cobas TaqScreen DPX Test DPX

cobas TaqScreen DPX Test for use on the cobas s 201 system PRO ÚČELY DIAGNOSTIKY IN VITRO. cobas TaqScreen DPX Test DPX 96 Tests P/N: 05509203 190 cobas TaqScreen DPX Control Kit DPX CTL 12 Sets P/N: 05509181 190 cobas TaqScreen Wash Reagent TS WR 5.1 L P/N: 04404220 190 ÚČEL POUŽITÍ Test cobas TaqScreen DPX pro použití se systémem cobas s 201 je test založený na amplifikaci nukleové kyseliny in vitro určený pro přímou kvantifikaci DNA genotypů 1, 2 a 3 parvoviru B19 a přímou kvalitativní detekci RNA genotypů I, II a III viru hepatitidy A (HAV) v lidské plazmě. Test cobas TaqScreen DPX je určen jako mezioperační test pouze ke kvantifikaci DNA parvoviru B19 nebo ke kvantifikaci DNA parvoviru B19 a současně k detekci RNA viru hepatitidy A v plazmě určené pro další zpracování. Je možné použít plazmu z plné krve (získanou plazmu) nebo plazmu odebranou aferézou (dárcovskou plazmu). Plazmu od všech dárců nebo ze směsí je možné testovat jako jednotlivé vzorky nebo ve směsích skládajících se z alikvotních podílů jednotlivých vzorků. Tento test není určen pro použití u vzorků pupečníkové krve. Tento test není určen pro použití jako pomůcka pro stanovení diagnózy. SOUHRN A VÝKLAD TESTU Test cobas TaqScreen DPX zahrnuje použití více barviv, což umožňuje současnou detekci jednotlivých cílů bez nutnosti použít rozlišovací testy. V závislosti na instalovaném definičním souboru testu (TDF) poskytne test cobas TaqScreen DPX kvantitativní výsledek B19 a kvalitativní výsledek HAV, nebo pouze kvantitativní výsledek B19. Lidský parvovirus B19 (B19) je malý neobalený virus s jednovláknovou DNA, který patří do rodu Erythrovirus skupiny Parvoviridae 1. Lidské erytroviry jsou uskupeny do tří oddělených genotypů: genotyp 1 (vlákna B19), genotyp 2 (vlákna A6) a genotyp 3 (vlákna V9/D91.1) 1. B19 je rozšířen celosvětově a sérologické studie ukázaly, že alespoň 50 % dospělých má protilátky IgG proti B19, což ukazuje na prodělanou infekci 2, 3. Virus je spojen s klinickým onemocněním, jehož projevy a závažnost závisejí na imunologickém a hematologickém stavu jednotlivce 4. U imunokompetentních jedinců je infekce obvykle bez symptomů nebo může mít mírné projevy včetně erythema infectiosium (pátá nemoc) u dětí nebo artropatie u dospělých. Nicméně B19 může způsobit závažné onemocnění, jako je tranzitorní aplastická anémie u jedinců s hematologickými poruchami a vodnatelností a vrozenou anémii nebo smrt plodu u těhotných žen 4. Prevalence B19 v krvi a plazmě dárců se může pohybovat v rozmezí 0,003 0,6 % v závislosti na tom, zda byl odběr proveden v epidemickém nebo neepidemickém období 5, 6. Přestože se B19 normálně přenáší respirační cestou, může dojít k přenosu plazmovými produkty kvůli velikosti směsí plazmy, výskytu akutních, inaparentních infekcí B19, vysoké hladině virů u viremických dárců (až 10 12 IU/ml) a rezistence B19 vůči většině běžně užívaným krokům inaktivace/odstranění, jako je zpracování s rozpouštědlem/detergentem (S/D) nebo pasterizací 7. Byla hlášena přítomnost DNA B19 ve směsích plazmy a v plazmových produktech 8-10 a v literatuře se uvádí mnoho případů přenosu B19 při podání plazmových produktů, zvláště koagulačními faktory 7, 11-13. Oddíl s informacemi o revizi dokumentu se nachází na konci tohoto dokumentu. 1

Virus hepatitidy A (HAV) je malý neobalený virus RNA, který patří k hepatovirům ze skupiny Picornaviridae 14. HAV, který je rozšířen celosvětově, se přenáší orálně-fekální cestou, primárně blízkým osobním kontaktem. Epidemie jsou běžné v rozvojových zemích, kdy dojde k infekci v rané fázi života, díky čemuž má velká část populace protilátky proti HAV 15, zatímco ve vyspělých průmyslových zemích pokles výskytu viru vedl k posunu infekce do dospělosti 16. Infekce HAV u lidí jsou v rozsahu od asymptomatických infekcí, většinou u malých dětí, až po plně rozvinutou hepatitidu, která v některých případech může vést až ke smrti. V severní Evropě, Japonsku, Kanadě a USA je prevalence v obecné populaci velmi nízká (asi 0,01 %) a vypuknutí jsou spojena většinou s vysoce rizikovými skupinami, jako jsou cestovatelé do endemických regionů 17. HAV je možné rozdělit podle různých genotypů (I VI); genotypy I, II a III se vyskytují u lidí 18, 19. I když infekční HAV je možné nalézt v krvi během časového období tvorby protilátek 20, riziko přenosu při transfuzi HAV je velmi nízké. Nicméně stejně jako u B19, ani HAV nelze jednoduše deaktivovat zpracováním S/D (rozpouštědlem/detergentem) nebo pasterizací a byly zveřejněny zprávy o přenosu HAV plazmovými produkty, zvláště koagulačními faktory 21-23. Kontaminaci směsí plazmy B19 a HAV je možné stanovit testováním NAT a těsně po roce 2000 někteří výrobci plazmy začali používat testování NAT plazmy určené pro další zpracování na DNA B19 a RNA HAV. Testování bylo zaměřeno na snížení zátěže B19 ve směsích plazmy a odstranění jednotek kontaminovaných HAV. Takovému testování se říká mezioperační testování. Přítomnost protilátek IgG proti B19 ve směsích plazmy a zprávy o přenosu B19 v produktech obsahujících > 10 4 IU/ml B19 DNA 7 vedly FDA k navržení limitu < 10 4 IU/ml B19 DNA ve směsích plazmy určených pro další zpracování a vytvoření evropské směrnice pro plazmu určenou pro výrobu anti-d imunoglobulinu a plazmy ošetřené za účelem virové inaktivace 24, 25, 26. V současnosti neexistují regulační požadavky pro testování HAV ve směsích plazmy. Nicméně evropské směrnice vyžadují, aby při testování NAT směsí plazmy na HAV prováděné jako mezioperační testování dokázal test detekovat kontrolu obsahující 100 IU/ml RNA HAV 26. Test cobas TaqScreen DPX je duplexní test určený pro simultánní detekci parvoviru B19 a HAV v jednotlivých vzorcích nebo směsích plazmy humánního původu. Použití technologie s více barvivy umožňuje identifikaci každého virového cíle bez nutnosti dalšího rozlišovacího testování. Navíc díky použití kvantifikačního standardu (QS) přímo zjistitelného dle mezinárodního standardu B19 WHO 27 nabízí test kvantifikační hodnotu (v IU/ml) cíle B19. S každým vzorkem je extrahován a amplifikován QS spolu s vnitřní kontrolou (IC) (pro cíl HAV). Test cobas TaqScreen DPX používá obecnou techniku přípravy nukleové kyseliny na zařízení COBAS AmpliPrep. DNA parvoviru B19, RNA HAV, QS a IC jsou amplifikovány a detekovány pomocí automatizované, v reálném čase probíhající polymerázové řetězové reakce (PCR) na analyzátoru COBAS TaqMan. Rozlišení virového cíle, QS a IC se dosahuje použitím fluorescenčně značených sond, které jsou detekovány v oddělených kanálech analyzátoru COBAS TaqMan. Pro snížení potenciální kontaminace již amplifikovaným materiálem (amplikon) zahrnuje test enzym AmpErase (enzym uracil-n-glykosylázy). PRINCIPY POSTUPU Test cobas TaqScreen DPX, použitý na systému cobas s 201, je založen na 4 hlavních procesech: 1. Automatická tvorba směsí a pipetování kontrol pomocí pipetoru Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD (volitelně) 2. Automatická příprava vzorků pomocí zařízení COBAS AmpliPrep 3. Automatická amplifikace nukleové kyseliny a automatická detekce PCR produktů v reálném čase pomocí analyzátoru COBAS TaqMan 4. Automatické řízení dat pomocí softwaru pro tvorbu směsí a řízení dat (PDM) Automatická tvorba směsí vzorků a pipetování pomocí pipetoru Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipetor Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD automatizuje pipetování jednotlivých vzorků dárců, tvorbu směsí vzorků od více dárců a pipetování kontrol testů. Systém cobas s 201 dokáže rozlišit reaktivní směsi na jednotlivé složky vzorků. Systém cobas s 201 je navržen pro dávkové zpracování vzorků. Dávka je definována jako soubor vzorků a kontrol, které jsou společně pipetovány, extrahovány, amplifikovány a detekovány. Jakmile pipetor Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD dokončí pipetování dávky, celý stojan se vzorky je přenesen do zařízení COBAS AmpliPrep k dalšímu kroku zpracování. 2

Automatická příprava vzorků pomocí zařízení COBAS AmpliPrep Simultánně se zpracovávají nukleové kyseliny ze vzorků a přidané molekuly IC Armored HAV RNA a molekuly QS DNA parvoviru B19 zapouzdřené v obalu lambda (které slouží jako kontroly pro přípravu a amplifikaci/detekci/kvantifikaci vzorků). Test cobas TaqScreen DPX obsahuje činidla, která provádí pět sekvenčních kroků na zařízení COBAS AmpliPrep. Roztok proteinázy rozpouští proteiny k podpoře štěpení, deaktivuje nukleázy a usnadňuje uvolnění RNA a DNA z virových částic. Přidání činidla pro lýzu ke vzorku má za důsledek štěpení virů a aktivaci nukleázy díky denaturaci proteinů. Dochází k uvolňování RNA a DNA a zároveň ochraně před nukleázami. Uvolněné nukleové kyseliny se váží na rosolový povrch přidaných magnetických skleněných částic. To se děje hlavně díky čistému kladnému náboji na povrchu skleněných částic a čistému zápornému náboji nukleových kyselin za koncentrace chaotropní soli a iontové síly štěpicí reakce. Promývací činidlo odstraňuje nenavázané látky a nečistoty, jako jsou denaturované bílkoviny, buněčný odpad a potenciální PCR inhibitory (například hemoglobin, atd.) a snižuje koncentraci soli. Vyčištěné nukleové kyseliny se uvolní z magnetických skleněných částic při zvýšené teplotě elučním pufrem. Automatická amplifikace a detekce nukleové kyseliny pomocí analyzátoru COBAS TaqMan Po izolaci vyčištěných nukleových kyselin z lidské plazmy během automatické přípravy vzorku se používá cobas TaqScreen DPX Master Mix (MMX) pro amplifikaci a detekci RNA HAV a RNA IC a amplifikaci a kvantifikaci DNA parvoviru B19 a DNA QS. Po aktivaci umožňuje cobas TaqScreen DPX Master Mix reverzní transkripci (pro cílové RNA) přídavkem octanu manganatého, po které následuje PCR amplifikace vysoce chráněných oblastí RNA HAV, RNA IC, DNA parvoviru B19 a DNA QS pomocí specifických primerů. Amplikony se detekují hybridizací specifických oligonukleotidových sond. Amplifikace, hybridizace a detekce probíhají současně. Reverzní transkripce a PCR amplifikace Reverzní transkripce a amplifikace se provádí pomocí termostabilního rekombinantního enzymu, Z05 DNA Polymerázy. Za přítomnosti manganu (Mn 2+ ), vykazuje Z05 DNA Polymeráza reverzní transkriptázu a polymerázové aktivity DNA. Díky tomu může reverzní transkripce a PCR amplifikace probíhat v téže reakční směsi. Během PCR amplifikace dochází při cyklování ve střídavě vysoké teplotě k denaturaci cílového a IC/QS amplikonu a vzniká jednořetězcová DNA. Z05 DNA Polymeráza prodlužuje napojené primery podél cílových templátů a vytváří dvouřetězcovou DNA (amplikon). Tento proces se několikrát opakuje a v každém cyklu se zdvojnásobuje množství amplikonu. Amplifikace probíhá pouze v oblasti cílových genomů mezi primery; všechny genomy amplifikovány nejsou. Prevence kontaminace při přenosu Kontaminaci amplikony při přenosu je zabráněno použitím enzymu AmpErase (uracil-n-glykosylázy) a deoxyuridin-trifosfátu (dutp). Deoxyuridin se v přírodní DNA nevyskytuje, ale v amplikonu je vždy přítomen vzhledem k tomu, že se v Master Mixu používá jako jeden dntp směs deoxiuridintrifosfátu s thymidintrifosfátem. Proto pouze amplikon obsahuje deoxyuridin. Enzym AmpErase rozpoznává a katalyzuje destrukci vláken DNA obsahujících deoxyuridin 28 rozevřením deoxyribozového řetězce v poloze C1, čímž se DNA stává neamplifikovatelnou. DNA obsahující deoxythymidin nebo RNA obsahující ribouridin 29,30 není ovlivněná. Během počátečního kroku reverzní transkripce enzym AmpErase katalyzuje rozštěpení přenosového amplikonu v místě deoxyuridinového zbytku. Enzym AmpErase je neaktivní po delší dobu, jakmile je vystaven teplotám nad 55 C, a proto nerozkládá nově vzniklý cílový amplikon. 31, 32 Detekce produktů PCR Test cobas TaqScreen DPX MMX obsahuje detekční sondy specifické pro nukleovou kyselinu HAV, IC, parvovirus B19 nebo QS. Každá detekční sonda je označena 1) jedním ze čtyř oznamovacích fluorescenčních barviv a 2) dalším barvivem, které je tlumicí. Každé specifické oznamovací barvivo je asociováno s odpovídajícím cílem a měřeno při definované vlnové délce. Ve všech sondách se používá jeden typ tlumicího barviva. Tento systém umožňuje detekci všech amplifikovaných cílů při různých vlnových délkách. Před začátkem PCR amplifikace jsou sondy intaktní a oznamovací fluorescenční barvivo je potlačeno tlumicím barvivem kvůli vlivu Försterova přenosu energie. Během PCR amplifikace sonda hybridizuje na specifické jednovláknové řetězce DNA a ve stejnou chvíli, kdy nastává amplifikace, jsou rozštěpeny 5' až 3' nukleázovou aktivitou Z05 DNA polymerázy. Jakmile jsou oznamovací a tlumicí barviva tímto štěpením oddělena, dojde k odmaskování fluorescenční aktivity oznamovacího barviva. U každého PCR cyklu jsou generována zvýšená množství rozštěpených sond a kumulativní signál oznamovacího barviva se postupně zvyšuje. 3

Detekce PCR produktů v reálném čase je prováděna nezávislým měřením fluorescence uvolněných oznamovacích barviv, které představují virové cíle a dále IC a QS. Řízení dat pomocí softwaru PDM Software Roche PDM umožňuje uživateli prohlížet a vytvářet hlášení výsledků. Software Roche PDM označuje výsledky testu cobas TaqScreen DPX jako nereaktivní, reaktivní nebo neplatné na cíl HAV a < mez, mez nebo neplatné na cíl B19. Kromě vybírání a prohlížení výsledků PCR umožňuje software Roche PDM obsluze tisknout zprávy, hledat výsledky, přijímat výsledky dárců a jako volitelně i odesílat výsledky do LIS. MATERIÁLY POSKYTOVANÉ SPOLEČNOSTÍ ROCHE Pro detekci RNA HAV a kvantifikaci DNA parvoviru B19 ve vzorcích plazmy jsou nutné a dodávají se tři sady: 1) test cobas TaqScreen DPX, 2) kontrolní sada cobas TaqScreen DPX a 3) promývací činidlo cobas TaqScreen. Bezpečnostní listy pro materiály (MSDS) zašle na vyžádání Vaše místní pobočka společnosti Roche. cobas TaqScreen DPX Test (P/N: 05509203 190) DPX CS1 (DPX kazeta s činidly pro magnetické skleněné částice) DPX CS2 (DPX kazeta s lytickým činidlem) DPX CS3 (DPX multičinidlová kazeta) DPX CS4 (Kazeta s činidly specifickými pro test DPX) DPX 96 testů cobas TaqScreen DPX Control Kit Kontrolní sada pro cobas TaqScreen DPX (P/N: 05509181 190) DPX CTL 12 sad DPX D(+)C (duální kontrola HAV pozitivní a nízko pozitivní na parvovirus B19) DPX H(+)C (vysoce pozitivní kontrola na parvovirus B19) DPX ( ) C (cobas TaqScreen DPX negativní kontrola) cobas TaqScreen Wash Reagent Promývací činidlo cobas TaqScreen (P/N: 04404220 190) TS WR (Promývací činidlo cobas TaqScreen) TS WR 5,1 l 4

DALŠÍ POTŘEBNÝ MATERIÁL, KTERÝ JE VŠAK PRODÁVÁN SAMOSTATNĚ (MŮŽE BÝT ZAKOUPEN OD SPOLEČNOSTI ROCHE) Tento test musí být prováděn na systému cobas s 201. Systém cobas s 201 musí být instalován a používán jako úplná konfigurace systému. Jednotlivé součásti systému cobas s 201 nemohou být používány jako samostatné přístroje ani nesmí být nahrazeny jinými komponenty. Systém cobas s 201 využívá níže uvedené součásti: Vybavení a software systému cobas s 201 Pipetor Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD (volitelně), pracovní stanice a software Pooling Manager Zařízení COBAS AmpliPrep Analyzátor COBAS TaqMan Datová stanice a software AMPLILINK Roche PDM Data Manager Server, pracovní stanice a software Data Manager Definiční soubor testu DPX pro test cobas TaqScreen DPX Definiční soubor testu parvovirus B19 (B19) pro test cobas TaqScreen DPX Stojany a spotřební materiál Stojany na vzorky COBAS AmpliPrep (SK24) (P/N: 28122172001) SPU stojany COBAS AmpliPrep (P/N: 05471664001) Stojany na činidla COBAS AmpliPrep (P/N: 28122199001) Jednotky pro zpracování vzorku (SPU): (P/N: 03755525001) Vstupní zkumavky pro vzorky (S-zkumavky) s klipy s čárovým kódem (P/N: 03137040001) Stojany s K-špičkami (P/N: 03287343001) Box s K-zkumavkami v počtu 12 x 96 (P/N: 03137082001) K-nosič analyzátoru COBAS TaqMan (P/N: 28150397001) Vysokoobjemové špičky CO-RE (1000 µl), filtr (P/N: 04639642001) Destičky s hlubokými jamkami se štítky s čárovým kódem (P/N: 04639634001) Lepicí fólie pro destičky s hlubokými jamkami (P/N: 04789288001) Nosič vzorků pro 24 testovacích zkumavek (P/N: 04639502001) Nosič vzorků pro 32 testovacích zkumavek (P/N: 04639529001) Nosič špiček (P/N: 04639545001) Nosič destiček pro destičky s hlubokými jamkami (P/N: 04639553001) Nosič stojanů SK24 (P/N: 04639600001) Souprava dezinfekčního spreje Hamilton (P/N: 06254250001) Souprava detergentu Hamilton MICROLAB (P/N: 06254268001) Rukavice na jedno použití bez pudru 5

ČINIDLA cobas TaqScreen DPX Test (P/N: 05509203 190) DPX CS1 MGP (Magnetické skleněné částice) Magnetické skleněné částice 93 % Isopropanol Xi 93 % (hm.) Isopropanol DPX 96 testů 2 x 48 testů 2 x 7,0 ml Dráždivý F 93 % (hm.) Isopropanol Vysoce hořlavý DPX CS2 LYS (Lyzační činidlo) Dihydrát citrátu sodného 42,5 % Guanidinthiokyanát < 14 % Polydokanol 0,9 % Dithiothreitol Xn 42,5 % (hm.) guanidinthiokyanát 2 x 48 testů 2 x 78 ml Zdraví škodlivý DPX CS3 Pase (Roztok proteinázy) TRIS pufr < 0,05 % EDTA Chlorid vápenatý Octan vápenatý 7,8 % proteináza Glycerol Xn 7,8 % (hm.) Proteináza 2 x 48 testů 2 x 3,8 ml Zdraví škodlivý EB (Eluční pufr) TRIS pufr 0,2 % Methylparaben jako konzervant DPX CS4 DPX MMX-R1 (Činidlo DPX Master Mix 1) Octan draselný Octan manganatý Glycerol 14,4 % dimetylsulfoxid 0,08 % azid sodný Kyselina octová 2 x 7,0 ml 2 x 48 testů 2 x 3,0 ml 6

DPX MMX-R2 (Činidlo DPX Master Mix 2) Tricinový pufr Octan draselný Hydroxid draselný 4,1 % dimetylsulfoxid Glycerol Tween 20 < 0,09 % datp, dgtp, dctp, dutp, dttp < 0,01 % Upstream a downstream primery parvoviru B19 a HAV < 0,01 % Fluorescenčně značené sondy specifické pro parvovirus B19 a HAV < 0,01 % Fluorescenčně značené sondy specifické pro QS B19 a IC HAV < 0,01 % Oligonukleotidový aptamer < 0,01 % Z05 DNA polymeráza (mikrobiální) < 0,01 % enzym AmpErase (uracil-n-glykosyláza) (mikrobiální) 0,08 % azid sodný DPX IC/QS (Vnitřní kontrola a kvantifikační standard DPX) TRIS pufr 0,002 % Poly ra RNA (syntetická) EDTA 0,05 % azid sodný < 0,001 % neinfekční, syntetická RNA IC zapouzdřená v bílkovině s bakteriofágním obalem MS2 < 0,001 % neinfekční, syntetická DNA QS B19 zapouzdřená v bílkovině s bakteriofágním obalem Lambda 2 x 2,5 ml 2 x 13 ml cobas TaqScreen DPX Control Kit Kontrolní sada pro cobas TaqScreen DPX (P/N: 05509181 190) DPX CTL 12 sad DPX D(+)C 12 x 1,6 ml (Duální pozitivní kontrola DPX) < 0,001 % neinfekční syntetická RNA HAV zapouzdřená v bílkovině s bakteriofágním obalem MS2 < 0,001 % neinfekční syntetická DNA parvoviru B19 zapouzdřená v bílkovině s bakteriofágním obalem Lambda Negativní lidská plazma, nereaktivní podle testů licencovaných US FDA na IgG proti parvoviru B19 a protilátky IgM, HBsAg, protilátky proti HBV core, protilátky proti HCV, protilátky proti HIV-1/2 a RNA HIV-1. Nereaktivní podle NAT na RNA HAV a DNA parvoviru B19 5 IU/ml dle PCR metod. 0,1 % konzervantu ProClin 300 Xi (3:1) Směs 5-chloro-2-metyl-2H-izotiazolin-3-on a 2-metyl-2H-izotiazolin-3-on Dráždivý R43: Může vyvolat senzibilizaci při styku s kůží. 7

DPX H(+)C 12 x 1,6 ml (Vysoce pozitivní kontrola DPX) < 0,001 % neinfekční syntetická DNA parvoviru B19 zapouzdřená v bílkovině s bakteriofágním obalem Lambda Negativní lidská plazma, nereaktivní podle testů licencovaných US FDA na IgG proti parvoviru B19 a protilátky IgM, HBsAg, protilátky proti HBV core, protilátky proti HCV, protilátky proti HIV-1/2 a RNA HIV-1. Nereaktivní podle NAT na RNA HAV a DNA parvoviru B19 5 IU/ml dle PCR metod. 0,1 % konzervantu ProClin 300 Xi (3:1) Směs 5-chloro-2-metyl-2H-izotiazolin-3-on a 2-metyl-2H-izotiazolin-3-on Dráždivý R43: Může vyvolat senzibilizaci při styku s kůží. DPX ( ) C (negativní kontrola cobas TaqScreen DPX) Pufr s fosforečnanem sodným EDTA 0,002 % Poly ra RNA (syntetická) Amarantové barvivo 0,1 % konzervantu ProClin 300 Xi Směs (3:1) 5-chloro-2-methyl-2H-isothiazol-3-onu a 2-methyl-2H-isothiazol-3-onu 12 x 1,6 ml Dráždivý R43: Může vyvolat senzibilizaci při styku s kůží. cobas TaqScreen Wash Reagent Promývací činidlo cobas TaqScreen (P/N: 04404220 190) TS WR (Promývací činidlo cobas TaqScreen) Dihydrát citrátu sodného 0,1 % Methylparaben jako konzervant POŽADAVKY NA SKLADOVÁNÍ A MANIPULACI A. Pokojová teplota je definována jako 15 až 30 C. B. Činidla ani kontroly nezmrazujte. TS WR 5,1 l C. DPX CS1, DPX CS2, DPX CS3 a DPX CS4 uchovávejte při teplotě 2 až 8 C. Pokud jsou nepoužitá, jsou tato činidla stabilní až do vyznačeného data expirace. D. Po prvním použití jsou při teplotě 2 až 8 C stabilní ještě 30 dní nebo do data expirace, je-li tato doba kratší. E. Činidla mohou být použita až pro 6 cyklů na přístroji, do maximálního počtu 48 hodin použití na přístroji COBAS AmpliPrep. Činidla musí být mezi jednotlivými použitími uchována při teplotě 2 až 8 C. Software AMPLILINK monitoruje celkovou dobu vložení kazet s činidly v zařízení COBAS AmpliPrep a po celkově 48 hodinách použití kazety zablokuje. F. Software AMPLILINK nekontroluje počet cyklů zařízení, pro které byly kazety použity. Je odpovědností uživatele zlikvidovat kazety s činidly po 6 cyklech na zařízení. G. DPX D(+)C, DPX H(+)C a DPX ( ) C uschovávejte při teplotě 2 až 8 C. Kontroly jsou stabilní až do vyznačeného data expirace. Po otevření je nutné nespotřebovanou část zlikvidovat. H. TS WR skladujte při teplotě 15 až 30 C. Neotevřený je TS WR stabilní do uvedeného data expirace. Po otevření je toto činidlo stálé po dobu 30 dní při teplotě 15 až 30 C nebo do data expirace, je-li tato doba kratší. 8

BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ PRO ÚČELY DIAGNOSTIKY IN VITRO. A. Vzorky mohou být infekční. Při provádění analýzy dodržujte obecná bezpečnostní opatření. 33,34 Tuto proceduru smí provádět pouze personál vyškolený pro použití testu cobas TaqScreen DPX a pro zacházení s infekčním materiálem. Všechny pracovní plochy důkladně očistěte a vydezinfikujte čerstvě připraveným 0,5 % roztokem chlornanu sodného v destilované nebo deionizované vodě (zředěný bělící prostředek). Dále povrch otřete 70% etanolem. B. POZOR: DPX D(+)C a DPX H(+)C obsahují lidskou plazmu pocházející z lidské krve. Použitá plazma byla testována a byla nereaktivní na protilátky IgG a IgM proti parvoviru B19, HBsAg, HBV core Ab, HCV Ab, HIV-1/2 Ab; nereaktivní na RNA HIV-1 v testu NAT. Použitá plazma byla rovněž testována testem cobas TaqScreen DPX a byla nereaktivní na RNA HAV a obsahovala 5 IU/ml DNA parvoviru B19. Nicméně žádná známá testovací metoda nepředstavuje dokonalou záruku, že se s deriváty z lidské krve nepřenesou nějaká infekční agens. Veškeré materiály pocházející z krve by měly být považovány za potenciálně infekční a musí se s nimi zacházet dle všeobecných bezpečnostních opatření. Pokud dojde k rozlití vzorku, ihned místo dezinfikujte čerstvě připraveným roztokem 0,5 % chlornanu sodného (zředěné bělidlo) nebo postupujte dle vlastních vhodných procedur laboratoře. C. Používejte běžná laboratorní bezpečnostní opatření. Nepipetujte ústy. V pracovních laboratorních prostorách nejezte, nepijte a nekuřte. Při práci se vzorky a sadami činidel používejte rukavice na jedno použití, pracovní oděv a ochranné brýle. Po práci se vzorky a činidly si důkladně umyjte ruce. D. DPX MMX-R1, DPX MMX-R2 a DPX IC/QS obsahují azid sodný jako konzervant. Pokud mají být roztoky obsahující azid vylity do odpadního systému, musí být zředěny a spláchnuty větším množstvím tekoucí vody. Tato bezpečnostní opatření jsou doporučena, aby nedocházelo k nashromáždění usazenin v kovovém potrubí, kde by se mohly vyvinout výbušné podmínky. E. Prokázalo se, že Heparin inhibuje PCR. U této procedury nepoužívejte heparinizovanou plazmu. F. Doporučuje se používat sterilní pipety na jedno použití a špičky na pipety bez nukleázy. Pokud se během zacházení se vzorkem a zpracování nezabrání křížové kontaminaci vzorků, mohou vzniknout falešně pozitivní výsledky. G. Pro zajištění optimální účinnosti testu používejte pouze spotřební materiál, který je součástí dodávky, nebo dále specifikovaný požadovaný materiál. H. S veškerým materiálem obsahujícím vzorky nebo kontroly zacházejte dle zásad správné laboratorní praxe, aby se zabránilo křížové kontaminaci vzorků nebo kontrol. I. Před použitím vizuálně zkontrolujte každou kazetu s činidly, kontrolní zkumavku a promývací činidlo, zda nejeví žádné známky netěsnosti. Pokud známky netěsnosti vykazuje, nepoužívejte tento materiál k testování. J. Všechen materiál, který se dostal do kontaktu se vzorky a činidly, zlikvidujte dle celostátních, respektive místních předpisů. K. Nepoužívejte test cobas TaqScreen DPX, kontrolní soupravu cobas TaqScreen DPX nebo promývací činidlo cobas TaqScreen po datu expirace. Nezaměňujte, nemíchejte ani nekombinujte činidla z různých souprav nebo šarží. Neplňte různé šarže činidel do zařízení COBAS AmpliPrep. L. Bezpečnostní listy pro materiály (MSDS) zašle na vyžádání Vaše místní pobočka společnosti Roche. M. Vyhněte se kontaktu činidel s pokožkou, očima nebo sliznicemi. Pokud dojde ke kontaktu, okamžitě postiženou oblast omyjte velkým množstvím vody, jinak může dojít k popáleninám. Pokud se činidlo rozlije, zřeďte ho před vytřením dosucha vodou. N. Nenechte činidlo LYS obsahující guanidinthiokyanát přijít do styku s roztokem chlornanu sodného (bělicím prostředkem). Ze směsi by se mohl uvolňovat vysoce toxický plyn. O. Pečlivě dodržujte uvedené postupy a předpisy, aby se zajistilo správné provedení testů. Jakákoliv odchylka od postupů a předpisů může negativně ovlivnit optimální účinnost testu. P. Vyhněte se použití nadměrně hemolyzovaných vzorků. Q. Kontaminace vzorků plazmy červenými krvinkami (> 5 %) může inhibovat test cobas TaqScreen DPX. R. Nepoužívejte žádnou součást s poškozenými štítky s čárovými kódy v žádné fázi testování. 9

PŘÍPRAVA KONTROL A ČINIDEL A. Před vložením kontrolní soupravy cobas TaqScreen DPX do pipetoru Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD nebo před použitím ponechte soupravu zahřát 30 minut při pokojové teplotě pro vyrovnání teplot. 30 minut před použitím ponechte testovací činidla cobas TaqScreen DPX v přístroji COBAS AmpliPrep zahřát na pokojovou teplotu. ODBĚR, SKLADOVÁNÍ A VYTVÁŘENÍ SMĚSÍ VZORKŮ Pozn.: Se všemi vzorky je třeba zacházet jako s infekčními. Vzorky A. Vzorky odebrané do EDTA, CPD, CPDA-1, CP2D, ACD-A, 4% citrátu a zkumavek pro přípravu plazmy BD Vacutainer (PPT) je možné použít v testu cobas TaqScreen DPX. Postupujte dle pokynů výrobce vzorkové zkumavky. B. Krev odebraná s použitím EDTA, CPD, CPDA-1, CP2D, ACD-A, 4% citrátu a PPT je možno před oddělením plazmy skladovat až 72 hodin při teplotě 2 30 C a poté až 48 hodin při 2 8 C. Při skladování delším než 5 dní je nutné plazmu oddělit od červených krvinek a je možné ji skladovat při teplotě 2 8 C až 9 dní. Stabilita plné krve 30 Plná krev (2 C 30 C) Teplota ( C) 20 10 Plná krev (2 C 8 C) Plazma (2 C 8 C) 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 C. Plazma z aferézy s použitím antikoagulantu EDTA, CPD, CPDA-1, CP2D, ACD-A nebo 4% citrátu sodného může být uchována až 10 dní od doby odběru při teplotě 2 30 C a poté až 46 dní při teplotě 2 8 C. D. Následující směrnice pro objem plazmy jsou založeny na pipetování ze skleněných nebo plastových dárcovských zkumavek 13 x 100 mm na pipetoru Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD. Uvedené objemy jsou určeny pro plazmu na povrchu zhuštěných červených krvinek a pro použití při testu cobas TaqScreen DPX. Typ směsi Minimální objem plazmy Primární směs* 3 ml Opakovaná směs 1,5 ml Rozlišovací směs 2 ml *Zahrnuje vytvoření destičky s hlubokými jamkami (archivní destičky) E. Plnou krev nezmrazujte. F. Zakryté destičky s hlubokými jamkami mohou být uskladněny při teplotě -18 C až po dobu 50 dní. Dny 10

G. Plazma v EDTA, CPD, CPD-A, CP2D, ACD-A a 4% citrátu sodném může být uchována až 6 měsíců při teplotě -18 C. Po trojím (3) zmrazení a rozmrazení vzorků plazmy nebyly pozorovány žádné nepříznivé účinky na výsledek testu. H. Před použitím ponechte smíchané nebo jednotlivé vzorky dárců zahřát na pokojovou teplotu. I. Uživatel musí ověřit další podmínky odběru a skladování. Pokud mají být vzorky přepravovány, musí být zabaleny a označeny dle platných státních a mezinárodních předpisů o přepravě vzorků a etiologických agens. 35 VYTVÁŘENÍ SMĚSÍ A PIPETOVÁNÍ VZORKŮ A. Systém cobas s 201 využívá pro veškeré pipetování a míchání vzorků pipetor Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD. Pipetor Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD provádí skenování čárových kódů a vytváření směsi ze vzorků a vytváří směsi. B. PDM software verze 3 nebo vyšší umožňuje kompletní instalaci systému cobas s 201 bez pipetoru Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD. V tomto případě je nutné ruční zadávání ID čárového kódu vzorku, stojanu SK24, ID čárového kódu umístění a ID čárového kódu S-klipu. Viz příručka obsluhy pro systém cobas s 201, kde najdete pokyny pro ruční zadávání těchto informací. C. Pokud jsou pomocí testu cobas TaqScreen DPX detekovány směsi reaktivní na HAV nebo mez pro B19, používá se pipetor Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD k pipetování z destiček s hlubokými jamkami nebo z původních zkumavek se vzorky pro vytvoření rozdělených směsí se vzorky pro další testování. POZNÁMKY K POSTUPU A. Vybavení 1. Připravte systém cobas s 201 k použití podle pokynů v příručce obsluhy pro systém cobas s 201. 2. Proveďte doporučenou údržbu přístroje k zajištění správné funkce. B. Činidla 1. 30 minut před použitím je nutné ponechat činidla pro test cobas TaqScreen DPX zahřát v zařízení COBAS AmpliPrep. Kontrolní souprava cobas TaqScreen DPX a promývací činidlo cobas TaqScreen musí mít před použitím pokojovou teplotu. Skladovací podmínky činidel viz oddíl Požadavky na skladování a manipulaci. 2. Každá souprava testu cobas TaqScreen DPX obsahuje dostatečné množství pro zpracování 96 testů, které se doporučuje provést v dávkách složených až z 24 testů na stojanu SK24. Jedna negativní kontrola a jedna z každé pozitivní kontroly musí být zpracovány u každé dávky vzorků nebo stojanu SK24. V testu cobas TaqScreen DPX se kontroly zpracovávají stejně jako vzorky. 3. Všechny kontroly jsou pouze na jedno použití. 4. Systém zabrání použití činidel z různých šarží, činidel, které přesáhly povolený počet hodin v přístroji, činidel, jejichž datum expirace vypršelo nebo smíšených kazet ze sady čtyř kazet na systému již dříve použitých. Neplňte různé šarže činidel do zařízení COBAS AmpliPrep. C. Zpracování vzorků 1. Zabraňte kontaminaci rukavic při manipulaci se vzorky a kontrolami. 2. Zvláště dbejte, aby nedošlo ke kontaminaci vzorků a negativních kontrol s pozitivními kontrolami. 11

NÁVOD K POUŽITÍ Systém cobas s 201 zahrnuje čtyři hlavní procesy: pipetování vzorků a kontrol na doplňkovém pipetoru Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD, příprava vzorků na zařízení COBAS AmpliPrep s použitím testu cobas TaqScreen DPX, amplifikace/detekce na analyzátoru COBAS TaqMan a řízení dat. Každá souprava testu cobas TaqScreen DPX obsahuje osm kazet: dvě kazety DPX CS1 s magnetickými skleněnými částicemi, dvě kazety DPX CS2 s lytickým činidlem, dvě kazety DPX CS3 s roztokem proteinázy a elučním pufrem a dvě kazety DPX CS4 s vnitřní kontrolou, činidlem Master Mix 1 a Master Mix 2. Tato souprava testu je určena k použití s kontrolní soupravou cobas TaqScreen DPX a promývacím činidlem cobas TaqScreen. Pozn.: Neotevírejte kazety. Pozn.: Nesměšujte dohromady činidla z různých šarží, ani z různých lahviček téže šarže. Pozn.: Nepoužívejte dohromady kazety z různých šarží v zařízení COBAS AmpliPrep. Pozn.: Neoddělujte kontrolní zkumavky od nástavců. Proveďte veškerou požadovanou údržbu dle popisu v příručce obsluhy pro systém cobas s 201. Podrobný popis použití naleznete v příručce obsluhy pro systém cobas s 201. A. Pipetování kontrol a vzorků pomocí pipetoru Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pozn.: Při manipulaci se vzorky a kontrolami zabraňte kontaminaci rukavic. Pozn.: Kontroly míchejte opatrným obrácením třikrát; nesmí přitom dojít k vytvoření bublin. 1. Proveďte spouštěcí procedury pipetoru Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD, poté spusťte průvodce tvorby směsi (poolingu) Roche PDM Pooling Wizard a postupujte dle pokynů na obrazovce. 2. Buďte opatrní, abyste nepoškodili identifikační čárový kód na zkumavkách se vzorky a nástavcích zkumavek s kontrolami. V případě poškození nebude systém schopen rozeznat vzorky nebo kontroly. 3. Otevřete zkumavky s kontrolami a zaveďte vzorky, spotřební materiál a kontroly do pipetoru Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD. Po zavedení vzorků, spotřebního materiálu a kontrol přístroj přenese kontroly a vzorky do S-zkumavek. 4. Po dokončení pipetování zkontrolujte výstrahy a vytiskněte zprávu(y) tvorby směsi. Zkontrolujte směsi a jamky destičky s hlubokými jamkami. Vyřaďte směsi, případně jamky, pokud je zjištěna kontaminace červenými krvinkami nebo pokud nejsou shodné objemy. 5. Uzavřete S-zkumavky a přeneste stojan(y) SK24 na zařízení COBAS AmpliPrep k extrakci nukleové kyseliny. Po přenesení do S-zkumavek jsou všechny virové cíle a kontroly stabilní v S-zkumavkách 6 hodin. 6. Uzavřete a uskladněte destičky s hlubokými jamkami (pokud byly destičky během pipetování vytvořeny). 7. Vyjměte a uskladněte dárcovské zkumavky. Podmínky skladování naleznete v kapitole Odběr, skladování a vytváření směsi vzorků. 8. Vyjměte a uskladněte kontrolní zkumavky. (Kontrolní zkumavky jsou pouze na jedno použití.) 9. Objednávky testů se automaticky vytvářejí a přenášejí do všech datových stanic AMPLILINK v síti. 12

B. Příprava a zavádění činidel testu cobas TaqScreen DPX Pozn.: Buďte opatrní, abyste nepoškodili štítky kazet. Čtečka čárových kódů zařízení COBAS AmpliPrep automaticky přečte štítek s čárovými kódy každé kazety při zavedení stojanů s činidly do přístroje. 1. Před zpracováním prvního vzorku ponechte činidla v zařízení COBAS AmpliPrep ohřát na teplotu okolí po dobu 30 minut. Žádná další příprava činidel není zapotřebí. 2. Před spuštěním zařízení musí být do přístroje zaveden dostatečný počet všech kazet ke zpracování celého počtu vzorků, které budou na zařízení COBAS AmpliPrep zpracovány bez přestávky. Každá kazeta obsahuje dostatečné množství činidel pro provedení 48 testů. Informace o zavádění činidel pro nepřetržitý chod naleznete v příručce obsluhy pro systém cobas s 201. 3. Umístěte kazetu DPX CS1 do stojanu na činidla a ujistěte se, že je čárový kód kazety vyrovnán s čárovým kódem umístěným na pravé straně stojanu. Kazety DPX CS1 musí být společně naplněny na samostatném stojanu na činidla odděleně od ostatních kazet. 4. Zaveďte stojan na činidla obsahující DPX CS1 do polohy pro stojany A, a posuňte jej až k zarážce zařízení COBAS AmpliPrep, poté před zasunutím stojanu do konečné polohy na zadní strany přístroje vyčkejte, než se rozsvítí zelená LED kontrolka stojanů. Nezavádějte do přístroje různé šarže činidel. 5. Umístěte jednu sadu kazet DPX CS2, DPX CS3 a DPX CS4 pro každou kazetu DPX CS1 do stojanu(ů) na činidla a ujistěte se, že jsou čárové kódy vyrovnány s čárovým kódem stojanu umístěným na jeho pravé straně. 6. Zaveďte stojan(y) na činidla do polohy pro stojany B, C, D nebo E, a posuňte jej až k zarážce zařízení COBAS AmpliPrep, poté před zasunutím stojanu do konečné polohy na zadní straně přístroje vyčkejte, než se rozsvítí zelená LED kontrolka stojanů. 7. LED kontrolky na stavové liště zařízení COBAS AmpliPrep se rozsvítí zeleně po zavedení a rozpoznání všech požadovaných součástí sady. C. Extrakce nukleových kyselin z pipetovaných vzorků a kontrol Pozn.: Proveďte následující kroky na čisté pracovní ploše. 1. Odstraňte obal ze svazku jednotky na zpracování vzorků (SPU). Nedotýkejte se pásky a plastového krytu. 2. Jednotky na zpracování vzorků (SPU) otočte tak, abyste viděli velký štítek, a svazek SPU zarovnejte do krajní pravé polohy na stojanu SPU. 3. Odstraňte pásku a plastový kryt z SPU umístěné ve stojanu. Ujistěte se, že jsou všechny SPU ve stojanu zatlačeny dolů, vyrovnány a dobře usazeny. Vyčnívající SPU mohou způsobit poruchu přístroje. Netlačte na S-špičku v SPU. 4. Posuňte naplněné stojany SPU do umístění pro stojany zařízení COBAS AmpliPrep J, K nebo L, dokud nebude stojan úplně zasunut a rozpoznán přístrojem. Do zařízení lze najednou umístit až 72 SPU. Umístěte potřebný počet SPU pro provedení cyklu testu nebo více, dle potřeby. 5. Odstraňte celofánový obal z výrobcem plněných stojanů na K-zkumavky a K-špičky. Buďte opatrní, abyste stojany nepřeklopili. Ujistěte se, že jsou všechny dobře usazeny. 6. Zasuňte alespoň požadovaný počet stojanů na K-zkumavky a K-špičky do zařízení COBAS AmpliPrep na pozice M, N, O nebo P. 7. Vložte stojany SK24 se vzorky napipetovanými pipetorem Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD a kontroly do zařízení COBAS AmpliPrep na pozice F, G nebo H. Zasuňte je, až se stojan uzamkne. Zkontrolujte stavové okno systému Sample, abyste se přesvědčili, že byly rozpoznány všechny vzorky na každém stojanu. 8. Zkontrolujte software AMPLILINK a přesvědčte se, že bylo pro přípravu vzorků zavedeno dostatečné množství činidel a spotřebního materiálu. 13

9. Pro spuštění přípravy vzorků na zařízení COBAS AmpliPrep stiskněte klávesu Start na pracovní stanici softwaru AMPLILINK. 10. Případné nepoužité K-špičky a K-zkumavky zůstanou zavřené v zařízení COBAS AmpliPrep pro použití v dalším cyklu. D. Amplifikace a detekce 1. Přeneste stojan SK24 obsahující zpracované vzorky do analyzátoru COBAS TaqMan. Úplně naplněný stojan SK24 musí být přenesen do 1 hodiny po dokončení přípravy vzorků na daném stojanu. Analyzátor COBAS TaqMan automaticky zahájí amplifikaci a detekci. Dávka kompletně naplněného stojanu, která není přenesena do 1 hodiny, bude neplatná. Částečně naplněné stojany SK24, které nejsou přeneseny do 1 hodiny, mohu poskytnout platnou dávku. Software AMPLILINK sleduje povolený čas mezi přidáním činidla Master Mix a zahájením amplifikace/detekce každého vzorku a označí celý stojan za neplatný, jestliže první zpracovaný vzorek překročí tento časový limit. 2. Jakmile analyzátor COBAS TaqMan dokončí amplifikaci a detekci, budou analyzované vzorky automaticky odstraněny do odpadní nádoby. 3. Výsledky jsou automaticky přijaty a přeneseny do softwaru PDM. E. Prohlížení a vydávání výsledků 1. Spusťte pracovní stanici Roche PDM. 2. Vyhledejte nevyhodnocené dávky pomocí záložky Review Batches v Data Manageru pracovní stanice. 3. Prohlédněte výstrahy označením dávky a poté kliknutím myší na tlačítko Next. 4. Prohlédněte kontrolní výsledky na záložce Controls Review. Kritéria platnosti kontrol viz kapitola Kontrola kvality. 5. Prohlédněte výsledky směsi na záložce Alarms Review pro zvolenou dávku. V případě potřeby může uživatel směsi s výsledky nereaktivní na HAV a < mez u B19 ručně zneplatnit. U vzorků od dárců v neplatné směsi musí být proveden opakovaný test. 6. Prohlédněte a vydejte výsledky dárců na záložce Donor Review pro zvolenou dávku. 7. Vytiskněte zprávy a zašlete je do Laboratorního informačního systému (LIS) (dle potřeby). KONTROLA KVALITY 1. S každou dávkou se musí zpracovat jedna negativní kontrola (DPX ( ) C) a jedna z každých dvou pozitivních kontrol (DPX D(+)C a DPX H(+)C). 2. Stav dávky: Pokud jsou kontroly dávky platné, je stavu dávky přiděleno označení Complete, Valid. Pokud je jakákoli kontrola v rámci dávky neplatná, je celá dávka neplatná. Neplatnost výsledků na základě neúspěšné kontroly automaticky provádí software PDM. a. Negativní kontrola Validita negativní kontroly je ověřena podle provedeného testu. Test DPX (HAV a B19): Aby byla negativní kontrola (DPX ( ) C) platná, musí být interpretovaný výsledek pro HAV i parvovirus B19 nereaktivní a asociovaná vnitřní kontrola (IC) a QS musí být platné. Pokud jsou interpretované výsledky negativní kontroly neplatné, je neplatná celá dávka a test musí být zopakován. Pouze test B19: Aby byla negativní kontrola (DPX ( ) C) platná, musí být interpretovaný výsledek pro parvovirus B19 nereaktivní a asociovaný QS musí být platný. Pokud jsou interpretované výsledky negativní kontroly neplatné, je neplatná celá dávka a test musí být zopakován. b. Duální pozitivní kontrola DPX Platnost duální pozitivní kontroly DPX je ověřena podle provedeného testu. Test DPX (HAV a B19): Aby byla duální pozitivní kontrola (DPX D(+)C) platná, musí být interpretovaný výsledek pro HAV reaktivní a koncentrace parvoviru B19 musí být mezi 1,21 x 10 2 a 1,21 x 10 3 IU/ml, a asociovaná vnitřní kontrola (IC) a QS musí být platné. 14

Pokud je interpretovaný výsledek pro HAV neplatný nebo je koncentrace parvoviru B19 mimo akceptovatelný rozsah, je neplatná celá dávka a test se musí opakovat. Pouze test B19: Aby byla duální pozitivní kontrola (DPX D(+)C) platná, musí být interpretovaný výsledek koncentrace parvoviru B19 mezi 1,21 x 10 2 a 1,21 x 10 3 IU/ml, a asociovaný QS musí být platný. Pokud je interpretovaný výsledek koncentrace parvoviru B19 mimo akceptovatelný rozsah, je neplatná celá dávka a test se musí opakovat. c. Vysoce pozitivní kontrola DPX Aby byla vysoce pozitivní kontrola DPX (DPX H(+)C) platná, musí být koncentrace parvoviru B19 mezi 2,43 x 10 5 a 2,42 x 10 6 IU/ml, a asociovaný QS musí být platný. Pokud je interpretovaný výsledek koncentrace parvoviru B19 mimo akceptovatelný rozsah, je neplatná celá dávka a test se musí opakovat. 3. Vnitřní kontroly (IC) pro vzorky dárců a. Aby měly vzorků dárců platný nereaktivní ( ) výsledek testu na HAV, musí být platná asociovaná vnitřní kontrola; v opačném případě je nereaktivní výsledek neplatný a vzorek dárce musí být znovu testován. b. Platný HAV reaktivní výsledek testu vzorku dárce může mít tedy platný nebo neplatný asociovaný výsledek IC. 4. Kvantifikační standard (QS) pro vzorky dárců a. Aby měly vzorků dárců platný výsledek testu parvoviru B19, musí být platný asociovaný kvantifikační standard; v opačném případě je výsledek neplatný a vzorek dárce musí být znovu testován. VÝSLEDKY 1. Výsledky vzorků jsou platné pouze pokud je platná celá dávka, která je obsahuje. Akceptační kritéria viz kapitola Kontrola kvality. U každého vzorku jsou měřeny čtyři parametry, jeden pro cílový virus HAV, jeden pro cílový virus B19, jeden pro IC a jeden pro QS. Pouze u testu B19: U každého vzorku jsou měřeny jen dva parametry, jeden pro cílový virus B19 a druhý pro QS. 2. Konečné výsledky testů jsou nereaktivní, reaktivní nebo neplatné pro cíl HAV a < mezní hodnota, mezní hodnota, nebo neplatné pro cíl B19. 3. Konečný stav dárce je v testu cobas TaqScreen DPX vykázán v softwaru PDM takto: Konečný stav dárce Completed Accepted Completed Unresolved Accepted Unresolved Popis Pro každý cíl byl stanoven konečný výsledek. Dokončený dárce byl přijat. Doba životnosti vzorku dárce vypršela před přijetím dárce. Dokončený nevyřešený dárce byl přijat. Opakovaný test pro jednotlivý vzorek Zkumavky se vzorky dárců s konečným výsledkem invalid pro jeden cíl vyžadují opakované testování bez ohledu na konečný výsledek druhého cíle. Uživatel má však možnost výběru tlačítka Force Unresolve, aby mohl dokončit pracovní postup pro daného dárce. Funkce Force Unresolve přiřadí dárci stav Accepted Unresolved u vzorků dárců, které nemají konečný výsledek reaktivní na HAV nebo mez pro B19, nebo přiřadí stav Accepted vzorkům dárců s reaktivním výsledkem na HAV nebo mez pro B19. 15

Test sekundární směsi Zkumavky dárců ve směsi s více vzorky s konečným výsledkem neplatným pro jeden cíl vyžadují opakované testování, jestliže konečný výsledek pro druhý cíl je nereaktivní nebo neplatný pro HAV, nebo < mezní hodnota nebo neplatný pro B19. Jestliže je směs s více vzorky označena za reaktivní na HAV, nebo mezní hodnota pro B19, systém cobas s 201 přiřadí ke všem dárcům v této směsi požadavek na tvorbu směsi za účelem testování sekundární směsi. Tyto vzorky dárců se napipetují pomocí pipetoru Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD (buď z destiček s hlubokými jamkami nebo z původních zkumavek se vzorky dárců) v rozdělených směsích se vzorky od méně dárců nebo jednoho dárce a dále se testují pomocí testu cobas TaqScreen DPX jako součást rozlišovacího procesu, který má určit reaktivní HAV nebo B19 mezní hodnota jednotlivých vzorků dárců. Informace o rozlišovacích testech naleznete v příručce obsluhy pro systém cobas s 201. Směs s více vzorky je po tomto dílčím rozdělení vykázána jako nereaktivní na HAV a < mezní hodnota pro B19, jednotlivé vzorky jsou označeny jako Completed s konečným výsledkem HAV Non-Reactive a B19 < mezní hodnota. Pozn.: Jako součást programu zabezpečení kvality může uživatel chtít provést dodatečné testování pro stanovení příčiny prvotní reaktivity vzorku. PROCEDURÁLNÍ OMEZENÍ 1. Tento test byl vyhodnocen pouze pro použití v kombinaci se sadou testu cobas TaqScreen DPX, kontrolní sadou cobas TaqScreen DPX, promývacím činidlem cobas TaqScreen a systémem cobas s 201. 2. Prokázalo se, že Heparin inhibuje PCR. U této procedury nepoužívejte heparinizovanou plazmu. 3. Důvěryhodnost výsledků závisí na správném odběru vzorků a správném způsoby přepravy vzorků. 4. Pro automatizovanou přípravu směsí plazmy pro test cobas TaqScreen DPX byl schválen pouze pipetor Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD. Řiďte se pokyny pro technické vybavení a dodržujte bezpečnostní opatření v příručce obsluhy pro systém cobas s 201 a uživatelské příručce k pipetoru Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD. 5. Detekce RNA HAV a kvantifikace DNA parvoviru B19 závisí na tom, kolik virových částic je ve vzorku přítomno, na což mají vliv metody odběru vzorku, stav pacienta (např. věk, symptomy) a/nebo stádium infekce a velikost směsi. 6. Ve vzácných případech u mutací ve vysoce chráněných oblastech genomu viru pokrytých primery a/nebo sondami testu cobas TaqScreen DPX nemusí dojít k detekci viru HAV nebo správné kvantifikaci parvoviru B19. 7. Vzhledem k rozdílům mezi technologiemi se doporučuje, aby uživatelé před přechodem od jedné technologie k druhé provedli ve své laboratoři studie pro stanovení rozdílů mezi těmito technologiemi. Uživatelé by měli dodržovat své vlastní zásady/postupy. FUNKČNÍ CHARAKTERISTIKY Reprodukovatelnost Reprodukovatelnost testu cobas TaqScreen DPX byla pro HAV stanovena testováním panelu složeného z 8 vzorků skládajících se z negativního vzorku plazmy a 7 HAV pozitivních vzorků plazmy v koncentracích 0,35, 0,5, 0,71, 1, 1,41, 2,5 a 3,75 IU/ml. Testování bylo provedeno pomocí 3 šarží testu cobas TaqScreen DPX během dvou dnů se 6 sadami zařízení a 9 pracovníky obsluhy. Veškeré platné údaje byly vyhodnoceny výpočtem procentního podílu výsledku reaktivních testů u každé položky panelu. Údaje byly analyzovány dle data cyklu a šarže sady. Tato studie prokázala stálou účinnost testu cobas TaqScreen DPX ve všech šaržích sad (tabulka 1) a v různých dnech (tabulka 2). 16

Tabulka 1 Reprodukovatelnost mezi šaržemi Koncentrace HAV Reaktivní výsledky podle šarže činidel (IU/ml) Šarže 1 Šarže 2 Šarže 3 3,75 100,0% (63/63) 100,0% (63/63) 100,0% (63/63) 2,50 100,0% (63/63) 100,0% (63/63) 100,0% (62/62) 1,41 100,0% (62/62) 100,0% (63/63) 96,8% (61/63) 1,00 93,7% (59/63) 90,5% (57/63) 95,2% (60/63) 0,71 85,7% (54/63) 90,5% (57/63) 81,0% (51/63) 0,50 74,6% (47/63) 74,6% (47/63) 76,2% (48/63) 0,35 63,5% (40/63) 69,8% (44/63) 69,8% (44/63) 0,00 0,0% (0/63) 0,0% (0/63) 0,0% (0/63) Tabulka 2 Reprodukovatelnost mezi jednotlivými dny Reaktivní výsledky podle dne Koncentrace HAV (IU/ml) Den 1 Den 2 3,75 100,0% (63/63) 100,0% (126/126) 2,50 100,0% (63/63) 100,0% (125/125) 1,41 100,0% (62/62) 98,4% (124/126) 1,00 93,7% (59/63) 92,9% (117/126) 0,71 85,7% (54/63) 85,7% (108/126) 0,50 74,6% (47/63) 75,4% (95/126) 0,35 63,5% (40/63) 69,8% (88/126) 0,00 0,0% (0/63) 0,0% (0/126) Přesnost kvantifikace parvoviru B19 Přesnost testu cobas TaqScreen DPX byla stanovena pro parvovirus B19 testováním 4členného panelu složeného z pozitivních vzorků plazmy s koncentracemi parvoviru B19 10 3, 10 4, 10 5 a 10 6 IU/ml. Veškeré platné údaje byly vyhodnoceny výpočtem směrodatné odchylky titrů parvoviru B19 (log 10 IU/ml) pro každý člen panelu. Údaje ze dvou šarží sad byly analyzovány zvlášť i společně. Tato studie prokázala stálou účinnost testu cobas TaqScreen DPX ve všech šaržích sad (tabulka 3). Tabulka 3 Směrodatná odchylka titrů parvoviru B19, log 10 IU/ml (n = 20), s různými šaržemi sad Členové panelu B19 Šarže činidla 1 Šarže činidla 2 Společně šarže 1 a 2 (IU/ml) 10 6 0,073 0,103 0,088 10 5 0,051 0,083 0,070 10 4 0,071 0,071 0,070 10 3 0,218 0,112 0,176 U všech (10 3-10 6 ) 0,123 0,094 0,110 17

Analytická citlivost mezinárodní standard WHO 95% detekční hranice (LOD) testu cobas TaqScreen DPX pro RNA HAV i DNA parvoviru B19 byly stanoveny pomocí mezinárodního standardu WHO pro HAV (kód NIBSC 00/560) 36 a pro parvovirus B19 (kód NIBSC 99/800) 27. Byly připraveny tři nezávislé řady ředění každého virového standardu s normální virově negativní lidskou plazmou. Každá řada ředění byla testována pomocí tří různých šarží sady testu cobas TaqScreen DPX s 21 replikáty na šarži, celkem 189 replikátů na jednu koncentraci. V tabulkách 4 a 5 jsou uvedeny analýzy reaktivních hladin pro HAV a B19. Tabulka 4 Shrnutí reaktivních hladin HAV mezinárodního standardu dle WHO (00/560) Koncentrace RNA HAV (IU/ml) Počet reaktivních Počet samostatných testů % reaktivních Dolní mez spolehlivosti 95% (jednostranná) 3,75 189 189 100,0% 98,1% 2,50 188 188 100,0% 98,1% 1,41 186 188 98,9% 96,2% 1,00 176 189 93,1% 88,5% 0,71 162 189 85,7% 79,9% 0,50 142 189 75,1% 68,3% 0,35 128 189 67,7% 60,6% 0,00 0 189 0,0% 0,0% Koncentrace DNA B19 (IU/ml) Tabulka 5 Shrnutí reaktivních hladin B19 mezinárodního standardu dle WHO (99/800) Počet reaktivních Počet samostatných testů % reaktivních Dolní mez spolehlivosti 95% (jednostranná) 75,00 189 189 100,0% 98,1% 50,00 188 188 100,0% 98,1% 28,28 189 189 100,0% 98,1% 20,00 187 189 98,9% 96,2% 14,14 189 189 100,0% 98,1% 10,00 170 189 89,9% 84,7% 7,07 142 189 75,1% 68,3% 0,00 0 189 0,0% 0,0% Pro stanovení 95% detekční hranice (LOD) a dvoustranných 95% základních intervalů spolehlivosti (Tabulka 6) byla použita analýza PROBIT u kombinovaných dat ze všech testovaných replikátů každého viru. Tabulka 6 95% LOD pomocí analýzy PROBIT Virus LOD (IU/ml) 95% dolní mez spol.* 95% horní mez spol. HAV 1,06 0,94 1,24 Parvovirus B19 11,48 10,56 12,91 * mez spol.: mez spolehlivosti 18

Linearita kvantifikace parvoviru B19 Linearita kvantifikace parvoviru B19 testu cobas TaqScreen DPX byla stanovena testováním sériového ředění vzorku genotypu 1 parvoviru B19, který byl kalibrován podle WHO Standardu (99/800). Studie byla provedena se 2 šaržemi činidel. Lineární rozsah byl stanoven mezi 75 a 3,0 x 10 8 IU/ml na základě pokynů CLSI EP6-A (obrázek 1). Obrázek 1 Linearita testu cobas TaqScreen DPX pro parvovirus B19 Výsledky testu (Log 10 IU/ml) 8 7 6 5 y = 1,060x - 0,442 4 R 2 = 0,996 3 2 1 1 2 3 4 5 6 7 8 Nominální koncentrace parvoviru B19 (Log 10 IU/ml) Linearita kvantifikace parvoviru B19 podle genotypu Linearita testu cobas TaqScreen DPX byla testována pro každý genotyp B19 pomocí 5 až 6 ředění klinického vzorku každého genotypu parvoviru B19. S jednou šarží činidla bylo zpracováno 4 a 6 replikátů pro každý vzorek a diluční bod (tabulka 7). Tabulka 7 Kvantifikace genotypu parvoviru B19 Genotyp 1 2 3a Průměrná Vstupní koncentrace B19 získaná koncentrace B19 IU/ml log 10 IU/ml log 10 IU/ml Průměrný rozdíl: log 10 získaná B19 - log 10 vstupní B19 5 x 10 2 2,70 2,49-0,21 1 x 10 4 4,00 3,94-0,08 1 x 10 5 5,00 4,77-0,23 1 x 10 6 6,00 5,73-0,27 1 x 10 7 7,00 6,84-0,16 5 x 10 2 2,70 3,00 0,30 1 x 10 4 4,00 4,14 0,14 1 x 10 5 5,00 4,96-0,04 3 x 10 5 5,48 5,32-0,16 1 x 10 6 6,00 5,72-0,28 1 x 10 7 7,00 6,44-0,56 5 x 10 2 2,70 3,04 0,34 1 x 10 4 4,00 4,24 0,24 1 x 10 5 5,00 5,03 0,03 3 x 10 5 5,48 5,44-0,04 1 x 10 6 6,00 5,83-0,17 1 x 10 7 7,00 6,53-0,47 19

Genotypová inkluzivita Účinnost testu cobas TaqScreen DPX byla stanovena pro různé genotypy HAV a parvoviru B19. HAV Byly testovány klinické vzorky a RNA transkripty různých genotypů HAV naředěné přibližně na 0,3X, 1X a 3X hranici detekce (LOD) testu cobas TaqScreen DPX. Analýza PROBIT výsledků ukázala, že LOD pro každý vzorek genotypu byl ekvivalentní LOD WHO Standardu (00/560) (tabulka 8). Tabulka 8 Inkluzivita genotypu HAV Reaktivní hladina Reaktivní hladina Reaktivní hladina Genotyp LOD (95% int. spol.) IU/ml při 0,3 x LOD při 1 x LOD při 3 x LOD IA 65,8% (158/240) 96,3% (231/240) 100,0% (240/240) 0,92 (0,77 1,18) IB 41,7% (30/72) 86,1% (62/72) 100,0% (72/72) 1,58 (1,18 2,51) IIA 79,2% (19/24) 91,7% (22/24) 100,0% (24/24) 1,18 (0,61 257) IIB 79,2% (19/24) 100,0% (24/24) 100,0% (24/24) 0,37 (není k dispozici*) IIIA 73,6% (53/72) 97,2% (70/72) 100,0% (72/72) 0,80 (0,59 1,56) IIIB 43,8% (21/48) 91,7% (44/48) 100,0% (48/48) 1,25 (0,91 2,27) Bylo použito jedenáct klinických vzorků (10 genotypu IA, 1 genotypu IB) a 9 transkriptů (2 genotypu IB, 1 genotypu IIA, 1 genotypu IIB, 3 genotypu IIIA a 2 genotypu IIIB). * Intervaly spolehlivosti analýzy PROBIT nebylo možné generovat. Parvovirus B19 Byly testovány klinické vzorky a plazmidy různých genotypů parvoviru B19 naředěné přibližně na 0,3X, 1X a 3X hranici detekce (LOD) testu cobas TaqScreen DPX. Analýza PROBIT výsledků ukázala, že LOD pro každý vzorek genotypu byl ekvivalentní nebo lepší než LOD pro WHO Standard (99/800) (tabulka 9). Tabulka 9 Inkluzivita genotypu parvoviru B19 Genotyp Reaktivní hladina při 0,3 x LOD Reaktivní hladina při 1 x LOD Reaktivní hladina při 3 x LOD LOD (95% int. spol.) IU/ml 1 15,6% (15/96) 90,6% (87/96) 100,0% (97/97) 13,57 (11,39 17,27) 2 88,5% (85/96) 100,0% (96/96) 99,0% (95/96) 6,07 (není k dispozici*) 3A 83,3% (40/48) 100,0% (48/48) 100,0% (48/48) 3,94 (není k dispozici*) 3B 91,7% (44/48) 97,9% (47/48) 100,0% (48/48) 5,31 (není k dispozici*) Byly použity tři klinické vzorky (genotypy 1A, 3A a 3B) a 2 plazmidy (genotyp 2). * Intervaly spolehlivosti analýzy PROBIT nebylo možné generovat. Potenciálně křížově reaktivní a interferující mikroorganizmy Potenciální křížová reaktivita a interference jiných mikroorganizmů s testem cobas TaqScreen DPX byla vyhodnocena pomocí panelového testování 19 mikroorganizmů, včetně 13 virových izolátů, 5 bakteriálních kmenů a 1 kvasinkového izolátu (tabulka 10). Mikroorganizmy byly přidány do normální lidské plazmy a testovány s a bez HAV v koncentraci 3X detekční hranice testu a s parvovirem B19 v koncentraci 5X spodní meze kvantifikace testu cobas TaqScreen DPX. Nereaktivní výsledky byly získány pomocí testu cobas TaqScreen DPX u všech vzorků mikroorganizmů bez HAV a parvoviru B19. Testované mikroorganizmy s testem cobas TaqScreen DPX nevytvářely křížovou reakci. Reaktivní výsledky byly získány u všech vzorků mikroorganizmů s HAV a parvovirem B19. Testované mikroorganizmy neovlivňovaly test cobas TaqScreen DPX. 20