, protože V R stejně jako N jsou úměrné délce kolony L C, tudíž c max závisí na. S danou koncentrací vzorku c i je ředění píků menší s větším objemem nástřiku, vyšším počtem pater a menším retenčním objemem. Dříve zmíněná rovnice může být napsána i jiným způsobem (protože a ):

kde: d C je vnitřní průměr kolony, ε je celková porozita, k je retenční faktor, L C je délka kolony, a H je výška teoretického patra. Nyní je nejlepší strategie zřejmá: - Použít kolonu s malým vnitřním průměrem. Dvojnásobné zúžení znamená čtyřnásobné zvýšení c max - Použít krátkou kolonu - Použít náplň kolony s malou výškou teoretického patra. Toho je dosaženo menšími částicemi, výborným plněním a stacionární fází s dobrými vlastnostmi přenosu hmoty. Kolona musí být provozována ve svém van Deemterovském optimu - Eluovat analyt s malým retenčním faktorem Ačkoli jsou preferovány krátké kolony, musí být zároveň dostatečně dlouhé k dosažení dělení směsi. Metoda musí být optimalizována s ohledem na stopové složky. Z rovnice rovněž vyplývá, že látkové množství vzorku (neboli součin c i V i ) by mělo být velké. Může dokonce docházet i k přetížení kolony majoritní složkou pokud není ovlivněno rozlišení stopového píku (obr. níže). Nicméně objem nástřiku je na druhou stranu omezen kvůli rozšiřování píku. Největší objem nástřiku, který způsobí rozšiřování pásů do 9% je dán:

Je možný i alternativní způsob zápisu rovnice (protože retenční čas a rychlost průtoku ): Pokud máme k dispozici dostatečné množství vzorku (např. analýzy potravin), je možné nastříknout V i max, i když budou dříve eluované píky široké nebo hlavní složka přetíží kolonu (za předpokladu, že se tím nezmění rozlišení pro stopový analyt). Tím pádem bude koncentrace v maximu píku definována ze spojených rovnic pro c max a V i max : Toto je nejpříznivější situace pro izokratickou eluci (a 9% rozšiřování píků) i přes to, že je čtyřnásobné ředění poměrně velké. Všimněte si, že za těchto podmínek (dostatečné množství analytu a nástřik V i max ) nemají dříve zmíněné požadavky, jako jsou dostatečně krátká a úzká kolona, malá výška teoretického patra a krátký retenční čas, žádný význam. Jestliže V i max neovlivňuje rozlišení, rovnice c max = 0,24c i platí i pro široké, dlouhé a špatně naplněné kolony. Nicméně je vždy žádoucí optimalizovat separační proces, protože tím ušetříme čas a množství potřebného solventu. Ve stopové analýze musíme rovněž vzít v úvahu některé další skutečnosti: a) Vyhýbáme se chvostování. Asymetrické píky jsou širší, a tím pádem i nižší než symetrické píky.

b) Gradientovou elucí jsou píky zužovány, a proto jsou i vyšší. Jestliže není možné eluovat složku ve stopové koncentraci při nízkém retenčním faktoru, je doporučováno využít gradientovou eluci. Může být použit skokový gradient, který je při správném načasování jednoduchým a efektivním řešením. c) Měli bychom použít detektor s nejnižším možným detekčním limitem. Detektory na principu měření obecných vlastností, jako index lomu aj., nejsou pro stopové analýzy vhodné. Používanější jsou detektory fluorescenční, elektrochemické, nebo UV detektory, se kterými můžeme maskovat interferující nečistoty volbou vhodné vlnové délky. Podobného efektu se dá docílit i pomocí MS detekce sledováním charakteristického iontu. Zlepšení meze detekce až o několik řádů můžeme dosáhnout derivatizací analytů. Při stopových analýzách může být občas přesnější kvantifikace pomocí výšky píku, než integrací jeho plochy. Ačkoli je pro kvantitativní analýzu nezbytný poměr signálu k šumu alespoň 10, pro kvalitativní analýzu je postačující poměr lepší než 3. Při stopové analýze je nejdůležitější správná příprava vzorku (pokud to jde i s obohacením/zkoncentrováním analytu). Samotná HPLC poskytuje účinné možnosti zakoncetrování. Pokud má rozpouštědlo malou eluční sílu, je vzorek zachycen a koncentrován přímo na vstupu do kolony. Jestliže je potom použit eluent s vysokou eluční silou, omezuje se rozšiřování píků a koncentrace v maximu píků jsou vysoké. Tento postup je nejefektivnější pokud se dá provozovat při k = 0, tzn. s rozpouštědlem na čele. Tato technika je označováno jako vytěsňovací chromatografie (displacement chromatography). Například se podařilo 4 000 krát obohatit fenoly ve vodách na stacionární fázi styren-divinylbenzenu. Pro oddělení hlavního analytu od stopových látek může být využita technika přepínání kolony (column switching). Limity stanovitelnosti a detekce budou rozebírány i v jiné části textu. Kvantitativní analýza Signál detektoru je v HPLC mnohem více závislý na vlastnostech specifické složky než v plynové chromatografii. Například absorpce UV je funkcí molárního absorpčního koeficientu, který se pohybuje pro různé látky od 0 až po 10 000 l mol -1 cm -1. Absorpční

koeficient se rovněž liší pro jednotlivé látky homologických řad. Z tohoto důvodu je nezbytné vytvořit kalibrační závislost pro každou stanovovanou látku. Kalibrace může být provedena třemi různými metodami: externím (vnějším) standardem, interním (vnitřním) standardem a standardním přídavkem (viz obrázek dole). Celý postup je zde vysvětlen na jednobodové kalibraci, i když je v každém případě lepší provádět kalibraci alespoň na tři nebo více bodů. V takovém případě potom nejsou výpočty prováděny jednoduchou trojčlenkou, jak je uváděno níže, ale pomocí regresní analýzy kalibračního grafu. Kalibrační závislost by měla být lineární a měla by procházet počátkem souřadnicového systému. Jestliže používáme ke kvantifikaci starší kalibraci, je možné, že se současné chromatografické podmínky liší od těch minulých, a tím roste systematická chyba měření. Pro kvantitativní analýzu můžeme využít plochy i výšky píků, v následujícím textu slovem signál budeme označovat obě možnosti. Modelovým příkladem bude stanovení glukózy v limonádách. Obsah glukózy předpokládáme asi kolem 5 g l -1. Tři kalibrační postupy v tomto případě budou následující: a) Metoda externího standardu. Připravíme roztok standardu o známé koncentraci 6 g l -1 (není důležité, aby byla přesně 6,000 g l -1, ale musí být přesně známa). Plocha píku tohoto roztoku S std byla 5400 a plocha píku neznámého vzorku S vz byla 3600.

b) Metoda interního standardu. Ke vzorku i ke standardu (z odstavce a) přidáme stejné množství jiné látky, která není přítomna ve vzorku. Například přidáme fruktózu (obsah v obou roztocích 10 g l -1 ). Plochy píků pro glukózu jsou stejné, jako v předchozím případě. Plochy píků fruktózy jsou pro oba roztoky stejné, rovny 6300. Z uvedených měření je možné vypočítat poměr signálů, který udává i poměr obsahu složek. c) Metoda standardního přídavku. Do vzorku je přidáno známé množství analytu. V tomto případě tedy přídavek glukózy 5 g l -1. Plochy píků jsou 3600 pro samotný vzorek a 8100 pro vzorek s přídavkem. Metoda externího standardu je nejjednodušší a měla by být použita jen pro jednodušší analýzy. Nástřik musí být v tomto případě proveden s dobrou reprodukovatelností, proto je doporučován nástřik vzorku s využitím zcela naplněné smyčky. Při vícebodové kalibraci není vhodné nastřikovat různé objemy vzorku a referenčních standardů (např. 10, 20, 30, 40 a 50 µl), protože není možné zajistit dostatečnou přesnost a správnost těchto nástřiků. Je výhodnější připravit množství kalibračních roztoků s různými koncentracemi a nastříknout pokaždé stejný objem (pomocí zcela naplněné smyčky nebo alespoň stejným postupem, kterým byl dávkován vzorek). V případě kalibrace na vnitřní standard odchylky v objemu nástřiku nejsou podstatné. Tato metoda je preferována, pokud je příprava vzorku složitá. Přídavek standardu probíhá před samotnou úpravou vzorku. Výběr vhodného vnitřního standardu není jednoduchý. Musí být dostatečně čistý, s přesně definovaným složením a podobnými vlastnostmi, jaké má analyt zejména ohledně úpravy vzorku, chromatografické separace a samozřejmě konečné detekce. Navíc by měl být pík standardu v chromatogramu vmezeřený mezi ostatními píky, ne na začátku ani na konci záznamu.

Standardní přídavek je elegantní metoda pokud máme k dispozici neomezené množství vzorku. Umožňuje analýzu kalibrovat za realistických podmínek se všemi intercedenty, tedy v aktuální matrici. Metody standardního přídavku a vnitřního standardu mohou být navzájem kombinovány. Definovat, jak často je třeba provádět kalibraci, je důležitou součástí validace analytických postupů. Je rovněž nezbytné zvážit možné chyby v kalibračních křivkách. V obrázku níže je vidět rozdíl mezi konstantní systematickou odchylkou a úměrnou systematickou odchylkou. V prvním případě kalibrační křivka neprochází počátkem. Odchylka může být pozitivní (jako v tomto grafu), ale i negativní. Při použití metody standardního přídavku tento typ chyby nemůžeme určit! Křivka s úměrnou chybou má odlišný sklon, který může být větší nebo menší. Oba typy odchylek se mohou objevovat současně a mohou být odhaleny určením výtěžnosti. Pro nalezení meze stanovitelnosti (LOQ) bylo navrženo mnoho metod. Musí být definována nejnižší koncentrace analytu, kterou je potřeba stanovit s požadovanou správností a opakovatelností. Nejpragmatičtějším přístupem je stanovit si horní limit standardní nejistoty opakovatelnosti a najít jej experimentálně. Mělo by být analyzováno nejméně šest různých koncentrací v okolí očekávaného LOQ a každá koncentrace stanovena nejméně šestkrát.

Příklad Bylo analyzováno šest roztoků různých koncentrací s matricí, každý z nich desetkrát. Požadavek na opakovatelnost je specifikován maximální relativní standardní nejistotou 10%. Byla zjištěna následující data: c [ppm] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 5 5,38 4,06 5,48 5,52 5,70 6,12 4,30 5,18 5,44 4,17 10 8,09 9,36 11,29 9,92 10,76 10,50 9,35 11,38 10,21 12,78 15 17,05 13,21 18,76 17,45 16,05 14,68 14,19 14,03 17,59 15,82 20 17,86 19,36 20,87 18,97 18,37 19,82 17,90 18,25 23,42 22,79 25 21,59 24,22 20,33 27,41 26,54 25,99 24,63 26,90 23,55 22,76 30 31,03 28,82 32,32 27,84 31,86 31,37 26,96 25,47 30,91 33,09 Jaký je LOQ? Řešení c [ppm] Průměr x Standardní nejistota s(x) RSD [ppm] [ppm] [%] 5 5,14 0,71 13,8 10 10,4 1,31 12,6 15 15,9 1,82 11,5 20 19,8 2,00 10,1 25 24,4 2,37 9,7 30 30,0 2,54 8,5 Požadovaná odchylka je nalezena při LOQ rovném 20 ppm. Limit stanovitelnosti záleží na vlastnostech analytu, které zaznamenává detektor a hodnotě k. Mez detekce (LOD) je rovna 30% LOQ, to znamená, že v úloze by byl LOD = 7 ppm. Gradiendová eluce může být zdrojem dalších chyb, proto je při kvantitativní analýze doporučováno pracovat s elucí izokratickou. Mimo to je nezbytné, abychom udrželi průtok (pro určení ploch píků) nebo složení mobilní fáze (pro určení výšek píků) konstantní (bude ukázáno později v níže uvedeném obrázku).

Vzorek by měl být rozpuštěn v mobilní fázi, protože pokud se liší rozpouštědlo a mobilní fáze může být analýza méně přesná; je rovněž možné, že odezva detektoru je silně závislá na rozpouštědle. Závěrem je třeba říci, že kvantitativní analýza nesmí být prováděna, pokud je přetížena kolona a pokud odezva detektoru není v lineární oblasti kalibrační závislosti. Je třeba prověřit tyto okolnosti pro všechny experimenty. Správnost může být zlepšena termostatováním kolony. Dále bychom si měli uvědomit, že není možné dělat kvantifikaci asymetrických píků. Ověření analytických výsledků můžeme provést několika způsoby. Výtěžnost Pro zjištění možných chyb výsledků plynoucí z úprav vzorků nebo ze samotné matrice je nezbytné určit funkci výtěžnosti a hodnotu výtěžnosti. Postup (výtěžnost přípravy vzorku) a) Analýzou čistého referenčního materiálu, který nebyl podroben postupu zpracování vzorku (nebo byl vynechán krok úpravy). Vyčíslíme kalibrační přímku: Kde: y = signál x 0 = hmotnost nebo koncentrace referenčního analytu a 0 = úsek na ose y b 0 = směrnice přímky b) Čistý referenční analyt je zpracován stejným postupem jako vzorek. Řešení plyne z kalibrační funkce: Kde x p je hmotnost nebo koncentrace analyzovaného referenčního materiálu po zpracování. c) Vypočítané hodnoty x p vyneseme do grafu proti příslušným hodnotám x 0 a následně určíme funkci výtěžnosti:

Kde index p vyjadřuje, že jde o parametr veličiny po zpracování vzorku. d) Následně vypočítáme hodnotu výtěžnosti (recovery rate): V ideálním případě by funkce výtěžnosti měla mít lineární průběh s úsekem a p = 0 a směrnicí b p = 1. Pokud a p 0 je v postupu konstantní systematická chyba a jestliže je b p 1 postup úpravy vzorku obsahuje úměrnou systematickou chybu. Funkce i hodnota výtěžnosti mohou být určeny pro každý krok postupu úpravy vzorku zvlášť. To nám dovolí jednoduše nalézt kritické části postupu a zaměřit se na jejich optimalizaci. Následně můžeme stejnou metodiku použít i pro určení matricových efektů se vzorky obohacenými přídavkem standardu. Příklad Následující plochy píků byly naměřeny pro roztok aflatoxinu bez úprav vzorku. 10 ng 2432 20 ng 4829 30 ng 7231 40 ng 9628 Stejné měření bylo provedeno po extrakci vzorku na pevnou fázi. Získaná data byla následující: 10 ng 1763 20 ng 4191 30 ng 6617 40 ng 9050 Vypočítejte funkci i hodnotu výtěžnosti. Posuďte funkci výtěžnosti. Řešení a) Kalibrační křivka získaná lineární regresí je:

b) Tato funkce má úsek na ose y (konstantní systematickou chybu). Důvod tkví pravděpodobně v samotné HPLC separaci a měl by být nalezen a odstraněn později. Analogicky je x(20)=17,3 ng, x(30)=27,4 ng a x(40)=37,6 ng. c) Funkce výtěžnosti je nalezena lineární regresí bodů [x p ; x 0 ] tedy [7,2; 10], [17,3; 20], [27,4; 30] a [37,6; 40]: Směrnice je téměř ideální, je zde pouze 1% úměrná systematická chyba. Na ose y je patrné konstantní systematické vychýlení. Znamená, že nalezený obsah aflatoxinu bude nižší o 2,91 ng. Z toho plyne, že extrakce na pevnou fázi musí být zlepšena. d) Kvůli této chybě je hodnota výtěžnosti závislá na absolutní hmotnosti vzorku: Analogicky je RR(20)=86,5%; RR(30)=91,3% a RR(40)=93,7%. Odhad výšky a plochy píku pro kvantitativní analýzu Pro dobře rozlišené píky jsou plocha i výška úměrné koncentraci analytu. Proto je možné vybrat pro kvantifikaci libovolný z těchto parametrů. Obecně je integrace píku přesnější, ale mělo by to být otestováno v rámci validace konkrétní metody. Pro stopovou analýzu je naopak lepší posuzovat výšky píků, protože při nízkém poměru signál/šum je integrace obtížná. Při kvantifikaci píků narážíme na dva hlavní problémy, kterým je třeba věnovat pozornost: vliv vnějšího parametru na výšku a plochu a chyby pocházející z překryvu píků. Vliv retence a rychlosti toku na výšku a plochu píku Vlivy těchto parametrů na kvantifikaci ukazuje obrázek níže. a) Při izokratické separci je výška píku silně ovlivněna retencí (%B solventu). Rychle eluované píky jsou úzké a vysoké (vysoký %B), ale píky s delší retencí jsou nízké a

široké (nízký %B). Pro kvantifikaci pomocí výšky píku je nutné, aby bylo složení mobilní fáze stejné při kalibračních měřeních a analýzách (například u namíchaných eluentů z důvodu vypařování složky s nižším bodem varu během dne). Výška je minimálně ovlivněna změnami v průtoku a je řízena van Deemterovou rovnicí. b) Plochy píků, při použití koncentračně citlivých detektorů, jsou silně ovlivněny změnami průtoku mobilní fáze. Pokud analyt protéká pomalu detekční celou, bude i jeho pík v chromatogramu široký, ale výška píku je ovlivněna pouze koncentrací v maximu, proto bude i plocha píku velká. Na druhou stranu pokud analyt protéká rychle, bude plocha jeho píku malá. Z tohoto důvodu je pro kvantifikaci pomocí plochy píků nutné použít čerpadla, které poskytují stabilní průtok mobilní fáze, dokonce, i když se mění odpor. Plocha píku je minimálně ovlivněna %B.

Překrývající se píky Překryv píků je významným zdrojem chyb při kvantifikaci. Důvod je zcela zřejmý (viz obrázek níže).

Pokud integrátor rozdělí dva píky vertikální přímkou, jejich části přesahují a stávají se tak součástí druhého píku. Ani rozdělení podle tečen místo vertikální přímky nevede k přesné ploše píku (tato metoda je často používaná jako tzv. rider peaks ). Obrázek níže ukazuje vliv integrace pro různá rozlišení, asymetrie a pořadí eluce píků. Vlivy s ohledem na plochy píků mohou být shrnuty v několika bodech: a) S Gausovskými (symetrickými) píky je velký pík zvětšen a malý je naopak zmenšen nehledě na pořadí, ve kterém jsou eluovány. Pouze pokud jsou oba píky symetrické i stejně velké nedopouštíme se rozdělením svislou přímkou žádné chyby. b) Pokud píky chvostují je plocha prvního z nich znevýhodněna a druhý je naopak zvětšen nehledě na poměr velikostí signálů. c) Poměr relativních chyb je nepřímo úměrný k poměru ploch píků. To znamená, že jsou malé píky ovlivněny více. Zde je několik rad, jak se vyhnout těmto chybám:

a) Dosáhněte úplného rozlišení píků! Nezbytná hodnota rozlišení závisí na poměru velikostí píků. Pro píky srovnatelné velikosti postačuje rozlišení R = 1,5, ale není dostatečné pro rozdělení píků s poměrem velikostí 20:1 a více. b) Určení výšky píku je v některých případech přesnější než integrace. Kvantifikace pomocí výšky píků je téměř prosta chyb i v případě chvostování, kdy je malý pík eluován před větším. c) Vyhněte se chvostování. Chvostování snižuje rozlišení a má negativní vliv na integraci malých píků před většími. Chvostování můžeme zabránit snížením mimokolonového objemu v přístroji, dobrým naplněním kolony, použitím vhodné stacionární a mobilní fáze, rozpuštěním vzorku ve vhodném rozpouštědle a nepřetěžování kolony.

Chyby při integraci Elektronické integrátory a datové systémy jsou nepostradatelné, ale z jejich používání vyplývají i chyby, které mohou být přehlédnuty. K seznámení s touto problematikou může pomoct kniha sepsaná Dysonem 1 nebo jiné souhrnné práce. Mohou se objevit různé druhy chyb, nejzávažnější jsou prezentovány v následujícím obrázku. 1 N. Dyson, Chromatographic Integration Methods, Royal Society of Chemistry, London, 2nd edn, 1998.

Druhy chyb a) Nedostatek datových bodů. Ke správnému popisu tvaru píku je potřeba zaznamenat minimálně 10 bodů. Jestliže je sběr datových bodů příliš pomalý, nebude možné správně určit výšku ani plochu píku. Vyhlazování původních dat pomocí integrátoru není v tomto případě správné řešení. Rychlost sběru dat se může a někdy i musí měnit během záznamu chromatogramu. b) Příliš vysoká časová konstanta. Pomalá elektronika detektoru nebo integrátoru zkresluje výstupní signál. Platí, že plocha píku je téměř neovlivněna, výška je

zmenšena a chvostování vzroste. Bude zegistrováno snížení rozlišení mezi sousedícími píky. c) Vysoko položená prahová hodnota signálu (treshold). Integrátor rozezná pík, pokud je signál výš než základní linie. Treshold by měl být správně nastaven a musí být nad hodnotou šumu. V každém případě je plocha i výška píku zmenšena, pokud je treshold nastaven přliš vysoko. d) Velký šum. Není možné provádět správnou integraci, pokud je malá hodnota podílu signál/ šumu. Výsledky budou nahodilé dokonce, i když bude použit datový systém dovolující definovat základní linii až po dokončení analýzy. Pro dobrou integraci píku by měl byt podíl signál/šum alespoň 10. e) Drift základní linie. Integrátor obvykle počítá s přímou základní linií. Jestliže je skutečná základní linie zakřivená, bude vypočtená plocha menší než skutečná. f) Neúplné rozlišení. Nákres ukazuje pouze dva nejčastější problémy. Je lepší použít rozdělení tečnami nebo kolmicí? S výjimkou ideálních případů je důsledkem špatného rozlišení vždy chyba v integraci. Asymetrie píků je dokonce ještě zásadnější. V řadě případů nejsou chyby v integraci kompenzovatelné nástřikem standardů a určením kalibračních faktorů, protože roztoky standardů jsou obvykle méně složité než reálné vzorky. Detekční vlnová délka Pokud používáme klasický UV detektor, musíme zvolit určitou vlnovou délku pro záznam chromatogramu (samozřejmě to není potřeba při využití detektoru s diodovým polem diode array detector). Je potřeba zohlednit několik skutečností: a) UV spektra různých složek vzorku, hlavně vlnové délky jejich absorpčních maxim; b) molární absorpční koeficienty v maximech a při vlnové délce, která nakonec bude vybrána k záznamu chromatogramu; c) retenční faktory různých složek. Při izokratické eluci jsou píky postupně širší, a proto i nižší; d) důležitost jednotlivých složek vzorku (v některých případech je třeba kvantifikovat pouze jedinou složku).

Čím jsou píky nižší, tím více je ovlivňuje šum. Tím je zhoršena přesnost a pravděpodobně i správnost kvantitativní analýzy. Proto by měly být píky důležitých komponent eluovány co nejdříve a detekovány ve svých absorpčních maximech. Obecně platí, že při detekci na kratších vlnových délkách je analýza méně robustní, je větší nebezpečí, že se objeví tzv. systémové píky. Základní linie je při gradientové separaci náchylnější k driftování. Je nutné vhodnost zvolené vlnové délky ověřit na daném přístroji a provádět pravidelně testy aparatury, abychom byli schopni zaručit dlouhodobou správnost. Dokonce i malá odchylka od správné vlnové délky může znamenat zásadní chybu v analytických výsledcích. V chromatogramech níže by měla být správná vlnová délka pro stanovení nitropenty (poslední pík) 214 nm, což je absorpční maximum látky. Pokud je vlnová délka změněna na 216 nm důsledkem chyby v nastavení nebo nezaregistrovanou změnou v optice přístroje, poklesne plocha píku nitropenty na 85% skutečné hodnoty, zatímco ostatní píky tak podstatně ovlivněny nejsou. Derivatizace Detekce je největší problém spojený s HPLC. Pokud nemůžeme použít citlivý detektor (např. fluorescenční), je detekční limit mnohem vyšší než v plynové chromotografii s plamenovým ionizačním detektorem. Derivatizační reakce jsou vhodným nástrojem pro zvýšení detekčního limitu v kapalinové chromatografii.

Derivatizace je definovaná změna analytu pomocí chemické reakce a může být provedena před nástřikem (předkolonová derivatizace), nebo mezi kolonou a detektorem (pokolonová derivatizace). Předkolonová derivatizace Výhody a) Mohou být libovolně zvoleny reakční podmínky b) Reakce může být pomalá c) Derivatizace může sloužit i jako čistící a procesní krok d) Přebytek činidla může být odstraněn Nevýhody a) Během delší reakční doby se mohou tvořit vedlejší produkty b) Reakce by měla být kvantitativní c) Různé složky vzorku získají derivatizací podobné vlastnosti. To může vést ke snížení chromatografické selektivity. Pokolonová derivatizace: reakční detektory V tomto případě je činidlo přidáno do eluentu proudícího z kolony. Obecně by měl mít roztok činidla vysokou koncentraci, aby bylo ředění omezeno na minimum. Reakční cela je vyhřívána, protože reakce většinou probíhají rychleji při vyšší teplotě. Výhody a) Reakce nemusí proběhnout kvantitativně b) Může být zařazen jiný detektor před derivatizací, tzn. kolona UV detektor reakce s fluorescenčním činidlem fluorescenční detektor c) Může být použit vysoce specifický detektor (např. imunoassay) d) Je možné analyzovat látky, které dávají po reakci identické produkty (např. formaldehyd), protože separace je předřazena detekci Nevýhody

a) Reakce musí probíhat v použité mobilní fázi, což může být omezující b) Samo činidlo by nemělo být detekovatelné. Postkolonová derivatizace s cílem zlepšit UV detekci je prakticky vyloučena, protože všechna používaná činidla silně absorbují v UV oblasti. Třemi nejvýznamnějšími typy reakčních detektorů jsou: a) Otevřené kapiláry. Čím je kapilára užší, tím pozorujeme menší rozšiřování píků; průměr 0,3 mm je vhodný. Obrovskou výhodou je použití specificky prohnuté (spletené) kapiláry (knitted tube), aby došlo k dobrému promísení, a tím minimalizaci rozšiřování píků. Kapiláry jsou vhodné k reakcím, které proběhnou do 1 min (pro knitted tube až 5 min). b) Plněné (bed) reaktory. V podstatě se jedná o kolony, které jsou plněny neporézním materiálem (např. skleněné kuličky). Neporézní náplň je zcela nezbytná, protože umožňuje vznik různých proudů, a tím mísení. Reaktory jsou vhodné pro derivatizace, které probíhají mezi 0,5 a 5 minutami. Náplně v kolonách mohou být opatřeny vrstvou katalyzátoru nebo imobilizovaného enzymu, a tím se aktivně účastnit reakce. c) Segmentované systémy. Tok kapaliny je segmentován, tzn. rozdělen do menších zón, mezi kterými jsou bubliny nebo nemísitelná kapalina. Reakce probíhají pomalu (až 30 minut) a segmentací je zabráněno rozšiřování píků. Fáze jsou poté separovány před detektorem, ale může být využito i elektronické potlačení vzniklého šumu. Neočekávané píky: host peaks a systémové píky Kdykoli je možné, že se v chromatogramu objeví nečekané pozitivní nebo i negativní píky. Jestliže se tyto píky nedají reprodukovat, říkáme jim tzv. ghost peaks. Je nezbytné je eliminovat, i když to může být zdlouhavé a časově náročné. Důvodem pro vznik neočekávaných píků mohou být nejrůznější příčiny: bubliny v detektoru, nečistoty v mobilní fázi, rozdělení složek mobilní fáze, vymývání stacionární fáze z kolony (column bleeding), nedosažení rovnováhy během gradientových elucí, zbytky z předchozích nástřiků a mnoho dalších. Přesně reprodukované neočekávané píky jsou tzv. systémové píky. Objevují se v případě, že je mobilní fáze směsí několika složek a použitý detektor reaguje na složky s různou citlivostí, například máme-li v mobilní fázi stopové množství aromátů a detekce je prováděna při 254

nm. Při nepřímé detekci musíme s objevením systémových píků počítat vždy, dokonce i když je přechod od přímé na nepřímou detekci plynulý. K neočekávaným píkům můžeme rovněž dospět, pokud ke snížení limitu detekce použijeme detekce na nižší vlnové délce než obvykle. Neidentifikované systémové píky významně ovlivňují kvalitativní a kvantitativní analýzu (identifikace může být obtížná, protože systémové píky mohou být dokonce neviditelné!). Mohou způsobit zmenšení píků a zdvojení píků. Plochy individuálních píků závisí na jejich relativní poloze vzhledem k systémovým píkům! Proto v obr. dole nejsou plochy píků racemické směsi bupivakainu ekvivalentní.