Morfologické typy baktérií, kvasinek M (mukoidní morfologický typ), mající vlhké slizovité velmi lesklé kolonie, tvořené opouzdřenými buňkami S (z angl.smooth = hladkýmorfo.typ), tvořící hladké kolonie s rovným okrajem a mírným leskem nebo bez lesku, buňky netvoří pouzdra R (z angl.rough = drsný morfo. zyp), tvořící drsné až silně zvrásněné, suché, poměrně nízké kolonie, které se většinou široce rozrůstají a mají nerovné okraje; obvykle se vyskytuje několik R typů, které se liší výškou kolonie a hrubostí jejího zvrásnění.
Obrovské kolonie Sledujeme je u kvasinek a plísní Kvasinky se zaočkují v jednom místě hodnotíme v jednodenních intervalech po dobu 14 dní Plísně se očkují do středu nebo do tří bodů (vrcholy rovnostranného trojúhelníku, 3cm od okraje misky) kličkou, která se jen dotkne půdy v Petriho misce, která je dnem vzhůru Hodnotíme za 2-5 dnů, případně i déle(14)
Růst podél vpichu Typ růstu podél vpichu do svislé vrstvy agarové půdy určuje nejen morfologické znaky, ale i nároky mikroorganismu na kyslík. Aerobní mikroorganismy rostou v hořejší části vpichu, anaerobní ve spodní části a fakultativně anaerobní po celé délce vpichu. Růst podél vpichu se sleduje pouze u bakterií. Růst se vyhodnocuje v jednodenních intervalech
Mikroskopické morfologické a cytologické znaky mikroorganismů Nativní preparát- nebarvené buňky na podložním sklíčku Vitálně barvený-pro rozlišení živých a mrtvých buněk(kvasinky) Barvený po fixaci- všechny ostatní znaky buněk(kvasinky, bakterie, plísně)
Fixace preparátu Účelem fixace je usmrcení buněk, neboť mrtvé buňky přijímají snáze barvivo, a dále přilnutí buněk k podložnímu sklíčku, aby nebyly barvícím roztokem nebo při oplachování odplaveny. Bakterie fixujeme nejčastěji plamenem, kvasinky a plísně většinou chemikáliemi, (např. ethanolem, acetonem), neboť plamenem se již značně mění jejich tvar. Fixace plamenem. Odmaštěné podložní sklíčko protáhneme plamenem, asepticky na ně přeneseme suspenzi bakterií, rozetřeme na plochu 2 x 2cm a necháme vyschnout na vzduchu. Pak sklíčko nátěrem vzhůru třikrát protáhneme nesvítivým plamenem kahanu a po vychladnutí barvíme.
Barvení mikroorganismů Podle účelu barvení rozlišujeme : 1) Jednoduché barvení, které slouží k dobrému rozlišení tvaru buněk. 2) Diferenciační barvení, jež slouží k rozlišení jednotlivých morfologických útvarů(např. jádra, spor, buněčné stěny) nebo chemických složek buněk (volutinová zrna, glykogen, škrob, tukové kapičky. 3) Diagnostické barvení, jež slouží jako pomůcka při identifikaci mikroorganismů. Nejpoužívanější je Gramovo barvení a acidorezistenční barvení
U baktérií po obarvení zjišťujeme 1. tvar a velikost buněk (koky nebo tyčinky, u tyčinek též jejich délku, charakter konců a pří-padné zakřivení), 2. uspořádání buněk (jednotlivé, v řetězcích, ve shlucích nebo balíčcích), 3. přítomnost a charakter vláken (větvená, nevětvená), 4. přítomnost spor, jejich tvar, velikost (rozšiřuje či nerozšiřuje buňku) a umístění(centrální, terminální, subterminální či excentrické), 5. přítomnost pouzder.
PRÁCE V MIKROBIOLOGICKÉ LABORATOŘI 1. Vstup do mikrobiologické laboratoře je dovolen pouze osobám, které tam pracují. Před vstupem do laboratoře je nutné se převléknout do čistého laboratorního pláště. Pracovní plášť je určen výhradně k práci v mikrobiologické laboratoři a není dovoleno ho používat mimo předem určené prostory. 2. V laboratoři není dovoleno jíst, pít a kouřit. 3. Je nutné dodržovat bezpečnost práce a hygienu, neboť se pracuje s podmíněně pathogenními a pathogenními mikroorganismy. Po ukončení práce se musí ruce důkladně umýt mýdlem, popř. vydezinfikovat 0,1% roztokem Ajatinu. 4. Pracovní stůl se musí před i po práci vydezinfikovat 0,1% roztokem Ajatinu nebo jiným účinným dezinfekčním prostředkem (70% ethanol). Během práce nesmí být na pracovním stole nesterilní předměty a je nutné udržovat maximální pořádek.
Práce v mikrobiologické laboratoři 5. Každý úraz a zranění je nutno ihned hlásit učiteli. I nejmenší oděrky musí být pečlivě vydezinfikovány a ošetřeny, neboť hrozí infekce rány. 6. Dostane-li se při práci infekční materiál do úst, je nutno ústa důkladně vypláchnout a vykloktat 1% roztokem KMnO4 nebo zředěným Lugolovým roztokem. 7. Dostane-li se infekční materiál do oka, musí se oko ihned vypláchnout borovou vodou. 8. Kontaminovanou pokožku nebo předmět (pracovní stůl, oděv) je nutné ihned otřít 0,1% roztokem Ajatinu. 9. Po ukončení pokusů před likvidací a mytím nádobí musí být mikrobiální kultury ve zkumavkách, Petriho miskách a ostatních kultivačních nádobách usmrceny autoklávováním nejméně 30. minut při 121oC. V žádném případě se nesmí kultury bez předešlého usmrcení vylévat do vodovodní výlevky nebo jiného odpadu.
Práce v mikrobiologické laboratoři 10. Rozbité sklo se odkládá pouze do určené nádoby. Je-li znečištěno mikrobiální kulturou musí se nejdříve vydezinfikovat ponořením do dezinfekčního prostředku za použití pinzety nebo kleští. Střepy se nikdy nesmějí sbírat rukou. 11. Před odchodem z laboratoře je nutno uklidit pracovní stůl i pomocné prostory, uložit potřebné kultury do chladničky, očistit objektivy mikroskopu a uschovat jej na příslušné místo, zkontrolovat, zda jsou uzavřeny plynové a vodovodní kohoutky a vypnuty všechny elektrické spotřebiče kromě nepřetržitě pracujících termostatů, třepaček a chladniček.
Aseptická práce Ruce omýt a otřít desinfekčním činidlem, povrch pracovní plochy před prací vydezinfikovat, pracovat blízko plamene, hrdla nádob i zátky před a po práci ožehnout plamenem, zátky nikdy nepokládat, ale držet je během celé práce dlaní a malíkem, nádoby s kulturou nebo sterilní roztoky nechávat otevřené jen po skutečně nezbytnou dobu a otevřené držet hrdlem blízko plamene v silně nakloněné (téměř vodorovně) poloze
Jednoduché barvení bakterií po fixaci a jeho hodnocení Potřeby : Bakteriální kultura, roztok krystalové violeti nebo karbolfuchsin, imerzní olej, podložní skla, očkovací jehla. Provedení : 1. Na odmaštěné ožehnuté podložní sklíčko asepticky (viz kap ) nanes kapku vyšetřovaného materiálu a rozetři na co největší plochu. Vyšetřujeme-li kulturu z tuhé půdy, přenes ožehnutou a ochlazenou očkovací jehlou malé množství buněk do kapky vody na podložní sklíčko. Pak ihned kličku ožehni. 2. Nátěr nech zaschnout na vzduchu nebo vysoko nad plamenem (sklo nesmí pálit při položení na hřbet ruky).pak uchop sklo pinzetou a třikrát je pomalu protáhni oxidační částí plamene kahanu tak, aby nátěr byl nahoře. 3. Po vychladnutí sklíčka pokryj nátěr buď roztokem krystalové violeti (Gramem I) na 15 20 vteřin nebo karbolfuchsinem na 30 vteřin. 4. Opláchni sklíčko slabým proudem vody, při čemž sklíčko je téměř ve svislé poloze a voda dopadá nikoliv na nátěr, nýbrž na místo nad ním. Osuš sklíčko přiložením filtračního papíru a dosuš vysoko nad plamenem. Na usušený nátěr kápni imerzní olej a mikroskopuj (bez krycího sklíčka!) za použití imerzního objektivu (zvětšení 10 x100).
Jednoduché barvení bakterií po fixaci a jeho hodnocení 5. Zakresli do protokolu nejčastěji se vyskytující buňky a jejich uspořádání. Zjisti také přítomnost spor (jeví se jako nezbarvená tělíska uvnitř buněk nebo jako nezbarvené válcovité útvary s tmavým obrysem), jejich tvar, poměr šířky k délce a umístění v buňce. Poznávej také, zda jsou spory širší než vegetativní buňky či nikoliv. 6. Stručně popiš veškeré mikroskopické morfologické znaky.v protokolu uveď mikroskopické zvětšení a makroskopické znaky mikroskopované kultury. Poznámka : Preparát nesmí být příliš hustý a nesmí obsahovat shluky buněk v důsledku jejich špatného rozmíchání. Jednotlivé buňky nebo jejich řetízky musí být od sebe dostatečně vzdálené, aby byl zřetelný jejich tvar a velikost.
Sterilizační zařízení Autokláv- zařízení v němž za zvýšené teploty a tlaku páry dochází ke sterilizaci. Tlak je obvykle 0,1-0,15MPa při teplotě 112-125 C. Slouží pro mikrobiologické účely k bezpečné sterilaci většiny kultivačních medií a roztoků, některých umělohmotných pomůcek (kyvety, špičky, mikrozkumavky atd.) a k likvidaci jakéhokoli infikovaného nebo kontaminovaného materiálu. Přerušovaná sterilizace při teplotě 99-100 C na dobu 20-30min, tento cyklus se opakuje 3x za 24hod, používá se jen u živných půd, které by tlaková sterilizace poškodila. Sterilizace ultrafialovým zářením - používá k usmrcení mikroorganismů ve vzduchu a na povrchu pracovních ploch (v očkovacích boxech a laboratořích). Používáme tzv.germicidní lampy, které vydávají záření o vlnové délce 240 280 nm.
Sterilizační zařízení Horkovzdušný sterilizátor - používají ke sterilaci laboratorního skla a některých pomůcek. Teplotu 160-180 C po dobu 1 až 3 hodin (počínaje dobou,kdy teplota dosáhla 160oC).
Sterilizační zařízení Sterilizační filtry - Používají se pro sterilaci čirých kapalin, které nesnášejí zahřívání. Je to buď asbestocelulosový filtr (tzv.seitzův filtr), nebo nyní častěji membránový filtr, který má velikost pórů 0,1-0,2 μ, případně 0,3-0,5 μm. Pro laboratorní mikrobiální filtraci se také používají skleněné sintrové kelímky nebo nuče
Fyzikální prostředky sterilace Sterilace ožeháváním - používá se pro hrdla zkumavek, baněk pro očkování, tubusů, nádob a na skleněné tyčinky k jejich uzavírání, pro očkovací a preparační jehly, pinzety, podložní skla a jiné kovové nebo skleněné předměty. Očkovací jehly ožehujeme v plameni kahanu a to po celé délce jehly až do žhnutí drátku a krátce ožehneme i tu část držáku, která bude při očkování zasahovat do kultivační nádoby. Ožehujeme těsně před očkováním a jehlu pak zchlazujeme na nezaočkované půdě, ve sterilní vodě nebo na okraji kultury. Po použití nutno jehlu ihned znovu ožehnout, abychom mikroorganismy z kultury neznečistily prostředí laboratoře.
Fyzikální prostředky sterilizace Sterilace filtrací - používá se pro plyny a čiré kapaliny, které by byly zahříváním poškozeny. Nejjednodušším vzdušným filtrem je vatová zátka kultivačních nádob. Filtrace kapalin - přes asbesto-celulosové vrstvy (tzv. Seitzův filtr) nebo přes membránové filtry,které se sterilují v autoklávu a dají se opakovaně použít.
Sterilizace chemickými prostředky Chemické prostředky se používají v mikrobiologické laboratoři nejčastěji pro sterilaci (případně dezinfekci) povrchu předmětů a pracovních ploch, dále do nádob pro ukládání použitých pipet a k rychlé likvidaci zbytků kultur, např. náhodně rozlitých na pracovní ploše. povrchově aktivní prostředky Ajatin(mýdlo, prací prostředek snižují účinnost) Persteril(korozivní), Etanol(50-70%),Formaldehyd
Očkování mikroorganismů Při pěstování nebo-li kultivaci mikroorganismů je zapotřebí přenést do sterilní živné půdy živé buňky žádaného druhu, což se označuje jako očkování (inokulace) a přenesené buňky se nazývají inokulum. Musíme postupovat přísně asepticky, tzn. že do kultury ani do používané půdy nesmí vniknout žádné cizí mikroorganismy ze vzduchu nebo z pracovních pomůcek.
Očkování kultury ve zkumavce na šikmý agar Uchop zkumavky do jedné ruky, do druhé očkovací kličku,kterou ožehneme v plameni. Pak ožehni okraje zkumavky, sejmi pomocí dlaně a malíku, zátky ze zkumavek znovu ožehni okraje zkumavek, ochlaď kličku na nezaočkované půdě, naber malé množství kultury a lehkým klikatým pohybem, vycházejícím ze zápěstí, je přenes na celý povrch šikmého agaru. Potom opět ožehni okraje zkumavek a dolní část jejich zátek, zazátkuj zkumavky, ožehni očkovací kličku a ulož vše do stojánku.vše pečlivě označíme.
Očkování z Petriho misky do zkumavek a naopak Zkumavku držíme v levé ruce ohnutým ukazovákem. Očkovací kličku, umístěnou v pravé ruce ožehneme plamenem, pak ožehneme okraj zkumavky, malíkem a dlaní pravé ruky vyjmeme její zátku, okraj zkumavky znovu ožehneme, palcem a prostředníkem levé ruky nadzdvihneme víčko Petriho misky nabereme kulturu, zavřeme misku a kulturu přeneseme známým způsobem do zkumavky. Pak ožehneme okraj zkumavky i vnitřní konec zátky, zkumavku zazátkujeme, ožehneme očkovací kličkou a označíme zkumavku štítkem.ze zkumavky na Petriho misku je postup obdobný.u plísní se doporučuje očkovat misky ze spodu, přičemž se drží spodek misky dnem vzhůru. Tím se zabrání rozprášení spor po celé ploše desky.
Očkování vpichem Vpich do ztužené půdy používáme většinou pro pěstování anaerobních MO. Provádí se rovnou očkovací jehlou (tj. bez koncové kličky) do svislého agaru nebo želatiny. Vpich má zasahovat asi 0.5 cm nad dno zkumavky.
Inkubace Optimální teploty Kvasinky 26-30 C (18-20 C) 1-2 dny Plísně 20-28 C, 2-5dní Psychrofilní 20 C Mezofilní 30-38 C Termofilní 50-55 C
Anaerobní podmínky Anaerobních podmínek dosáhneme vypuzením kyslíku z půdy varem a zabráněním dalšího přístupu vzduchu ke kultuře nebo vzduchotěsným uzavřením nádoby s kulturou a odstraněním kyslíku fyzikálními nebo chemickými metodami, vakuem, výměnnou vzduchu v kultivačním zařízení za inertní atmosféru, vysokou vrstvou agaru, přídavkem redukčních činidel do média aj. Půdu zaočkujeme, ihned převrstvíme sterilním rozehřátým agarem, parafínem nebo sterilním parafínovým olejem a ochladíme ve svislé poloze.
Barvení podle Gramma Potřeby : kultury sledovaných bakterií a odebraných vzorků,gram I, tj. roztok violeti, Lugolův jodový roztok, aceton, roztok safraninu, nesterilní pipeta 10 ml.
Barvení podle Gramma Provedení :Barvi 15 20 vteřin roztokem krystalové violeti, slij přebytečné barvivo, ale neoplachuj vodou.. Překryj Lugolovým roztokem na 15 20 vteřin, kapalinu slij.. Opláchni rychle acetonem (pokud preparát pouští barvivo, maximálně však 15vteřin), opláchni vodou a odcákni.. Dobarvuj safraninem 1 minutu, opláchni vodou, usuš a mikroskopuj s imerzí. G+druhy jsou zbarveny fialově, G- červeně.
Nativní preparát kvasinek Potřeby :kultury kvasinek, podložní sklíčko a krycí sklíčko, očkovací jehla. Provedení :připrav nativní preparát,pozoruj při zvětšení 10 45 nebo 10 60, Zjisti tvar buněk a jejich vnitřní strukturu, způsob vegetativního rozmnožování,přítomnost pseudomycelia nebo mycelia, blastospor a balistospor. kmeny s velmi protáhlými buňkami (např. rod Pichia, někteří příslušníci rodu Hansenula a některé R mutanty rodu Saccharomyces) mají drsný až zvrásněný povrch kolonií a v kapalině rostou ve formě křísu, tj. zvrásněné suché blanky na jejím povrchu, kdežto krátce oválné buňky tvoří hladké kolonie a sedlinu v kapalině.
Nativní preparát kvasinek Poznámky : 1. Je-li preparát zakalen, přidej ze strany kapku asi 5%ního KOH nebo 1%ní HCl Je-li v preparátě mnoho poškozených buněk, může to být způsobeno a) přílišným přitlačením krycího skla k podložnímu. Z buněk zůstávají jen prázdné buněčné stěny a protoplasma je formě zrníček rozptýlena v kapalině; b) jehla nebyla řádně ochlazena;protoplasma vějířkovitě vyhřezává z buněk. 2. Balistospory, tj. spory odmršťované ze zvláštních stopeček (sterigmat) a tvořené jen u tří rodů kvasinek (Sporobolomyces, Bullera a Spiridiobolus) se v nativním preparátu ze svých stopeček velmi snadno uvolňují a tyto stopky jsou dosti těžko odlišitelné od normálních výběžků mycelia.
Citlivost mikroorganismů k antibiotikům Antibiotika produkují bakterie, plísně a vyšší houby. Malá část se vyrábí průmyslově, asi 100 druhů a používají se ve vet. i humánní medicíně. Atb. dělíme podle chemické struktury, spektra účinnosti a mechanismu účinku na MO Správné použití Atb. vyžaduje kultivaci MO(vzorku) a test citlivosti k danému atb.
Citlivost MO k antibiotikům Disková difusní metoda je standardním postupem. Na povrch Petriho misky s vhodnou živnou půdou se rovnoměrně naočkuje testovaný mikroorganismus. Papírové disky napuštěné známými koncentracemi různých antibiotik se přiloží na povrch agaru..během následné inkubace antibiotika difundují z papíru do agaru a jejich koncentrace ve směru okraje disku postupně slábne. Účinné antibiotikum vytvoří kolem disku průzračnou zónu bez nárůstu buněk. Koncentrace antibiotika na okraji zóny představuje minimální inhibiční koncentraci (MIC). Pro vyhodnocení se udává průměr zóny v mm.
Zjišťování počtu MO v prostředí Přesvědčit se o vhodnosti technologických postupů v potravinářském průmyslu, o bezpečnosti sterilačních zákroků a konečně o sanitačních a hygienických podmínkách na daném úseku výroby nebo distribuce. 1. Přímé mikroskopické počítání buněk v různě upravených preparátech
Zjišťování počtu MO v prostředí 2. Elektronické počítání buněk průchodu jednotlivých buněk otvorem dochází ke změně vodivosti,jako u počítání krvinek) 3. Nefelometrické stanovení počtu mikroorganismů( buňky v čiré kapalině odrážejí světlo, měříme intenzitu) 4. Kultivační stanovení počtu mikrobů Smývací metoda je vhodná pro drobné předměty různě vysokého mikrobiálního znečištění, neboť se u ní může používat sériové zřeďování Otisková metoda se používá pro poměrně čisté, rovné předměty (např.kontrola sanitačních podmínek v provoze, kontrola mytí nádobí v hromadném stravování apod.). Princip spočívá v otisknutí mikrobů na desku živné půdy Tamponové metody můžeme použít pro předměty nejrůznějšího stupně mikrobiálního znečištění i pro předměty s nerovným povrchem, ať vnějším nebo vnitřním, nebo nepravidelného tvaru. 5. Stanovení buněčné hmoty mikroorganismů 6. Stanovení přibližného množství mikroorganismů na základě jejich biochemické činnosti
Počet MO v potravinách a potravinářských surovinách ukazatelem kvality i další údržnosti potravinářských výrobků je celkový počet mezofilních bakterií, zjišťovaný na masopeptonovém agaru s 1 % glukosy při 37 nebo 30 C ( CPM) ukazatelem hygienických podmínek při výrobě i distribuci je obsah koliformních bakterií jakožto indikátoru fekálního znečištění
Růstová křivka mikroorganismů
Imunologické metody Pro identifikaci a izolaci patogenních mikroorganismů, byla vyvinuta celá řada imunologických metod, umožňujících efektivní kontrolu průběhu onemocnění vyvolaného těmito mikroorganismy.jsou to rychlé a velmi přesné metody identifikace patogena. Reakce antigenu s protilátkoua) aglutinaci (antigen má korpuskulární charakter, nejčastěji bakterie), b) precipitaci (antigen je molekulární povahy exotoxiny, viry), c) fixace komplementu jedná se o vazbu komplementu (součást krevního séra) na komplex antigen-protilátka, působí lýzu antigenu, např. bakteriální buňky.
Imunofluorescence stanovení přítomnosti patogena kvantitativně i kvalitativně, využívá schopnosti některých fluoreskujících látek pevně se vázat na globulinové molekuly patogena a umožní jeho snadnou identifikaci v fl.mikroskopu a. RIA radioimunostanovení, kdy antigen je značen radionuklidem, b. EIA enzymoimunostanovení, kdy antigen je značen enzymem, c. FIA imunofluorostanovení, kdy je antigen značen fluorescenčním činidlem
Otázky Proč musíme při ozařování UV světlem odstranit víčko skleněné Petriho misky? Které bakterie jsou citlivější vůči barvivům? G+ nebo G- bakterie? Co jsou halofilní bakterie a osmotolerantní kvasinky? Jak zjišťujeme počet mikroorganismů na povrchu předmětů? Jak můžete zjistit počet mikrobiálních buněk v prostředí? Která z metod stanovení počtu MO je nejrychlejší? Co je to kvalitativní stanovení MO? Uveď jeden přiklad metody stanovení.
Otázky Uveď příklady fyzikální sterilizace. Uveď příklady chemické sterilizace. Co je to autokláv? Jaké znáte metody kultivačního stanovení počtu MO z povrchu? Odkud získáváme antibiotika? Jak dosáhneme anaerobních podmínek při kultivaci? Uveďte základní typy barvení MO podle účelu.