ELISA-VIDITEST anti-ea (D) EBV IgA

ELISA-VIDITEST anti-ea (D) EBV IgA OD-254 Návod k použití soupravy VÝROBCE: VIDIA spol. s r.o., Nad Safinou II č. 365, Vestec, 252 42 Jesenice, tel.: +420 261 090 565, www.vidia.cz 1. NÁZEV SOUPRAVY: ELISA-VIDITEST anti-ea (D) EBV IgA ELISA souprava pro detekci protilátek třídy IgA proti difúzní složce časného antigenu (EA(D)) viru Epsteina a Barrové (EBV) v lidském séru. 2. POUŽITÍ: Souprava je určena pro laboratorní diagnostiku aktivní infekce EBV a chorob s ní souvisejících (např. infekční mononukleoza, lymfoproliferativní onemocnění u pacientů s poruchami imunity, nasopharyngeální karcinom) a pro sledování prognózy EBV- pozitivního nasopharyngeálního karcinomu (NPC). Je doplňkovým testem pro základní sérologické vyšetření EBV. 3. PRINCIP TESTU: ELISA-VIDITEST anti-ea (D) EBV IgA je imunoanalytický test na pevné fázi. Na povrch jamek je navázán rekombinantí antigen odvozený od D- složky EA EBV. Jsou-li v testovaných sérech přítomny příslušné protilátky, navážou se na imobilizovaný antigen. Navázané protilátky pak v dalším kroku reagují s protilátkami proti lidskému IgA značenými křenovou peroxidázou. Množství navázaných značených protilátek se stanoví barevnou enzymatickou reakcí. Negativní séra nereagují, mírná změna v zabarvení jamek je pozadím reakce. 4. OBSAH SOUPRAVY: ELISA odlamovací stripy v manipulačním rámečku potažené specifickým antigenem STRIPS Ag 1 x 12 ks 1,3 ml kalibrátoru r.t.u. 1) CAL 1 lahvička 1,3 ml pozitivního kontrolního séra r.t.u. CTRL + 1 lahvička 1,3 ml negativního kontrolního séra r.t.u. CTRL - 1 lahvička 13 ml protilátek proti lidskému IgA značených peroxidázou (konjugát anti-iga Px) r.t.u. CONJ 1 lahvička 55 ml promývacího roztoku 10x konc. WASH 10x 1 lahvička 60 ml ředicího roztoku r.t.u. DIL 1 lahvička 13 ml chromogensubstrátového roztoku TMB r.t.u. TMB 1 lahvička 13 ml stop roztoku r.t.u. STOP 1 lahvička Sáček se zipem Návod k použití soupravy Certifikát kontroly kvality 1) r.t.u., ready to use (v pracovní koncentraci) Chromogensubstrátový roztok TMB r.t.u. je zaměnitelný pouze mezi soupravami ELISA-VIDITEST, které obsahují TMB, a NENÍ VZÁJEMNĚ ZAMĚNITELNÝ s ostatními roztoky TMB použitými v jiných soupravách ELISA-VIDITEST TMB-O, TMB-BF. 1

5. POTŘEBNÝ MATERIÁL NEDODÁVANÝ SE SOUPRAVOU: Destilovaná/deionizovaná voda pro ředění promývacího roztoku, pipetovací zařízení, zařízení pro rozplňování roztoků a promývání stripů, spektrofotometr/kolorimetr pro měření absorbance mikrotitrační destičky při 450 nm. (Referenční filtr 620-690 nm není podmínkou). 6. PŘÍPRAVA REAGENCIÍ: a. Vytemperujte všechny složky soupravy na laboratorní teplotu. b. Těsně před vyšetřením důkladně zamíchejte vzorky vyšetřovaných sér, kalibrátor, kontrolní séra a konjugát. Testovaná séra řeďte 101x ředicím roztokem (např. 5L séra + 500 L ředicího roztoku plus). Kontrolní séra a kalibrátor neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u., ready to use). c. Připravte si pracovní koncentraci promývacího roztoku jeho naředěním 10x ve vhodném objemu destilované/deionizované vody (např. 50 ml promývacího roztoku + 450 ml H 2O). Pokud jsou v koncentrovaném roztoku krystaly soli, zahřejte ho na vodní lázni na 32 až 37 o C a před naředěním dobře promíchejte. Nespotřebovaný promývací roztok v pracovní koncentraci lze skladovat 1 týden při teplotě 2 až 10 o C. d. Konjugát anti-iga Px, chromogensubstrátový roztok TMB a stop roztok neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u.). 7. PRACOVNÍ POSTUP: a. Stripy, vakuově zatavené s desikantem, nechte před otevřením sáčku vytemperovat na laboratorní teplotu, aby nedošlo k orosení destičky. Připravte si potřebný počet stripů pro reakci. Nepoužité stripy společně s desikantem dobře uzavřete do sáčku se zipem nebo vakuově zatavte. b. Naplňte příslušné jamky po 100 L kontrolních sér a ředěných testovaných sér následujícím způsobem: První jamku naplňte ředicím roztokem plus pro stanovení pozadí reakce DIL. Další dvě jamky naplňte Kalibrátorem CAL a jednu jamku naplňte negativním kontrolním sérem CTRL-. Zbývající jamky naplňte ředěnými testovanými séry (S1, S2, S3, ) - viz Schéma aplikace vzorků. Pro kontrolu je vhodné aplikovat také pozitivní kontrolní sérum CTRL+. Každé sérum stačí aplikovat na jednu jamku. Pokud chcete vyloučit případnou laboratorní chybu, aplikujte Kalibrátor CAL na tři jamky, vyšetřovaná a kontrolní séra aplikujte po dvou jamkách. Inkubujte 60 minut (+/-5 min) při laboratorní teplotě. c. Odsajte obsah jamek do pojistné sběrné láhve obsahující vhodný dezinfekční prostředek (viz Bezpečnostní předpisy). Jamky poté 4x promyjte 250 L promývacího roztoku. Vyvarujte se přetékání roztoku ven z jamek. Obsah jamek odsajte a destičku vyklepněte na přířez buničité vaty. d. Napipetujte do jamek po 100 L konjugátu anti-iga Px r.t.u. CONJ. Inkubujte 60 minut (+/- 5 min) při laboratorní teplotě. e. Tekutinu z jamek odsajte a promyjte je 4x 250 L promývacího roztoku (viz bod c). Odsajte a vyklepněte. f. Napipetujte do jamek po 100 L chromogensubstrátového roztoku TMB. Inkubujte 10 minut (+/- 30 sec.) při laboratorní teplotě. Dobu inkubace začněte měřit po napipetování 1. stripu destičky. Dodržujte toto pravidlo, vyvarujete se tak nedodržení časového intervalu. Pipetujte rychle v pravidelném rytmu, případně použijte vhodný dispenzor. Překryjte stripy alobalem, neprůhledným víčkem, nebo je po dobu reakce uložte na temné místo. g. Zastavte reakci přidáním 100 L stop roztoku STOP. Pipetujte ve stejném rytmu jako při rozplňování chromogensubstrátového roztoku, aby enzymatická reakce probíhala ve všech jamkách po stejnou dobu. Zkontrolujte, zda nejsou v jamkách bubliny, pokud ano, jemným poklepem na rámeček destičky je odstraňte. h. Intenzitu barevné reakce změřte na spektrofotometru/kolorimetru při 450 nm nejpozději do 10 minut po zastavení reakce. Doporučujeme použít referenční filtr 620-690 nm. 2

Schéma aplikace vzorků: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 a DIL S5 b CAL S c d e f g h CAL CTRL- S1 S2 S3 S4 8. HODNOCENÍ TESTU: Nejdříve odečtěte absorbanci jamky se samotným ředicím roztokem DIL (DIL = pozadí reakce) od hodnot kalibrátoru, kontrolních a testovaných sér. 8.1. Kvalitativní orientační hodnocení 1. Spočítejte průměrnou hodnotu OD kalibrátoru CAL. Pokud aplikujete kalibrátor na tři jamky a některá z těchto hodnot se liší o více než 20% od průměru, nepoužívejte ji k výpočtu a spočítejte průměr ze zbývajících dvou hodnot. 2. Stanovte cut-off hodnotu tak, že průměrnou hodnotu OD kalibrátoru vynásobíte korekčním faktorem. Hodnota korekčního faktoru je uvedena v certifikátu kontroly kvality pro danou šarži soupravy. 3. Séra s hodnotou OD < 90% cut-off jsou negativní a séra s hodnotou OD > 110% cut-off jsou považována za pozitivní. 8.2. Semikvantitativní hodnocení Stanovte hodnotu indexu pro jednotlivé vzorky sér : 1. Nejdříve stanovte cut-off hodnotu jako v předešlém způsobu hodnocení (čl. 8.1., bod 2). 2. Stanovte hodnotu indexu pro jednotlivé vzorky sér tak, že vydělíte OD testovaného séra cut-off hodnotou. 3. Odečtěte v tabulce (viz HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ) odpovídající stupeň reaktivity séra. HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ : Hodnota indexu Vyhodnocení < 0,90 Negativní 0,90-1,10 +/- 1,11-2,00 + 2,01-3,00 ++ > 3,00 +++ Příklad: Získaná OD Kalibrátoru = 1,101; 1,117 Průměrná hodnota OD Kalibrátoru = 1,109 OD vzorku séra = 0,800 Korekční faktor Kalibrátoru = 0,42 Cut-off hodnota = 1,109 x 0,42 = 0,466 Hodnota indexu = 0,800 / 0,466 = 1,72 Pozn.: Hodnocení +/- znamená, že sérum leží v rozmezí šedé zóny. V případě tohoto výsledku test opakujte. Leží-li sérum po opakovaném testování opět v rozmezí šedé zóny, opakujte testování alternativní metodou nebo použijte sérum odebrané od téhož jedince. 3

9. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ: IgA protilátky proti EA-D se tvoří jako odpověď na aktivní infekci EBV (primoinfekci i raktivaci). Vysoké hladiny těchto protilátek jsou nalézány u pacientů s EBV- pozitivním nasopharyngeálním karcinomem často s předstihem měsíců/let před rozvojem nádoru a mohou být použity pro hodnocení rizika rozvoje NPC u populací s vysokou prevalencí tohoto onemocnění. Hladina těchto protilátek se často zvyšuje v souvislosti s relapsem a rozvojem metastáz. Zvýšené hladiny těchto protilátek u imunodeficientních pacientů signalizují zvýšenou aktivitu EBV, která může být spojena s rizikem rozvoje lymfoproliferativního onemocnění. S nízkou prevalencí se tyto protilátky mohou vyskytovat i v běžné populaci, nebo u jiných infekčních či chronických onemocnění a autoimunitních chorob, jako důsledek bezpříznakové, či sekundární reaktivace EBV. Příklad - záchyt IgA protilátek proti EA(D) EBV: Panel sér Počet vyšetřených Počet pozitivních % Infekční mononukleózy 33 17 52% Reaktivace EBV (IgG anti EA(D) ++/+++) 24 14 58% Krevní dárci 72 0 EBV- séronegativní 23 0 IgA anti-cmv pozitivní 6 0 IgA anti- HSV pozitivní 7 0 Pro vyšetření protilátek proti dalším antigenům nabízí VIDIA tyto soupravy: ELISA-VIDITEST anti-ebna-1 EBV IgG a IgM; ELISA-VIDITEST anti-vca EBV IgG, IgM a IgA; ELISA-VIDITEST anti-ea (D) EBV IgG a IgM; IF-VIDITEST anti-vca EBV IgG a IgM; IF-VIDITEST anti-ea EBV (D+R nebo D) IgG 10. CHARAKTERISTIKY TESTU: 10.1. Platnost testu Hodnota absorbance ředicího roztoku (DIL = pozadí reakce) by měla být < 0,150. Hodnoty OD standardů/ kontrolních sér by měly být v rozmezích uvedených v Certifikátu kontroly kvality dané šarže. 10.2. Přesnost testu Pro stanovení variability mezi jednotlivými testy (interassay) a během testu (intraassay) bylo provedeno srovnání vzorků s různými hodnotami OD. 10.2.1. Opakovatelnost (intraassay) Variační koeficient opakovatelnosti je maximálně 5%. Je měřen pro každou šarži minimálně na 8 paralelních jamkách téže destičky. Příklad: (n = počet paralelních jamek na téže destičce) n A σ CV opak. 10 1,312 0,048 3,6 % 10.2.2. Reprodukovatelnost (interassay) Variační koeficient reprodukovatelnosti je maximálně 15%. Je měřen pro každou šarži porovnáním jamek téhož séra v několika po sobě jdoucích testech. Příklad: (n = počet testů určitého vzorku): n A σ min max CV opak. 9 1,117 0,087 0,994-1,154 7,7% 9 0,646 0,062 0,593-0,783 9,6 % 6 0,361 0,042 0,304-0,44 11,5% 4

10.2.3. Recovery test Naměřené hodnoty recovery se pohybují pro každou šarži v rozmezí 80 až 120% očekávané hodnoty. 10.3. Diagnostická citlivost a specifita testu Panel sér Anti-EA(D) EBV negativní Anti-EA(D) EBV pozitivní celkem vyšetřeno pozit. hranič. neg. Závěr 130 0 1 130 Specifita: 100% 32 31 1 0 Citlivost: 100% Diagnostická citlivost a specifita testu je 100%. (Hraniční vzorky byly při výpočtu vyloučeny) 10.4. Interference Hemolytické a lipemické vzorky nevykazují žádný vliv na výsledek testu minimálně do 50mg/mL pro hemoglobin, 5 mg/ml pro bilirubin a 50mg/mL pro triglyceridy. 11. BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY: Všechny složky soupravy jsou určeny pouze pro laboratorní účely. Lidská séra použitá v soupravě byla testována na nepřítomnost HBsAg, HCV a protilátek anti-hiv-1,2. Přesto s nimi nakládejte jako s infekčním materiálem a předměty, které s nimi přišly do styku, autoklávujte 1 hodinu při 121 C, nebo dezinfikujte minimálně 30 minut 3% roztokem chloraminu. Odpad vzniklý při promývání stripů dezinfikujte v odpadní nádobě pomocí vhodného dezinfekčního roztoku (např. Incidur, Incidin, chloramin,...) v koncentraci doporučené výrobcem. Tekuté odpady obsahující stop roztok (roztok kyseliny sírové) před likvidací neutralizujte 4% roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Se stop roztokem pracujte opatrně, aby nedošlo k potřísnění kůže nebo sliznice. Stane-li se tak, omyjte postižené místo větším množstvím tekoucí vody. Při práci nejezte, nepijte a nekuřte. Nepipetujte ústy, ale vhodnými pipetovacími zařízeními. Používejte ochranné rukavice a po práci si důkladně umyjte ruce. Dbejte, aby nedošlo k rozlití vzorků a k tvorbě aerosolu. 12. UPOZORNĚNÍ: a. Výrobce zaručuje použitelnost soupravy jako celku. b. Promývací roztok, chromogensubstrátový roztok TMB r.t.u., stop roztok r.t.u., ředicí roztok r.t.u. pro séra jsou vzájemně zaměnitelné mezi jednotlivými soupravami ELISA-VIDITEST, pokud není v návodu k použití soupravy uvedeno jinak. c. Pracujte asepticky, aby nedošlo k mikrobiální kontaminaci sér a reagencií. d. Při odebírání, ředění a skladování reagencií postupujte tak, aby nedošlo k jejich vzájemné kontaminaci či kontaminaci látkami inhibujícími enzymatickou aktivitu. e. Kalibrátor, kontrolní séra, ředicí roztok, chromogensubstrát. roztok TMB a Px konjugát jsou konzervovány ProClinem 300. f. Chromogensubstrátový roztok nesmí přijít do styku s oxidačními látkami a kovovými povrchy. g. Dodržujte přesně pokyny uvedené v návodu. Nereprodukovatelné výsledky mohou vzniknout zejména: * nedostatečným promícháním reagencií a vzorků před použitím * nepřesným pipetováním a nedodržováním času inkubací uvedených v bodě 7. * špatnou technikou promývání a potřísněním okrajů jamek vzorky nebo konjugátem * použitím stejné špičky při pipetování různých roztoků nebo záměnou uzávěrů 5

* kontaminací pipety, používané pro aplikaci vzorků, kontrol nebo chromogen-substrátového roztoku TMB, Px konjugátem (doporučujeme pro aplikaci konjugátu používat pipetu, vyhrazenou pouze pro tyto účely). 13. SKLADOVÁNÍ A EXPIRACE: a. Soupravu a její složky skladujte v suchu a temnu při teplotě +2 až +10 C v originálních obalech. Za těchto podmínek je expirační doba celé soupravy uvedena na centrálním štítku na obalu soupravy, expirace jednotlivých složek je uvedena na jejich obalu. b. Nespotřebované stripy vložte zpět do obalu a zatavte nebo dobře uzavřete do sáčku se zipem společně s desikantem. Soupravy se přepravují chlazené v termotaškách, doba přepravy do 72 hodin nemá na expiraci vliv. Jestliže po obdržení soupravy zjistíte vážné poškození obalu jakékoliv složky soupravy, ihned informujte výrobce. c. Nespotřebovaná testovaná séra uchovávejte v neředěném stavu rozplněná na alikvoty a zmrazená při teplotě -18 až -28 C. Časté zmrazování a rozmrazování se nedoporučuje. Pokud skladujete séra při teplotě +2 až +10 C, pak je spotřebujte do jednoho týdne. d. Roztoky testovaných sér v pracovní koncentraci nelze skladovat. Připravujte je vždy čerstvé. 14. TESTOVACÍ SCHÉMA: Krok 1. Krok 2. Krok 3. Krok 4. Krok 5. Krok 6. Připravte reagencie a testovaná séra v pracovním ředění Aplikujte 100 L / jamku kontrolních a testovaných sér Inkubujte 60 minut při laboratorní teplotě 4x promyjte (250 L / jamku), vyklepněte Aplikujte 100 L / jamku Px konjugátu r.t.u. Inkubujte 60 minut při laboratorní teplotě 4x promyjte (250 L / jamku), vyklepněte Aplikujte 100 L / jamku chromogensubstrátového roztoku TMB Inkubujte 10 minut v temnu při laboratorní teplotě Aplikujte 100 L/ jamku stop roztoku Změřte absorbanci při 450 nm / 620-690 nm do 10 minut Doporučená literatura Fachiroh J, Schouten T, Hariwiyanto B, Paramita DK, et al. Molecular diversity of Epstein-Barr virus IgG and IgA antibody responses in nasopharyngeal carcinoma: A comparison of Indonesian, Chineese and European subjects. J Infect Dis 2004; 190: 53-62. Paramita DK, Fachiroh J, Haryana SM, Middeldorp JM. Two-step Epstein-Barr virus immunoglobulin A enzyme- linked immunosorbent assay for serological screening and confirmation of nasopharyngeal carcinoma. Clin Vaccine Immunol 2009; 16: 706-11. Datum poslední verze tohoto návodu: 12/2014 6