ELISA-VIDITEST anti-hhv-6 IgG (CSF) OD-344 / 5ST Návod k použití VÝROBCE: VIDIA spol.s r.o., Nad Safinou II 365, 252 42 Jesenice, Czech Republic, Tel.: +420 261 090 565, Fax: +420 261 090 566, www.vidia.cz 1. NÁZEV ELISA-VIDITEST anti-hhv-6 IgG (CSF) ELISA souprava pro semikvantitativní a kvantitativní detekci IgG protilátek proti HHV-6 v lidském séru a pro stanovení intrathekální syntézy. 2. POUŽITÍ Souprava je určena pro laboratorní diagnostiku chorob vyvolaných nebo souvisejících s lidským herpetickým virem typu 6, např. 6. dětské nemoci (exanthema subitum), akutních virových infekcí a febrilních křečí u kojenců, infekčních mononukleóz bez heterofilních protilátek a oportunních infekcí u pacientů s oslabenou imunitou, včetně infekcí provázených neurologickými komplikacemi. Stanovení přítomnosti IgG anti-hhv-6 protilátek umožňuje hodnocení imunitního statusu pacienta. Test nerozlišuje protilátky proti HHV-6 typu A a B. Signifikantní nárůst v koncentraci specifických protilátek u párových vzorků (odebraných v akutní a rekonvalescentní fázi infekce) indikuje aktivní infekci. Test by měl být doplněn stanovením anti- HHV-6 IgM protilátek v lidském séru (ELISA-VIDITEST anti-hhv-6 IgM). 3. PRINCIP TESTU ELISA-VIDITEST anti-hhv-6 IgG (CSF) je imunonalytický test na pevné fázi. Na povrch jamek stripů je navázán nativní HHV-6 antigen. Jsou-li v testovaných vzorcích přítomny anti-hhv-6 protilátky, navážou se na imobilizovaný antigen a vytvářejí kopmlexy protilátek s antigenem, které jsou pak rozpoznány zvířecími protilátkami proti lidskému IgG značenými peroxidázou. Množství navázaných značených protilátek se stanoví barevnou enzymatickou reakcí. Negativní séra nereagují, mírná změna v zabarvení jamek je pozadím reakce. Vyšetření intrathekálních protilátek udává informaci o protilátkové odpovědi proti HHV-6 v centrálním nervovém systému. Pro toto stanovení je nezbytné kvantitativně stanovit koncentraci HHV-6-specifických IgG protilátek v párových vzorcích séra a mozkomíšního moku, odebraných od pacienta ve stejnou dobu. Přesnou kvantifikaci protilátek lze provést pouze podle lineární části kalibrační křivky. Proto se doporučuje vyšetřit sérum ve dvou ředěních (viz kap. 6 Příprava reagencií). Pro stanovení je nutno znát celkovou koncentraci IgG a albuminu v obou vzorcích. Výpočet intrathekální syntézy specifických protilátek se provádí pomocí Reiberovy rovnice (viz kap. 9 Hodnocení intrathekální syntézy protilátek). 4. OBSAH SOUPRAVY ELISA odlamovací stripy potažené nativním antigenem STRIPS Ag 1x12 stripů 1,3 ml Standardu A=negativní kontrolní sérum STA/CTRL-, r.t.u. 1),2) 1 lahvička 1,3 ml Standardu B ST B, r.t.u. 1 lahvička 1,3 ml Standardu C ST C, r.t.u. 1 lahvička 1,3 ml Standardu D=Standard 1 (kalibrátor) ST D/ST 1, r.t.u. 1 lahvička 1,3 ml Standardu E=Standard 2 (pozitivní kontrolní sérum) ST E/ST 2, r.t.u. 1 lahvička 13 ml protilátek proti lidskému IgG značených peroxidázou (Px-konjugát) r.t.u. CONJ 1 lahvička 55 ml promývacího roztoku 10x koncentrovaný WASH 10x 1 lahvička 1
60 ml ředícího roztoku anti-hhv6 r.t.u. DIL 1 lahvička 13 ml chromogensubstrátového roztoku (TMB substrát) r.t.u. TMB-O 1 lahvička 13 ml stop roztok r.t.u. STOP 1 lahvička Sáček se zipem Návod k použití soupravy Certifikát kontroly kvality 1) r.t.u., ready to use (v pracovní koncentraci) 2) koncentrace standardů jsou uvedeny v přiloženém certifikátu kvality pro danou šarži soupravy (AU/ml, arteficiální jednotky/ml) Ředící roztok DIL r.t.u. je určen pouze pro soupravu ELISA-VIDITEST anti-hhv-6 IgG, IgM. Chromogensubstrátový roztok TMB-O r.t.u. je zaměnitelný pouze mezi soupravami ELISA- VIDITEST, které obsahují TMB-O, a NENÍ VZÁJEMNĚ ZAMĚNITELNÝ s ostatními roztoky TMB použitými v jiných soupravách ELISA-VIDITEST TMB, TMB-BF. 5. POTŘEBNÝ MATERIÁL NEDODÁVANÝ SE SOUPRAVOU Destilovaná nebo deionizovaná voda pro ředění koncentrátu promývacího roztoku. Vhodné zařízení pro pipetování, dávkování kapaliny a promývání. Spektrofotometr/kolorimetr pro měření absorbance mikrotitrační destičky při 450 nm. (Referenční filtr 620-690 nm není podmínkou). 6. PŘÍPRAVA REAGENCIÍ A VZORKŮ a. Vytemperujte všechny složky soupravy na laboratorní teplotu (25-28 C). b. Těsně před vyšetřením důkladně zamíchejte vyšetřované vzorky a standardy. Testovaná séra řeďte ředicím roztokem 101x (5 L séra + 500L ředicího roztoku). Pro stanovení intrathekálních protilátek doporučujeme vyšetřovat séra ve dvou ředěních: 101x a 404x Ředění séra 1:404 proveďte čtyřnásobným naředěním séra, ředěného 101x, (např. 150 μl ředícího roztoku + 50 μl séra, naředěného 1: 101). Likvory řeďte ředícím roztokem 2x (např. 100 μl mozkomíšního moku + 100 μl ředícího roztoku). Kontrolní séra (standardy) neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u., ready to use). c. Připravte pracovní koncentraci promývacího roztoku jeho naředěním 10x ve vhodném objemu deionizované/destilované vody (např. 50 ml koncentrovaného promývacího roztoku + 450 ml destilované vody). Pokud jsou v koncentrovaném promývacím roztoku krystaly soli, zahřejte ho ve vodní lázni na +32 až +37 C a před naředěním dobře promíchejte. Nespotřebovaný promývací roztok v pracovní koncentraci lze skladovat měsíc při laboratorní teplotě. d. Standardy, Px-konjugát, chromogensubstrátový roztok TMB a stop roztok neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u.). 7. PRACOVNÍ POSTUP a. Před otevřením nechte vždy sáček se stripy vytemperovat na laboratorní teplotu (25-28 C), aby nedošlo k orosení destičky. Odeberte si požadovaný počet stripů a nepoužité stripy dobře uzavřete do sáčku s desikantem. b. Zvolte způsob, který chcete použít pro hodnocení testu (viz kap. 8) a podle něj aplikujte vzorky na destičku. Naplňte jamky po 100 L jednotlivých standardů a ředěných testovaných vzorků takto: První jamku naplňte samotným ředicím roztokem DIL pro stanovení pozadí reakce. Pro kvalitativní a semikvantitativní hodnocení naplňte dvě jamky Standardem D ST D/ST 1, který slouží jako kalibrátor. Další jamku pozitivním kontrolním sérem ST E/ST 2 a další negativním kontrolním sérem ST A/CTRL- (viz Tab. 1). Pro kvantitativní hodnocení naplňte vždy po jedné jamce Standardy A E (STA/CTRL-, ST B, ST C, ST D/ST 1, ST E/ST 2). Zbývající jamky naplňte ředěnými testovanými vzorky (S1 ), (viz Tab. 2) Každý vzorek stačí aplikovat na jednu jamku (S1, S2, S3, ), případně mozkomíšními moky (M1, M2, M3, ). Pokud chcete 2
vyloučit případnou laboratorní chybu, vyšetřované vzorky aplikujte po dvou jamkách (viz Tab. 3), v případě kvalitativního a semikvantitativního hodnocení aplikujte ST D/ST 1 na tři jamky. Pro ověření správnosti kalibrace, návaznosti a variability testu doporučujeme zahrnout vzorek pozitivního referenčního séra (vaši vnitřní kontrolu) do každého běhu. Inkubujte 60 minut (+/- 5 min.) při laboratorní teplotě. c. Odsajte obsah jamek do pojistné sběrné láhve obsahující vhodný dezinfekční prostředek (viz Bezpečnostní předpisy). Jamky poté 4x promyjte 250 L promývacího roztoku. Vyvarujte se přetékání roztoku ven z jamek. Obsah jamek odsajte a destičku vyklepněte na přířez buničité vaty. d. Důkladně promíchejte lahvičku s konjugátem anti-igg Px r.t.u. CONJ a napipetujte do jamek po 100 L konjugátu anti-igg Px r.t.u.. Inkubujte 60 minut ( 5 min.) při laboratorní teplotě. e. Tekutinu z jamek odsajte a promyjte je 4x 250 L promývacího roztoku (viz bod c.). Odsajte a vyklepněte. f. Napipetujte do jamek po 100 L chromogensubstrátového roztoku TMB-O. Inkubujte 20 minut ( 30 sec.) v temnu při laboratorní teplotě. Dobu inkubace začněte měřit po napipetování 1. stripu destičky. Dodržujte toto pravidlo, vyvarujete se tak nedodržení časového intervalu. Pipetujte rychle v pravidelném rytmu, případně použijte vhodný dispenzor. Překryjte stripy neprůhledným víčkem, nebo je po dobu reakce uložte na temné místo. g. Zastavte reakci přidáním 100 L stop roztoku STOP. Pipetujte ve stejném rytmu jako při rozplňování chromogensubstrátového roztoku TMB, aby enzymatická reakce probíhala ve všech jamkách po stejnou dobu. Zkontrolujte, zda nejsou v jamkách bubliny, pokud ano, jemným poklepem na rámeček destičky je odstraňte. h. Intenzitu barevné reakce změřte na spektrofotometru/kolorimetru při 450 nm nejpozději do 20 minut po zastavení reakce. Doporučujeme použít referenční filtr 620-690 nm. Tab. 1: Schéma aplikace vzorků pro kvalitativní a semikvantitativní hodnocení 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 a DIL b ST D/ST 1 c ST D/ST 1 d ST E/ST 2 e ST A/CTRLf S1 g S2 h S Tab. 2: Schéma aplikace vzorků pro kvantitativní hodnocení, příp. pro stanovení intrathekální syntézy po jedné jamce 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 a DIL S3 b STA/CTRL- S c ST B M1 d ST C M2 e STD/ST1 M3 f STE/ST2 M g S1 h S2 3
Tab. 3: Schéma aplikace vzorků pro kvantitativní hodnocení, příp. pro stanovení intrathekální syntézy po dvou jamkách 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 a DIL S2 M b STA/CTRL- S2 M c ST B S d ST C S e STD/ST1 M1 f STE/ST2 M1 g S1 M2 h S1 M2 8. HODNOCENÍ TESTU Začněte zpracování výsledků odečtením absorbance jamky s ředícím roztokem DIL (absorbance pozadí) od absorbancí ve všech ostatních jamek. 8.1 Kvalitativní vyhodnocení 1. Vypočítejte průměrnou absorbanci Standardu D ST D/ST 1. Pokud jste Standard D aplikovali na tři jamky a hodnota jedné absorbance se liší od průměru o více než 20%, pak hodnotu vylučte a vypočítejte absorbanci jako průměr zbylých dvou jamek. 2. Stanovte cut-off hodnotu tak, že průměrnou hodnotu Standardu D vynásobte korekčním faktorem. Korekční faktor Standardu D je uveden na certifikátu kvality pro tuto soupravu. 3. Vzorky s hodnotou absorbance menší než 90% cut-off hodnoty označte jako negativní a vzorky s absorbancí vyšší než 110% cut-off hodnoty jako pozitivní. 8.2. Semikvantitativní vyhodnocení Stanovení indexu pozitivity vzorku: 1. Stanovte hodnotu cut-off (viz předchozí odstavec 8.1) 2. Vypočtěte index pozitivity u každého vzorku podle následujícího vzorce absorbance vzorku Index pozitivity vzorku = ------------------------------ cut-off hodnota 3. Vyhodnoťte reaktivitu séra dle údajů v tabulce 1 (Vyhodnocení výsledků) Tabulka 1 Vyhodnocení výsledků Hodnota indexu Vyhodnocení < 0,90 Negativní 0,90-1,10 +/- 1,11-2,00 + 2,01-4,00 ++ > 4,00 +++ Pozn.: Hodnocení +/- znamená, že vzorek leží v rozmezí šedé zóny. V případě tohoto výsledku test opakujte. Leží-li vzorek po opakovaném testování opět v rozmezí šedé zóny, opakujte testování alternativní metodou, nebo použijte vzorek odebrané od téhož jedince o 1-2 týdny později. 4
Příklad výpočtu: Absorbance Standardu D = 1,407; 1,377 Průměr Standardu D = 1,392 Korekční faktor Standardu D = 0,21 Cut-off hodnota = 1,392*0,21 = 0,292 Absorbance vzorku = 1,200 Index pozitivity vzorku = 1,200 / 0,292 = 4,11 8.2. Kvantitativní určení protilátek ve vzorcích séra Vypočtěte koncentraci protilátky ve vzorku v artificiálních jednotkách (AU / ml) následovně: 1. Sestrojte kalibrační křivku tak, že na osu x vynesete jednotky Standardů (uvedeny v přiloženém certifikátu kvality pro danou šarži soupravy). Na osu y vyneste jejich absorbance. Doporučujeme použít logaritmickou osu x. 2. Určete místo, kde absorbance testovaných vzorků protínají kalibrační křivku, a odečtěte odpovídající hodnotu na ose x. Je možné použít různé softwary pro určení standardní křivek a pro výpočet neznámých hodnot, např. Winliana, KimQ. Pro lepší určení je nejvhodnější polynomická funkce (čtyř-parametrová). 3. Vyhodnocení výsledků: Koncentrace (AU/mL) Vyhodnocení < 10,50 Negativní 10,50-12,50 +/- > 12,50 Pozitivní Upozornění 1: Vzorek v intervalu 10,50 12,50 AU/ml leží v rozmezí šedé zóny. V takovém případě se doporučuje opakovat test. Leží-li vzorek po opakovaném testování opět v rozmezí šedé zóny, opakujte testování alternativní metodou, nebo použijte vzorek odebrané od téhož jedince o 1-2 týdny později. Upozornění 2: Kvantifikace je přesná pouze v lineární části kalibrační křivky. Je-li OD vzorku mimo lineární interval, je nutné opakovat test s více naředěnými vzorky séra pro získání přesné kvantifikace. 9. PRŮKAZ INTRATEKÁLNÍ SYNTÉZY SPECIFICKÝCH PROTILÁTEK Stanovení koncentrace IgG proti HHV-6 v mozkomíšním moku lze interpretovat pouze na základě výpočtu intrathekální syntézy protilátek. 9.1 VÝPOČET PROTILÁTKOVÉHO INDEXU (AI) (dle Reibera) 9.1.1. Výpočet poměru mezi koncentracemi celkového IgG (Qtotal IgG) a celkového albuminu (Qtotal alb) v mozkomíšním moku a séru. Spočítejte Qtotal IgG a Qtotal alb podle vzorce: Qtotal IgG = totaligg v MM totaligg v séru Qtotal alb = totalalb v MM totalalb v séru 9.1.2. Výpočet limitního koeficientu QlimIgG tj. množství IgG v mozkomíšním moku, které může za daného stavu bariéry pocházet ze systémové cirkulace (Reiberova hyperbolická funkce). Spočítejte QlimIgG podle vzorce: 2 6 QlimIgG = 0,93 x (Q ) 6 x 10-1,7 x 10-3 totalalb 5
9.1.3. Výpočet koeficientu pathogen-specifických protilátek IgG Qpath.-spec.IgG, který udává poměr mezi koncentrací specifických IgG v mozkomíšním moku a séru. Spočítejte Qpath.-spec.IgG podle vzorce: Qpath.-spec.IgG = c spec.igg MMx ředění c spec.igg sérumx ředění kde c spec.igg MM / sérum je stanovená koncentrace specifických protilátek v AU/ml v mozkomíšním moku/ séru násobená ředěním vzorku (viz kap. 6) Příklad: c spec.igg MM = 38 AU/ml, vzorek ředěn 2x v ředicím roztoku c spec.igg sérum = 10 AU/ml, vzorek ředěn 101x v ředicím roztoku Qpath.-spec.IgG = 38 x 2 10 x 101 = 75,2 x 10-3 9.1.4. Výpočet protilátkového indexu AI a) Pokud platí: Qtotal IgG < QlimIgG, spočítejte AI podle vzorce: Qpath. -spec.igg AI = Q totaligg b) Pokud platí: Qtotal IgG > QlimIgG, spočítejte AI podle vzorce: Qpath. -spec.igg AI = Q limigg Pro automatický výpočet k soupravám dodáváme software VIDITAB. 9.2 HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ AI < 1,5 AI 1,5-2,0 AI > 2,0 intrathekální syntéza specifických protilátek neprokázána suspektní intrathekální syntéza specifických protilátek prokázána intrathekální syntéza specifických protilátek Pozn. Pokud absorbance testovaného vzorku leží mimo lineární oblast kalibrační křivky, je nutno vzorek opakovaně testovat v upraveném ředění (viz kap.6). V případě negativního výsledku u párového vzorku (negativní sérum i negativní mozkomíšní mok) nepočítejte antibody index AI (nelze předpokládat intrathekální syntézu specifických protilátek). 10. PLATNOST, SPECIFITA A CITLIVOST TESTU 10.1. Platnost testu Hodnota absorbance samotného ředícího roztoku DIL (DIL = pozadí reakce) by měla být < 0,100. Hodnoty OD standardů/ kontrolních sér a poměr hodnot OD standardů ST E/ST 2 / ST D/ST 1 by měly být v rozmezích uvedených v Certifikátu kontroly kvality dané šarže. 10.3 Přesnost testu Opakovatelnost (intraassay) a reprodukovatelnost (interassay) byly stanoveny použitím vzorků s různými hodnotami absorbance. V anti-hhv-6 IgG pozitivních vzorcích opakovatelnost nepřesáhla hodnotu koeficientu variability nad 5% průměru hodnot absorbancí a reprodukovatelnost nad 15%. 6
10.3.1 Opakovatelnost (intraassay) (n= počet paralelních jamek v tomtéž testu) n A CV 14 1.536 0.036 2.3 % 16 1.891 0.042 2.2 % 10.3.2 Reprodukovatelnost (interassay) (n= počet opakovaných testování) n A Min.- max. CV 5 1.601 0.145 1.425-1.747 9.1 % 5 1.162 0.075 1.086-1.238 6.5 % 10.3.3 Recovery test Naměřené hodnoty testu pro každou šarži jsou mezi 80-120% očekávaných hodnot. 10.4 Diagnostická citlivost a specificita testu Diagnostická citlivost testu je 99% a specificita je 95%. Vyhodnocení bylo provedeno porovnáním ELISA-VIDITEST anti-hhv-6 soupravy s jinými komerčními ELISA testy. HHV-6 status Negativní Hraniční Pozitivní Součet Seronegativní 40 1 2 43 Seropozitivní 3 0 245 248 10.5 Interference Hemolytické a lipemické vzorky nemají žádný vliv na výsledky testů až do koncentrace 50 mg/ml hemoglobinu, 5 mg/ml bilirubinu a 50 mg/ml triglyceridů. Nicméně vyšetření takových vzorků se nedoporučuje. 10.6 Mez stanovitelnosti Mez stanovitelnosti je definována jako nejnižší měřitelná koncentrace, která může být s 95% jistotou odlišena od nuly. Tato hodnota činí 2,95 AU/mL. 11. BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY a. Všechny složky soupravy jsou určeny pouze pro laboratorní účely. b. Lidská séra použitá v soupravě byla testována na nepřítomnost HBsAg, protilátek anti-hiv-1,2 a anti-hcv. Přesto s nimi nakládejte jako s infekčním materiálem a měla by být zneškodněna se v souladu s příslušnými předpisy. c. Autoklávujte všechny recyklovatelné materiály, které byly v kontaktu s lidskými vzorky, po dobu 0,5 hodiny při teplotě 121 C, hořlavé materiály na jedno použití spalte, dekontaminujte kapalné odpady a nehořlavé materiály 3% chloraminem. Kapalné odpady obsahující kyselinu (stop roztok) by měly být neutralizovány 4% roztokem hydrogenuhličitanu sodného. d. Se stop roztokem pracujte opatrně, aby nedošlo k potřísnění kůže nebo sliznice. Stane-li se tak, omyjte postižené místo větším množstvím tekoucí vody a vyhledejte lékařskou pomoc. e. Při práci nejezte, nepijte a nekuřte. Nepipetujte ústy, ale vhodnými pipetovacími zařízeními. Používejte ochranné rukavice a po práci si důkladně umyjte ruce. Dbejte, aby nedošlo k rozlití vzorků a k tvorbě aerosolu. 7
12. UPOZORNĚNÍ: a. Výrobce zaručuje použitelnost soupravy jako celku. b. Promývací roztok, chromogensubstrátový roztok TMB r.t.u., stop roztok r.t.u. a ředicí roztok r.t.u. jsou vzájemně zaměnitelné mezi jednotlivými soupravami ELISA-VIDITEST, pokud není v návodu uvedeno jinak. c. Pracujte asepticky, aby nedošlo k mikrobiální kontaminaci sér a reagencií. d. Při odebírání, ředění a skladování reagencií postupujte tak, aby nedošlo k jejich vzájemné kontaminaci či kontaminaci látkami inhibujícími enzymatickou aktivitu. e. Kontrolní séra (standardy), ředicí roztok, chromogensubstrátový roztok TMB a konjugát anti-igg Px jsou konzervovány ProClinem 300. f. Chromogensubstrátový roztok nesmí přijít do styku s oxidačními látkami a kovovými povrchy. g. Dodržujte přesně pokyny uvedené v návodu. Nereprodukovatelné výsledky mohou vzniknout zejména: * nedostatečným promícháním reagencií a vzorků před použitím * nepřesným pipetováním a nedodržováním času inkubací uvedených v bodě 7. * špatnou technikou promývání a potřísněním okrajů jamek vzorky nebo konjugátem * použitím stejné špičky při pipetování různých roztoků nebo záměnou uzávěrů 13. SKLADOVÁNÍ A EXPIRACE: a. Soupravu a její složky skladujte v suchu a temnu při teplotě +2 až +10 C. Za těchto podmínek je exspirační doba celé soupravy uvedena na centrálním štítku na obalu soupravy, exspirace jednotlivých složek je uvedena na jejich obalu. b. Soupravy se přepravují v termotaškách s ledem, doba přepravy do 72 hodin nemá na exspiraci vliv. Jestliže po obdržení soupravy zjistíte vážné poškození obalu jakékoliv složky soupravy, ihned informujte výrobce. c. Nespotřebované stripy vložte zpět do obalu a zatavte, nebo dobře uzavřete do sáčku se zipem společně s desikantem. d. Nespotřebovaná testovaná séra uchovávejte v neředěném stavu rozplněná na alikvoty a zmrazená při teplotě -18 až -28 C. Časté zmrazování a rozmrazování se nedoporučuje. Pokud skladujete séra při teplotě +2 až +10 C, pak je spotřebujte do jednoho týdne. e. Roztoky testovaných sér v pracovní koncentraci nelze skladovat. Připravujte je vždy čerstvé. 14. DOPORUČENÁ LITERATURA: Salahuddin S.Z., Ablashi D.V., Markham P.D., Joseph S.F., Sturzenegger S., Kaplan M. Halligan G., Biberfeld P., Wong-Stall F., Kramarsky B., Gallo R.C.; Isolation of a new virus, HBLV, in patiens with lymphoproliferative disorders. Science 234: 596-601, 1986 De Bolle L., Naesens L., De Clercq E., Update on Human Herpesvirus 6 Biology, Clinical Features and Therapy, Clinical Microbiology Reviews, 217-245, 2005 Parker C.A.,Weber J.M.: An enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of IgG and IgM antibodies to human herpesvirus 6. J Virol Methods 41, 265-276,1993 8
TESTOVACÍ SCHÉMA Krok 1 Krok 2 Krok 3 Krok 4 Připravte reagencie a vzorky v pracovním ředění Aplikujte po 100 L/jamku standardy a vzorky Inkubujte 60 minut při laboratorní teplotě Promyjte 4 krát (250 L/jamku), odsajte Aplikujte po 100 L/jamku Px-konjugát r.t.u. Inkubujte 60 minut při laboratorní teplotě Promyjte 4 krát (250 L/jamku), odsajte Aplikujte po 100 L/jamku chromogensubstrátový roztok TMB-O Inkubujte 20 minut při laboratorní teplotě Krok 5 Krok 6 Aplikujte po 100 L/jamku stop roztok Změřte absorbanci při 450 nm / 620-690 nm do 20 minut Datum poslední revize tohoto návodu: 03/2015 Vývoj této soupravy byl podpořen grantem Ministerstva průmyslu a obchodu České republiky. 9
10