EBV RNDr. K.Roubalová, CSc. www.vidia.cz kroubalova@vidia.cz
Biologie EBV: zařazení základní biologické charakteristiky interakce viru s hostitelem Epidemiologie a patogeneze: Infekční mononukleoza EBV a nádory Diagnostika: Sérologie Přímý průkaz viru Možnosti prevence
Zařazení a základní charakteristiky Schopnost navodit latentní infekci hostitelské buňky Schopnost reaktivace infekce Důsledky: celoživotní nosičství, rekurentní infekce, oportunní patogen
Velikost virionů: 200 nm Genom: 150 kb 100 čtecích rámců Přirozeným hostitelem je člověk, experimentálně lze infikovat některé druhy opic.
Dvoufázový životní cyklus Latence: Exprese strukturálních genů potlačena Transkripce omezena na latentní geny (regulační funkce) Virová DNA (episom) se replikuje synchronně s buněčnou DNA Produktivní cyklus Aktivace transkripce časných genů Kaskádová regulace exprese ostatních genů: proteiny α, β, γ Asynchronní replikace virové DNA Maturace kapsid (jaderná membrána) Tvorba obalu JM, ER, G Uvolnění nových virionů a zánik hostitelské buňky
Hostitelské buňky Receptor: CD21 CR2 Receptor pro C3d složku komplementu B-lymfocyty některé T-lymfocyty Latentní infekce: B-lymfocyty Nediferencované epiteliální buňky Produktivní infekce: Diferencované epitel. Buňky (slinné žlázy, bronchy, cervix) Diferencované B- lymfocyty
EBV transformace B- lymfocytů Proces podobný stimulaci B- lymfocytu antigenem: Aktivace buněčných signálních drah Blastická transformace Proliferace Virové latentní proteiny ovlivňují regulaci tohoto procesu: Inhibice apoptozy Deregulace signálních drah Deregulace terminální diferencieace
Epidemiologie Kosmopolitní rozšíření Přenos kontaktem s infikovanými tělními tekutinami (sliny) Vylučován v aktivní i latentní fázi infekce Promořenost dospělé populace >90% Primární infekce: 2-5 let, asymptomatické
Patogeneze Primární infekce u starších dětí a dospělých infekční mononukleosa (50%) Komplikace u IM: hepatitis, alergie (encefalitis, anemie, trombocytopenie, VAHS) Chronická aktivní infekce vzácná, (EBV+Tlymfocyty) Lymfoproliferativní onemocnění imunodeficienti Nádorová onemocnění EBV kofaktorem
EBV a nádory u imunokompetentních jedinců Burkittův lymfom - endemický (Afrika - 95% EBV+), - sporadický (Evropa, USA -20% EBV+) Nedifernencovaný nasofaryngeální karcinom (100% EBV+) Hodgkinova choroba (20-80% EBV+ podle histol typu) Sinonasální lymfomy NK/T buněk (100%) T-lymfomy(10-100%) Lymfoepiteliomy GIT,plic (100%) Vzácně přítomen i v jiných nádorech (adenokarcinomy GIT,karcinomy prsu)
EBV a lymfomy u imunodeficientních pacientů Transplantovaní: Posttransplantační lymfoproliferativní nemoc (PTLD), polyklonální monoklonální, primární lymfomy v mozku HIV+: Imunoblastické B-lymfomy (80% EBV+), Burkitt-like malobuněčné B-lymfomy (30-40% EBV+) Primární imunodeficience: XLP, Wiskott- Aldrich sy., Ataxia telangiectasia: B-lymfomy (30-80% EBV+)
Diagnostika EBV Nepřímá diagnostika průkaz EBVspecifických protilátek Anamnestické protilátky Protilátky akutní fáze Rozlišení: séropozitivita x aktivní infekce Primární infekce x reaktivace Metody: ELISA, NIF Heterofilní protilátky Paul-Bunnelův test Ericsonův test Přímá diagnostika- Stanovení hladiny virové DNA v krvi kvantitativní PCR Detekce virové DNA v biopsii hybridizace in situ
Diagnosticky důležité proteiny VCA: virový kapsidový antigen strukturální proteiny virové kapsidy, pozdní fáze replikačního cyklu EBNA1: EB-virový nukleární antigen 1, přítomen v jádru latentně infikovaných buněk EA: časný antigen nestrukturální proteiny v infikovaných buňkách v časné fázi replikačního cyklu. 2 složky: EA-D ( difuzní, jádro + cytoplasma), metanol senzitivní EA-R ( restricted, cytoplasma) EBNA 3, LMP1: latentní antigeny, dominantní pro buněčnou imunitu
Virové antigeny v testu NIF EA-D EA-R EA-R VCA
Charakteristické vzorce protilátek u EBV Typ protilátek Stádium infekce IgG proti VCA IgM proti VCA IgG proti EBNA 1 IgM proti EBNA 1 IgG proti EA IgA proti VCA IgM proti EA Latence ++ Avidita vysoká - ++ - +/- (anti R) +/- - Primoinfekce ++ Avidita nízká +/+++ +/- ++ ++ (anti D) +++ ++ reaktivace +++ Avidita vysoká + +++ +/- +++ (anti D i R) ++ +/- Chronická infekce Nemá charakteristický vzorec protilátek
Problémy s interpretací sérologických nálezů Falešné pozitivity: Křížová reaktivita HV Kaskádová reaktivace herpetických virů Polyklonální aktivace Polyspecifické protilátky Autoprotilátky RF, molekulární mimikry Falešné negativity: Interakce viru s imunitním systémem Imunodeficience Nálezy protilátek v mozkomíšním moku lze hodnotit pouze na základě výpočtu intrathekální syntézy.
Přímá diagnostika EBV Průkaz zvýšené hladiny EBV DNA v periferní krvi (kvantitativní PCR) Průkaz DNA v likvoru Průkaz DNA v BAL Pozor na interpretaci - možnost kontaminace slinami! Průkaz DNA v biopsii z lymfoproliferativní léze (hybridizace in situ) chronická aktivní infekce PTLD Prognoza maligních lymfomů
Hladiny virové DNA u lymfoproliferativních onemocnění Kimura et al.,j.clin.microbiol.37,1999
Volba vzorku pro kvantifikaci EBV v krvi metodou PCR PBL: EBV je v krvi lokalizován hlavně (u některých onemocnění výhradně v buněčné frakci) Jedná se o virus jak v latentní, tak aktivní formě Plasma (sérum) U zdravých seropozitivních většinou obsahuje nedetekovatelné množství viru EBV DNA pochází z rozpadlých EBV+ buněk - množství závisí na typu onemocnění, ale i na způsobu odběru a zpracování krve Optimálním vzorkem je nefrakcionovaná krev
Hladiny DNA u reaktivace EBV U imunokompetentních pacientů se serologickými známkami reaktivace (i dlouhodobými) většinou není nalézáno zvýšené množství EBV v periferní krvi. U imunodeficientních pacientů zvýšené množství EBV v krvi většinou nekoreluje se serologickými známkami aktivní infekce. Vyjímkou jsou HIV+ pacienti.
Využití kvantifikace EBV v krvi pro predikci PTLD Cíl: Preemtivní terapie PTLD u vysoce rizikových skupin pacientů, sledování účinnosti léčby. Metoda stanovení rizikové hladiny Vliv dalších rizikových faktorů Dlouhodobí asymptomatičtí nosiči vysokých hladin EBV v krvi Metoda sledování dynamiky EBV v krvi Diagnosticky více informativní Některé případy PTLD spojeny s velmi rychlým vzestupem hladiny EBV
Příklad Sledování dynamiky EBV v krvi u PTLD Brengel-Pesce et al., J.Med.Virol.66,2002
Imunizace proti EBV Cíle: Prevence výskytu EBV - asociováných nádorů (Burlittův lymfom, NPC) Prevence a imunoterapie u posttransplantačních lymfoproliferativních onemocnění (PTLD) Imunoterapie EBV+ nádorů: NPC, HD Prevence infekční mononukleosy, autoimunitních chorob -???
Přístupy Preventivní subjednotková vakcína: rekombinantní g350: Zkoušky na zvířatech: prevence vzniku lymfomů u opic I-II. fáze klinických zkoušek: bezpečnost, tolerabilita, imunogenicita (neutralizační protilátky) protektivní účinek -???
Děkuji za pozornost