STAFYLOKOKOVÉ ENTEROTOXINY Zdravotní nezávadnost potravin Veronika Talianová, FPBT, kruh: 346 Angelina Anufrieva, FPBT, kruh: 336
OBSAH: Základní charakteristika Staphylococcus aureus Stafylokokové enterotoxiny Detekce enterotoxinů Výskyt S.aureus Patogeneze a alimentární intoxikace Prevence výskytu Závěr
ZÁKLADNÍ CHARAKTERISTIKA S. AUREUS Fakultativně anaerobní, nepohyblivý, G+ kok. Průměrná velikost 0,7 0,9 µm, tvoří hroznovité shluky. S. aureus produkuje zlatožlutý pigment, na krevním agaru může způsobovat úplnou hemolýzu. Zlatožlutý pigment S. aureus
STAFYLOKOKOVÉ ENTEROTOXINY Jsou to bazické proteiny o molekulové hmotnosti pohybující se v rozmezí 24 29 kda; Polypeptidové řetězce obsahují jednu disulfidickou vazbu a jsou bohaté na Lys, Asp, Glu a Tyr; Jsou rezistentní k proteolytickým enzymům zažívacího traktu a odolávající účinkům varu po dobu 30 minut; V současné době je známo 21 typů stafylokokových enterotoxinů: - klasické enterotoxiny: typ A-E; - nové enterotoxiny: typ G-V; Tab.1 : Vliv vnějších a vnitřních faktorů Faktor Růst bakterií rozmezí Produkce enterotoxinů optimum rozmezí Teplota ( C) 7-48 40-45 10-48 ph 4.0-10.0 7.0-8.0 4.5-9.6 Vodní aktivita (a w ) 0.83-0.99 0.98 0.87-0.99
DETEKCE ENTEROTOXINŮ V současné době se pro stanovení SEs používá řada metod, které jsou založeny především na imunologických principech. Metody: Přímé metody: - imunologické metody - fyzikálně-chemické metody Nepřímé metody: - molekulárně biologické metody
PŘÍMÉ METODY Imunologické metody : RPLA (reverzní pasivní latexová aglutinace)-metoda je založena na reakci antigenu v roztoku s protilátkami, které jsou navázány na latexové částice. ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)- Principem metody je vazba antigenu a protilátky značené enzymem, který štěpením substrátu vyvolá barevnou změnu. Pro stanovení SEs se používá tzv. sendvičová ELISA. sendvičová ELISA
ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay) - princip reakce je podobný jako u metody ELISA, rozdíl spočívá v použitém substrátu, který je enzymem štěpen na fluorescenční produkt. Vzniklé chemické změny jsou detegovány pomocí fotodiodového fluorimetru. Fyzikálně-chemické metody: (Biosenzory, HPLC, LC-MS, SDS-PAGE) HPLC - kapalinová chromatografie je jednou z metod detekce SEs. Výhodou této metody je možnost kvalitativního i kvantitativního průkazu široké škály toxinů. SDS-PAGE - je elektroforéza v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS). Umožňuje separaci proteinů na základě jejich pohyblivosti v elektrickém poli. Tato pohyblivost je závislá např. na délce polypeptidového řetězce (molekulární hmotnosti).
NEPŘÍMÉ METODY Molekulárně biologické metody: PCR (polymerázová řetězová reakce) - je založena na principu klonování (zmnožení specifického úseku DNA) in vitro. Pro potvrzení toxigenity kmenů S. aureus lze použít PCR pro přímé stanovení genů zodpovědných za tvorbu toxinů. DNA microarrays (DNA čip) - metoda, založená na principu hybridizace, probíhá na membráně nebo skleněné destičce, na které jsou mikrodávkovačem naneseny jednotlivé oligonukleotidy (DNA sondy). Výhodou této metody je možnost kvantitativního i kvalitativního stanovení a sledování až stovek specifických úseků DNA v jedné reakci.
VÝSKYT S.AUREUS Vyskytuje se na sliznicích respiračního ústrojí, především v nosní a ústní dutině, na pokožce, v intestinálním a urogenitálním traktu. Potraviny mohou být kontaminovány druhem S. aureus pocházejícím ze zvířat, prostředí nebo lidí v průběhu výrobního procesu především pracovními nástroji a pracovníky potravinářských provozů. Nejčastěji bývají stafylokoky kontaminovány mléčné výrobky, lahůdky, pudinky a salátové dresinky, dále pak maso, šunky, ryby a mořské plody. Největší riziko kontaminace je u potravin s vysokým podílem ruční práce. S. aureus se pomnožuje v potravinách ponechaných delší dobu při pokojové teplotě.
PATOGENEZE A ALIMENTÁRNÍ INTOXIKACE Patogeneze S. aureus přirozeně osidluje kůži a oblast nosohltanu lidí a zvířat. Při oslabení imunitního systému hostitele je schopen vyvolat různá onemocnění kožní záněty, alimentární onemocnění, pneumonie, osteomyelitidy, syndrom toxického šoku, syndrom opařené kůže, abscesy, bakteriální endokarditidy a sepse. Z nejčastějších onemocnění z potravin typu alimentární intoxikace stafylokokové enterotoxikózy jsou zodpovědné stafylokokové enterotoxiny (SEs). Za otravu z potravin je zodpovědných pět tzv. klasických stafylokokových enterotoxinů: SEA SEE. Rizikové množství S. aureus v potravině, které je schopno vyprodukovat dostatečné množství SEs (alespoň 1 ng. g -1 potraviny), je 10 5 KTJ.g -1
PREVENCE VÝSKYTU S.AUREUS Prevence spočívá především v zabránění růstu S. aureus v potravinách působením chladírenských teplot a použitím technologií eliminujících jejich výskyt v potravinách (např. pasterace). Pasterace je krátkodobé zvýšení teploty, které způsobí zničení nesporulujících patogenních mikroorganismů. Působení tepla musí být přizpůsobeno individuální potravině. - vysoká teplota, mžikový čas - nízká teplota, dlouhý čas Sekundární kontaminaci potravinářských výrobků s vyšším podílem ruční práce je možno zabránit důsledným dodržováním osobní hygieny pracovníků, mytím rukou a používáním ochranných rukavic.
ZÁVĚR S.aureus je to fakultativně anaerobní, nepohyblivý, G+ kok, produkující stafylokokové enterotoxiny Enterotoxiny jsou rezistentní k proteolytickým enzymům zažívacího traktu a odolávající účinkům varu po dobu 30 minut. Enterotoxiny se detekují přímými a nepřímými metodami. S.aureus se vyskytuje v řadě potravin a působí především alimentární intoxikace. Prevencí je uchovávání potravin za chladících boxech, pasterace a dodržováním osobní hygieny pracovníků (mytí rukou, používání ochranných rukavic).