Stručný úvod ke cvičnému programu purifikace proteinů: zopakovaní základních principů a postupů Mirka Šafaříková Tel. 38777 5627 mirkasaf@usbe.cas.cz Na Sádkách 7, 1. patro, č. dveří 140
Acidobazické rovnováhy v roztocích aminokyselin a bílkovin R CH COOH + H3 N R C COO - NH 2 Aminokyseliny - amfionty H 3 O + H OH - R CH COO - NH 3 + + H3 N R C COOH Komerční - většinou hydrochloridy (NH 3+ Cl - ) H H 2 N R C COO - H Amfolyty - sloučeniny schopné vystupovat jako kyseliny nebo jako zásady
Proteiny amfolyty ph 4-8 aminokyselin jako amfionty - na povrchu molekuly několik desítek postranních řetězců AK schopných disociace
Isoelektrický bod (pi) Isoelektrický bod - Hodnota ph, kdy výsledný náboj molekuly je roven nule R CH COO - pi = 1 2 (pk 1 +pk 2 ) NH 3 + amfolyty přijímají H + pi amfolyty odštěpují H + NH 3+ RCOOH NH 2 RCOO - pi proteinů: neutrální cca 5-6 kyselé cca 2-3 bazické cca 9-11
Purifikace proteinů Cíl: získat co nejlepší výsledek (čistota, aktivita, množství enzymu) Dostupnost a typ vstupního materiálu, stabilita a obsah izolovaného enzymu, nároky na čistotu preparátu počet purifikačních kroků omezení ztrát, časová a finanční náročnost Žádná metoda není dokonalá je třeba si ujasnit k jakému účelu má sloužit Typ purifikační metody a její parametry je třeba volit uváženě, abychom získali dobré výsledky. - záleží na typu analyzovaného vzorku, parametrech metody, velikosti souboru zpracovávaných vzorků... (klinická lab, potravinářská a environmentální analytika, výzkum)
Metody obecně používané v biochemických laboratořích Metody základní rozpuštění hrubé oddělení převedení biomolekul do kapalné fáze speciální izolace stanovení homogenizace, desintegrace, filtrace, centrifugace chromatografické, elektroforetické, spektrofotometrické, enzymové,...
Volba separační metody Dělení látek podle rozdílných vlastností: molekulová hmotnost elektrické vlastnosti povrchové vlastnosti biochemická aktivita Metoda pokusu a omylu obvykle nedává optimální výsledky Metody používané v programu: purifikace - srážení, dialýza, chromatografie ionexová, hydrofobních interakcí, gelová, (chromatofokusace) kontrola stupně purifikace celkové množství proteinu, enzymová aktivita, elektroforesa, výtěžnost, nabohacení
Srážení (NH 4 ) 2 SO 4 - vysolování protein (NH 4 ) 2 SO 4 různé bílkoviny se sráží při různých koncentracích zvýšení rozpustnosti vsolování snižování hydrofobních int. (NH 4 ) 2 SO 4 snížení rozpustnosti vysolování ztráta hydratačního obalu Používá se v počátcích purifikace, kdy je koncentrace proteinu ještě vysoká (> 1mg/ml)
Množství pevného síranu amonného (g), které je potřeba přidat k 1 litru roztoku, aby se dosáhlo žádané změny v procentech nasycení roztoku síranem amonným.
Dialýza Difuse nízkomolekulárních látek přes membránu vyšší koncentrace nižší koncentrace Použití: odstraňování (výměna) nízkomolekulárních látek (odsolování, výměna pufru) koncentrační gradient Membrány, dutá vlákna Membrány: deriváty celulosy, MWCO 100 Da 1 000 kda voda, pufr s nízkou iontovou silou elektrodialýza - urychlení pohybu nabitých iontů v el. poli odsolování MWCO 10 (25) kda
Ionexová chromatografie Chromatografie na měničích iontů Ion Exchange Chromapography - IEC Princip: separace podle náboje Iontoměniče (ionexy - ion exchangers ) - pevné látky, které jsou schopny vyměňovat ionty s kapalnými fázemi. Částice iontoměničů obsahují kovalentně vázané ionizovatelné skupiny. porézní materiály elektrostatické interakce eluce změnou ph, iont. síly
Ionex = nerozpustná matrice s kovalentně navázanými skupinami nesoucími náboj katex -výměna kationtů anex - výměna aniontů Na +, H + Cl -, OH - Separace látek podle afinity k ionexu - velikost nábojů na povrchu molekuly, tvar molekuly Pevnost vazby - ph, iontová síla roztoku
Vliv ph na velikost náboje: P - P + ph: většina bílkovin má pi v rozmezí ph 5-6 a je stabilní obvykle v rozmezí ph 6-9 katex: ph 3 8 (bazické proteiny) většinou vazba na anex anex: ph 5 10 Vliv iontové síly: vyšší iontová síla slabší vazba na ionex
Silné ionexy jsou úplně disociovány v širokém rozmezí ph (sulfoskupiny, kvarterní aminoskupiny) Slabé ionexy jejich ionizovatelnost je silně závislá na ph. Slabé ionexy jsou obvykle ionizované při ph 6-9, jinak ztrácejí náboj Funkční skupiny CM karboxymethyl- slabý katex SP sulfopropyl- silný katex S sulfomethyl- silný katex SHP sulfohydroxypropyl- silný katex DEAE diethylaminoethyl- slabý anex TEAE triethylaminoethyl- silný anex QAE kvarterní aminoethyl- silný anex Q kvarterní amin silný anex TMAHP trimethylaminohydroxypropyl- silný anex
Průtoková rychlost: závisí na: rozměrech kolony, velikosti a tvaru ionexových částic rychlost 3-10 ml.cm -2.min -1 (cca 5 cm/h) Eluce: vymytí změnou složení eluentu gradientová eluce gradient iontové síly - vzestupný směr gradient ph směrem k pi příkrost gradientu (příkrý - menší naředění, nižší rozlišení) celkový objem eluentu 10ti 20ti násobek objemu náplně kolony
Chromatografie s hydrofobní interakcí Hydrofobní interakce Makromolekuly - hydrofobní skupiny (na povrchu nebo zanořené vkapsách) Zcela hydrofobní materiály (polystyren) vazba molekuly ireversibilní (denaturace) hydrofobní sorbenty hydrofobní zóny ligandy: oktyl-, fenyl-, propyl-
Síla vazby roste s: rostoucí iont silou (4M NaCl, 1M (NH 4 ) 2 SO 4, teplotou, nejsilnější interakce: ph pi Síla vazby klesá v přítomnosti chaotropních iontů, alifatických alkoholů, hydrofobních molekul Desorpce: snížení iont. síly, záměna iontů s nižším vysolovacím efektem, snížení polarity, přidavek tenzidu Metoda silně závislá na experimentálních podmínkách.
Gelová (permeační) chromatografie Gelová filtrace na principu molekulárního síta - molekuly se separují podle velikosti a tvaru v pórech gelu relat. nezávislá na složení mobilní fáze Frakcionace peptidů, oligosacharidů, nukleotidů, bílkovin, enzymů, virů, nukleových kys. malé molekuly difuse do struktury gelu pomalejší postup kolonou velké molekuly volně protékají nesferické molekuly - chovají se jako by byly větší
Stupeň rozlišení: R s = vzdálenost mezi separovanými zónami šířka zón R s >1.2 Rozlišovací schopnost stoupá úměrně s druhou odmocninou délky sloupce Pro lepší rozlišení - delší kolony s menším průměrem (ale roste doba separace). opakovaně aplikovat vzorek na kolonu nebo použít sérii kolon Aplikace vzorku: objem vzorku 1-5% objemu kolony, pro odsolení až 30% neúčinné dělení zředěných vzorků!!!
Frakcionační rozsah gelu: Rozsah molekulových hmotností nebo velikostí molekul, vněmž změna velikosti způsobí změnu elučního objemu. Sephadex G-25 1 5 kda Sephadex G-100 4 150 kda mez vyloučení - velikost největšího proteinu, který může penetrovat do pórů gelu molekuly penetrují do gelu bez zábran V e V t molekuly nepronikají do gelu V e V 0
Často se překrývají, potom lépe použít gel s nižší vylučovací mezí, protože požadované látky budou z kolony eluovány dříve.
Použití: orientační stanovení M r, odsolování (Sephadex G-25, oddělení molekul do 5 kda) purifikace, zakoncentrování (přídavkem suchého Sephadexu G-25) Výhody: šetrná metoda, není důležité složení eluentu, separace je nezávislá na koncentraci látky (lze separovat i vysoce konc. vzorky ale nesmí být moc viskozní), teplotě levná, jednoduchá Omezení: nutné aplikovat malý objem vzorku (ca 1% Vt) omezení vlivu difuse
techniky s vysokou kapacitou techniky s nízkou kapacitou
Produkt jedné metody by měl být využit v další metodě.
precipitace hydrofobní interakce dialýza, gelová f. G-25 ionexová chromatogr. (afinitní chromatogr.) zakoncentrování vzorku (elektroforesa) gelová filtrace obsah solí, ph není důležité objem a koncentrace vzorku odstranění částečně zdenaturovaných nebo agregovaných artefaktů
Obsah protokolu: 1. Číslo a charakteristika enzymu 2. U každého purifikačního kroku uvést zdůvodnění použité metody a nastavení jejích parametrů 3. U každého purifikačního kroku uvést výsledek případné ztráty, výtěžnost (množství celkového proteinu a aktivity), nabohacení a efektivitu purifikace 4. Na závěr celý postup prezentovat formou tabulky Izolace enzymu Protein (mg) Enzym (U) Výtěžek enzymu (%) Nabohacení Časová náročnost (čl./hod) Na začátku izolace 511 14700 100 1 0 Amonium sulfát 181 14831 100 2,8 0,01 Hydrofobní interakce 172 14075 95,7 2,8 0,06 Ionex 26,4 13879 94,4 18,3 0,12 Gelová filtrace 20,2 13544 92,1 23,3 0,18 5. Závěr: Formulovat výsledek celého purifikačního procesu