MINICAP PROTEIN(E) 6 Ref. 2203 Ref. 2223* 2016/10
POUŽITÍ SADY Sada MINICAP PROTEIN(E) 6 je určena pro separaci proteinů v lidském séru kapilární elektroforézou systémem MINICAP v alkalickém tlumicím roztoku (ph 9.9). Proteiny v normálním séru se rozdělí na šest hlavních frakcí. MINICAP provádí všechny operace automaticky a výsledkem je profil bílkovin pro kvalitativní nebo kvantitativní analýzu. Bílkoviny jsou separované v křemenných kapilárách a jsou přímo detekovány při 200 nm. Elektroforetické záznamy mohou interpretovány pro vyšetření z hlediska abnormalit vizuálně. Přímá detekce slouží k přesnému kvantitativnímu určení jednotlivých frakcí bílkovin. Pro diagnostické použití In Vitro. POZNÁMKA : V tomto návodu se název "MINICAP" používá pro poloautomatické přístroje MINICAP a MINICAP FLEX-PIERCING. PRINCIP TESTU (1-11) Elektroforéza bílkovin je zavedená technika běžně používaná v klinických laboratořích pro vyšetření vzorků pro zjištění proteinových abnormalit (1, 2, 3, 10). MINICAP byl vyvinut ke kompletní automatizaci s rychlým dělením a přijatelným rozlišením. Tuto techniku lze z mnoha hledisek zařadit mezi klasickou zónovou elektroforézu a kapalinovou chromatografii (1, 3, 8, 11). Systém MINICAP používá princip kapilární elektroforézy ve volném roztoku. Elektricky nabité molekuly jsou separovány podle elektroforetické pohyblivosti ve 100 µm kapilárách v alkalickém pufru o určitém ph. Separace je rovněž závislá na ph elektrolytu a elektroosmotickém toku. Systém MINICAP má 2 kapiláry v paralelním zapojení, což umožňuje 2 paralelní analýzy. Ředění vzorku pufrem je připraveno a vpraveno aspirací na anodickém konci kapiláry. Potom následuje vysokonapěťová separace bílkovin a jejich přímá detekce při 200 nm na katodickém konci kapiláry. Kapiláry jsou ihned promývány promývacím roztokem a promytím pufrem připraveny k další analýze. Proteiny jsou detekovány v následujícím pořadí : gama globuliny, beta-2 globuliny, beta-1 globuliny, alfa-2 globuliny, alfa-1 globuliny a albumin s tím, že každá zóna obsahuje jeden či více proteinů. REAGENTY A MATERIÁLY DODÁVANÉ V SADĚ MINICAP PROTEIN(E) 6 VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. POLOŽKY PN 2203 PN 2223* Pufr (ihned k použití) 2 lahvičky, 250 ml každá 6 lahvičky, 250 ml každá Promývací roztok (zásobní roztok) 1 lahvička, 25 ml 3 lahvičky, 25 ml každá Reagenční nádobky 1 balení po 125 kusech 3 balení po 125 kusech Filtry 3 filtry 3 filtry Kontejnery na použité nádobky 4 kontejnerů 12 kontejnerů * MINICAP PROTEIN(E) MAXI-KIT OPTIMÁLNÍ ŘÍZENÍ VYSLEDOVATELNOSTI : Všechna činidla ze stejné sady se musejí používat společně. DOSAŽENÍ OČEKÁVANÝCH VÝKONŮ : Musí se dodržovat pokyny z příbalového letáku. VAROVÁNÍ : Nepoužívejte standardně prodávanou deionizovanou vodu, jako např. na žehlení (nebezpečí poškození důležitých kapilár). Používejte výhradně ultračistou vodu, jako je např. voda pro čistoty pro nástřik. 1. TLUMÍCÍ ROZTOK Příprava Tlumicí roztok je připraven k použití. Obsahuje : tlumicí roztok s ph 9.9 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Pufr k analýze proteinů kapilární elektroforézou. Skladování, stabilita a známky znehodnocení roztoku Pufr skladujte při pokojové teplotě (15 až 30 C) nebo v chladničce (2 až 8 C). Roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky pufru. Neskladovat v blízkosti okna nebo tepelného zdroje. POZNÁMKA : Pokud je pufr skladován při 2-8 C, doporučuje se nechat jej vytemperovat před použitím pro analýzu na pokojovou teplotu. NEMRAZIT Po otevření lahvičky s roztokem a jejím vložení do přístroje MINICAP je roztok při pokojové teplotě stabilní maximálně 2 měsíce (akumulovaný čas). Je-li plánované použití lahvičky s roztokem více než 2 měsíce, musí se po každém použití z přístroje vyjmout a uložit při pokojové teplotě (15 až 30 C) nebo v chladničce (mezi teplotami 2 a 8 C). V takovém případě je stabilní až do data exspirace uvedeného na štítku lahvičky s roztokem. Zředěný pufr zneškodněte, pokud se změní jeho vzhled, například se stane zakaleným v důsledku bakteriální kontaminace. 2. PROMÝVACÍ ROZTOK Příprava Lahvička zásobního promývacího roztoku může být zředěna až na 250 ml destilovanou nebo deionizovanou vodou. Po zředění vznikne promývací roztok obsahující zásaditý roztok ph 12. - 129 - SEBIA NÁVOD - Czech
K promývání kapilár po elektroforetické separaci bílkovin. DŮLEŽITÉ : Před naplněním nádoby promývacím roztokem se doporučuje promýt otevřenou nádobu, konektor a zkumavku velkým množstvím destilované nebo neionizované vody, aby se zabránilo tvorbě usazenin soli. Skladování, stabilita a známky znehodnocení roztoku Zásobní i pracovní roztok se skladuje při pokojové teplotě nebo v chladničce v těsně uzavřených nádobách. Zásobní promývací roztok je stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky promývacího roztoku. Pracovní promývací roztok je stabilní 3 měsíců. Pracovní promývací roztok zneškodněte, pokud se změní jeho vzhled, například se zakalí v důsledku bakteriální kontaminace. 3. REAGENČNÍ NÁDOBKY Nádobky pro jedno použití pro ředění vzorků séra a migraci v automatizovaném zařízení. Umístnění nádobek MINICAP na automatizovaná zásobovací systém Jedna nádobka je zamýšlena pro analýzu dvou vzorků séra. VAROVÁNÍ : S reagenčními nádobkami obsahujícími biologické vzorky se musí nakládat s opatrností. 4. FILTRY Filtry na jedno použití k filtraci pufru pro analýzu, pracovního promývacího roztoku a destilované vody (používá se k vyplachování kapilár). DŮLEŽITÉ : Při výměně soupravy systematicky vyměňte všechny filtry. Při manipulaci a instalaci filtrů noste čisté rukavice. Našroubujte jeden filtr na konektor umístěný na konci každé hadičky rourky trubice ponořené do lahviček s pufrem, promývacím roztokem nebo s deionizovanou vodou. Skladování Filtry skladujte v originálních, utěsněných obalech, na suchém místě, při pokojové teplotě nebo v chladničce. 5. KONTEJNERY NA POUŽITÉ NÁDOBKY Kontejnery slouží k automatickému sběru použitých reagenčních nádobek v systému MNICAP. Umístění v systému MINICAP v místě zamýšleného použití. VAROVÁNÍ : S kontejnery obsahujícími reagenční nádobky s biologickými vzorky se musí nakládat s opatrností. POTŘEBNÉ REAGENTY NEOBSAŽENÉ V BALENÍ VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. 1. DESTILOVANÁ NEBO DEIONIZOVANÁ VODA K vyplachování kapilár v automatickém systému MINICAP, SEBIA, pro elektroforézu. Je doporučeno používat filtrovanou, destilovanou nebo deionizovanou vodu (na filtr o porozitě 0,45 μm) a s vodivostí nižší než 3 µs/cm, což odpovídá rezistivitě vyšší než 0,33 MΩ x cm. Vodu je nutno denně měnit, aby nedošlo k mikrobiální kontaminaci. Pro optimální funkci přidejte roztok CLEAN PROTECT (SEBIA, KAT. Č. 2059, 1 lahvička o objemu 5 ml) do destilované nebo deionizované vody nebo použijte přímo roztok CAPIprotect připravený k použití (SEBIA, KAT. Č. 2061 : 2 nádoby o objemu 5 L destilované vody s CLEAN PROTECT). DŮLEŽITÉ : Vyplachovací nádobu je před naplněním nutno vymýt větším množstvím destilované nebo deionizované vody. 2. CAPICLEAN (PRO MINICAP) NEBO MINICAP FLEX-PIERCING CAPICLEAN (PRO MINICAP FLEX-PIERCING) Složení Lahvička koncentrovaného roztoku CAPICLEAN (CAPICLEAN, SEBIA, kat. č. 2058, 1 lavička po 25 ml nebo MINICAP FLEX-PIERCING CAPICLEAN, SEBIA, kat. č. 2251, 1 lahvička, 25 ml) obsahuje proteolytické enzymy, povrchově aktivní činidla a aditiva, která nejsou nebezpečná v používaných koncentracích, nezbytných pro optimální výkon. K čištění vzorkovací sondy v automatickém přístroji MINICAP nebo MINICAP FLEX-PIERCING, SEBIA pro kapilární elektroforézu během čištění CAPICLEAN. DŮLEŽITÉ : Čisticí sekvenci CAPICLEAN spusťte alespoň jednou týdně a nejvýše jednou denně nebo po každých 500 analýzách, pokud jsou provedeny za méně než jeden týden. Viz listy s pokyny pro CAPICLEAN nebo MINICAP FLEX-PIERCING CAPICLEAN, SEBIA. DŮLEŽITÉ : Pro správné použití roztoku CAPICLEAN v přístrojích MINICAP a MINICAP FLEX-PIERCING je nutné použít jeden čárový kód určený k označení zkumavky, která obsahuje naředěný roztok CAPICLEAN. Skladování, stabilita a známky znehodnocení roztoku Roztok CAPICLEAN skladujte v chladničce (2 až 8 C). Stabilní do data exspirace vyznačeného na štítku lahvičky antiséra. NEMRAZIT. V lahvičce roztoku CAPICLEAN může být vidět sraženina nebo částice spojené v suspenzi (vločky) bez nežádoucích účinků na jeho použitelnost. Nerozpouštějte tuto sraženinu ani částice. Doporučuje se shromáždit pouze supernatant. Pro pozdější použití skladujte zkumavka s naředěným roztokem při teplotě 2 8 C. Roztok musí být použit do jednoho dne. - 130 -
3. ROZTOK CHLORNANU SODNÉHO (k čištění vzorkovací sondy) Příprava Připravte roztok chlornanu sodného (2 až 3 % chlorid) naředěním 250 ml 9,6 % roztoku chloridu (koncentrovaného) do 1 litru studené destilované nebo deionizované vody. Pro čištění vzorkovací sondy automatického přístroje MINICAP nebo MINICAP FLEX-PIERCING, SEBIA, pro kapilární elektroforézu (týdenní údržba pro odstranění proteinů adsorbovaných na sondě). Viz návod k systému MINICAP nebo MINICAP FLEX-PIERCING, SEBIA. Pro MINICAP aplikujte do hemolyzační zkumavky 2 ml zředěného dříve připraveného chlorovaného roztoku. Pro MINICAP FLEX-PIERCING aplikujte do 100 mm zkumavky 2 ml zředěného dříve připraveného chlorovaného roztoku. Umístěte zkumavku (se stejným čárovým kódem jako roztok chlornanu sodného) na otočný autosampler přístroje MINICAP nebo MINICAP FLEX- PIERCING. Zkontrolujte, zda jsou na automatický podávací systém nádobek MINICAP / MINICAP FLEX-PIERCING umístěny nové reagenční nádobky (pokud bude reagenční nádobka chybět, zobrazí se zpráva). Zasuňte otočný autosampler do systému MINICAP / MINICAP FLEX-PIERCING. Zavřete dvířka systému MINICAP / MINICAP FLEX-PIERCING a čistící sekvence se zahájí automaticky. DŮLEŽITÉ : Pro správné použití roztoku chlornanu sodného v přístrojích MINICAP a MINICAP FLEX-PIERCING je nutné použít jeden čárový kód určený k označení zkumavky, která obsahuje roztok. Skladování, stabilita a známky znehodnocení roztoku Pracovní chlorovaný roztok skladujte v uzavřené nádobě při pokojové teplotě. Roztok je stabilní 3 měsíce. Roztok neskladujte na slunečním světle, blízko tepelného nebo zápalného zdroje, kyselin a amoniaku. 4. PROMÝVACÍ ROZTOK CAPILLARYS / MINICAP Příprava Každá lahvička promývacího roztoku CAPILLARYS / MINICAP (SEBIA, kat č. 2052, 2 lahvičky, 75 ml) může být destilovanou nebo deionizovanou vodou zředěna na 750 ml. Pro systém MINICAP je vhodné naředit pouze 25 ml zásobního roztoku destilovanou nebo deionizovanou vodou zředěna na 250 ml. Po zředění vznikne promývací roztok obsahující zásaditý roztok ph 12. Pro promývání kapilár systému MINICAP. DŮLEŽITÉ : Před naplněním nádoby promývacím roztokem se doporučuje promýt otevřenou nádobu, konektor a zkumavku velkým množstvím destilované nebo neionizované vody, aby se zabránilo tvorbě usazenin soli. Skladování, stabilita a známky znehodnocení roztoku Zásobní i pracovní roztok se skladuje při pokojové teplotě nebo v chladničce v těsně uzavřených nádobách. Zásobní promývací roztok je stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky promývacího roztoku. Pracovní promývací roztok je stabilní 3 měsíců. Pracovní promývací roztok zneškodněte, pokud se změní jeho vzhled, například se zakalí v důsledku bakteriální kontaminace. POZNÁMKY : Zkoušky provedené pro ověření reagentů prokázaly, že pro různé roztoky a použití přizpůsobeného vybavení pro rekonstituci objemu, nemají odchylky objemu ± 5 % z konečného objemu vliv na výsledek analýzy. Destilovaná nebo deionizovaná voda používaná k ředění roztoků musí být prostá bakteriální proliferace a plísní (použijte filtr 0,45 µm) a musí mít vodivost nižší než 3 µs/cm, což odpovídá rezistivitě vyšší než 0,33 MΩ x cm. POTŘEBNÉ VYBAVENÍ A PŘÍSLUŠENSTVÍ 1. Systém MINICAP, SEBIA, kat. č. 1230, Systém MINICAP FLEX-PIERCING, SEBIA, kat. č. 1232. 2. Otočný autosampler dodávaný spolu se systémem MINICAP. 3. Souprava nádob dodávaná se systémem MINICAP : Promývací nádobka (na destilovanou či deionizovanou vodu) a nádobka na odpad. 4. MINICAP Reagenční nádobky / 125 (3), SEBIA, PN 2281. 5. Víčka na kontejnery na použité nádobky činidel, SEBIA (12 kusů), PN 2286 : víka na uzavírání kontejnerů s použitými nádobkami. VZORKY PRO ANALÝZU Odběr a skladování vzorků Pro analýzu se doporučuje používat čerstvé vzorky séra. Odběr séra musí být v souladu s následujícími postupy používanými pro testování v klinických laboratořích. Vzorky lze skladovat chlazené mezi 2 až 8 C po dobu až 10 dní. Na delší skladování by měly být vzorky zmrazeny na - 18 / - 30 C do 8 hodin po odběru. Zmražené vzorky séra jsou stabilní po dobu 2 měsíců. Bílkoviny ve vzorku skladovaném při teplotě 2 až 8 C nebo 15 až 30 C podléhají degradaci, zejména složka C3, u které je kinetika degradace při teplotách 15 30 C velmi rychlá a po třech dnech ji lze jasně pozorovat. - 131 -
Sérum skladované při teplotě mezi 2 a 8 C nebo mezi 15 a 30 C obsahuje frakci beta-2, jejíž obsah postupně klesá a může se objevit zkresleně (s dalšími malými frakcemi, které se objeví na straně gama nebo beta-1 následně po znehodnocení složky C3), a frakci alfa-2, jejíž tvar může být mírně změněn. Po 10 dnech skladování mezi 2 a 8 C nebo 3 dnech skladování mezi 15 a 30 C se frakce beta-1 začne deformovat rozpínáním a obsah frakce beta-2 se silně sníží. V závislosti na vzorcích může být po 10 dnech skladování při teplotě mezi 2 a 8 C nebo 3 dnech skladování při teplotě mezi 15 a 30 C potenciálně narušena automatická integrace frakcí provedená softwarem pro zpracování dat. POZNÁMKA : Každá laboratoř musí zajistit, že jsou vzorky přepravovány za optimálních podmínek, aby nedošlo k porušení jejich integrity (1). (1) ISO 15189 : Zdravotnické laboratoře Požadavky na kvalitu a způsobilost. Příprava vzorků Používejte neředěné vzorky séra. Při skladování v chladničce při 2 až 8 C nebo po zmrazení se některá séra mohou stát viskózními nebo vznikne zákal. Při pokojové teplotě mohou být tyto vzorky přímo analyzovány. Vzorky obsahující polymerizovaný imunoglobulin mohou být použity bez další úpravy. Doporučuje se pozorovat chování vzorku před analýzou (hemolýza, kryoglobuliny nebo zákal). Vzorky, které není vhodné používat Nepoužívejte hemolyzované vzorky séra. Hemolýza zvyšuje dvojitou zónu alfa-2. Nepoužívejte stará, nesprávně skladovaná séra - obsah beta-2 frakce by mohl být snížený. Nepoužívejte vzorky plazmy. Fibrinogen migruje na polohu beta-2 (hrb v poloze beta-2 nebopřekryv se zónou beta-2 s možným nárůstem této frakce). Pokud je přítomný v některých vzorcích (plasma, ne zcela defibrinované sérum, nebo pacient podrobující se antikoagulační léčbě), fibrinogen může nevhodně interferovat (podezření na nárůst monoklonálního pásu nebo beta-2 frakce). Při analýze starších vzorků plasmy (není doporučeno), C3 funkční skupiny, které se mohou s časem měnit, jsou částečně degradovány, beta- zóna odpovídá fibrinogenu. POZNÁMKA : Odběrové zkumavky pro biologické vzorky jsou popsány v dostupné dokumentaci k předanalytické fázi pro biomedicínskou analýzu (údaje poskytnuté výrobci zkumavek, návody a doporučení k odběru biologických vzorků ). Nejsou-li v návodu k použití pro typ zkumavek, které mají být použity, uvedeny žádné pokyny, postupujte podle této dokumentace a v případě rozměrů zkumavek, které mají být použity, postupujte podle dokumentu SEBIA "Charakteristiky zkumavek používaných podle přístroje". Předanalytická fáze musí být provedena podle stavu poznání, různých doporučení, mimo jiné doporučení výrobců zkumavek a platných předpisů. POSTUP Systém MINICAP je multiparametrické zařízení, určené k analýze sérových proteinů ve dvou paralelních kapilárách v následující sekvenci : Načtení čárového kódu (až 28 zkumavek) se sérem a kódu otočného autosampleru ; Naředění vzorku ze zkumavek do reagenčních nádobek ; Promývání kapilár ; Nástřik naředěných vzorků ; Analýza proteinů s jejich přímou detekcí na kapilárách. Manuální kroky zahrnují : Vložení zkumavek se vzorkem do otočného autosampleru ; Vložení otočného autosampleru do zařízení MINICAP ; Odstranění zkumavek se vzorky po analýze ; Odstranění a uzavření kontejnerů s použitými nádobkami. PEČLIVĚ SI PROSTUDUJTE NÁVOD K POUŽITÍ. I. PŘÍPRAVA ELEKTROFORETICKÉ ANALÝZY 1. Zapněte přístroj MINICAP a počítač. 2. Pro zahájení práce zařízení umístněte alespoň jednu reagenční nádobku do automatického podávacího systému pro nádobky MINICAP (pokud nádobka není přítomna, zobrazí se zpráva). 3. Nastavte program a zařízení automaticky zahájí analýzu. 4. Sada MINICAP PROTEIN(E) 6 slouží k provádění analýz podle programu "PROTEIN(E) 6" na zařízení MINICAP. Pro volbu programu analýzy "PROTEIN(E) 6" a umístnění lahvičky s pufrem MINICAP PROTEIN(E) 6 do zařízen si přečtěte návod k obsluze zařízení MINICAP. 5. Otočný autosampler má 28 poloh pro umístnění zkumavek se vzorky. Umístněte 28 zkumavek se vzorkem do autosampleru tak, aby první vzorek byl v poloze č. 1. Čárová kód zkumavky musí být vidět v průhledech na otočném autosampleru. DŮLEŽITÉ : Pokud není první zkumavka v poloze č.1 autosampleru, analýze nezačne (zobrazí se zpráva, že v poloze č.1 chybí zkumavka se vzorkem). POZNÁMKA : Pro použití kontrolního séra je nutné použít specifický čárový kód. 6. Novou reagenční nádobku umístněte na automatický podávací systém nádobek MINICAP (pokud bude reagenční nádobka chybět, zobrazí se zpráva). 7. Nový kontejner na použité nádobky umístněte na zařízení MINICAP do míst jeho použití. 8. Zasuňte otočný autosampler do systému MINICAP. 9. Zavřete dvířka systému MINIAP a analýze se automaticky zahájí. 10. Po končení analýzy odstraňte otočný autosampler a již analyzované zkumavky se vzorky. 11. Opatrně vyjměte kontejner obsahující použité reagenční nádobky, pevně jej uzavřete odpovídajícím uzávěrem a vhoďte jej. VAROVÁNÍ : S kontejnery obsahujícími reagenční nádobky s biologickými vzorky se musí nakládat s opatrností. - 132 -
ŘEDĚNÍ - MIGRACE - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ 1. Čárové kódy jak na zkumavce se vzorkem tak na otočném autosampleru jsou načteny. 2. Vzorky jsou naředěny pufrem a vzorkovací sonda je po každém vzorku opláchnuta. 3. Kapiláry jsou promyty. 4. Zředěné vzorky jsou nastříknuty do kapilár. 5. Migrace probíhá za konstantního napětí po dobu 4 minut, při konstantní teplotě a je řízena Peltiérovým jevem. 6. Proteiny jsou detekovány přímo, skenováním při 200 nm a na obrazovce systému se objeví elektroforetický profil. POZNÁMKA : Tyto kroky jsou popsány pro první dvě analyzované zkumavky se vzorky. Výsledky elektroforézy se objeví po 10 minutách. Pro následující zkumavky se vzorky se první dva kroky (čtení čárového kódu a ředění vzorků), provádí během analýzy předchozích dvou vzorků. II. VÝSLEDEK ANALÝZY Ke konci analýzy je automaticky určeno relativní zastoupení jednotlivých zón a mohou být analyzovány profily. Po zadání koncentrace celkové bílkoviny systém vypočítá koncentraci každé frakce. Elektroforetické záznamy jsou interpretovány z hlediska abnormalit vizuálně. Elektroforetické profily jsou vizualizovány pomocí standardního překreslovacího profilu : pak je frakce alfa-1 blíž k albuminu. Standardní technika umožňuje vizualizovat původní křivku s neupravenými údaji. PEČLIVĚ SI PROSTUDUJTE NÁVOD K POUŽITÍ. III. UKONČENÍ SÉRIE ANALÝZ Po ukončení každé série analyzovaných vzorků musí operátor systém MINICAP vypnout nebo přepnout do pohotovostního režimu, aby byly zabezpečeny optimální podmínky pro uložení kapilár. DŮLEŽITÉ : Novou reagenční nádobku umístněte na automatický podávací systém nádobek MINICAP (pokud bude reagenční nádobka chybět, zobrazí se zpráva). IV. PLNĚNÍ REAGENČNÍCH NÁDOB MINICAP automaticky kontroluje přítomnost reagentů. DŮLEŽITÉ : Dodržujte instrukce pro výměnu reagenčních nádob s ohledem na barevný kód pro lahvičky a spojovací části. V případě nezbytného provedení následujících úkonů bude zobrazena zpráva : Vložte novou lahvičku z pufrem a / nebo, Naplňte nádobu pracovním promývacím roztokem a / nebo, Naplňte nádobu filtrovanou destilovanou nebo deionizovanou vodou k vyplachování kapilár a / nebo, Vyprázdněte kontejner s odpadem. MINICAP PROTEIN(E) 6-2016/10 VAROVÁNÍ : Nepoužívejte standardně prodávanou deionizovanou vodu, jako např. na žehlení (nebezpečí poškození důležitých kapilár). Používejte výhradně ultračistou vodu, jako je např. voda pro čistoty pro nástřik. DŮLEŽITÉ : Vyplachovací nádobu je před naplněním nutno vymýt větším množstvím destilované nebo deionizované vody. PEČLIVĚ SI PROSTUDUJTE NÁVOD K POUŽITÍ. KONTROLA KVALITY Je doporučováno do každé sekvence zahrnout i kontrolní sérum. VÝSLEDKY Hodnoty Přímá detekce při 200 nm v kapilárách dává relativní koncentrace (procentuální hodnoty) pro jednotlivé zóny proteinů. Referenční hodnoty (průměr ± 2 SD) jednotlivých hlavních elektroforetických zón sérových proteinů byly stanoveny na základě 246 sér dospělých osob zdravé populace (mužů a žen) s normálními hladinami trygliceridů. MINICAP PROTEIN(E) 6 Albumin 55.8-66.1 % Alfa-1 globuliny 2.9-4.9 % Alfa-2 globuliny 7.1-11.8 % Beta globuliny 8.4-13.1 % Beta-1 globuliny 4.7-7.2 % Beta-2 globuliny 3.2-6.5 % Gama globuliny 11.1-18.8 % Doporučuje se, aby každá laboratoř stanovila své vlastní referenční hodnoty. POZNÁMKA: Referenční hodnoty byly stanoveny použitím standardních parametrů softwaru PHORESIS (vyhlazení 2 a automatický posun). - 133 -
Interpretace C4 funkční skupiny migrují mezi zónami beta-1 a beta-2 ; CRP migruje v poloze beta-2, viz. ELEKTROFORETICKÉ VZORY. Relativní nárůst v zóně beta-2 ve srovnání se zónou beta-1 bez rozumného klinického zdůvodnění o onemocnění zánětlivého typu musí být varovným signálem pro provedení dalších srovnávacích měření. V případě pochybností ohledně interpretace záznamů a / nebo umístění minim (zejména při analýze externí kontroly) je nutno převrstvit získaný záznam záznamem séra Normal Control Serum (SEBIA, kat. č. 4785). Může dojít k podezření na monoklonální složku ve vzorku séra, když je elektroforetický vzor jediného proteinu opožděný nebo zkreslený nebo v případě, že software (PHORESIS verze 8.63) nedokáže vykreslit zónu albumin / alfa-1. Následně se na elektroforetickém vzoru zobrazí následující varovná zpráva : Warning: Migration time out of range (Varování: Doba migrace mimo rozsah) s červeným varovným signálem. Tento červený varovný signál se rovněž zobrazí na mosaice křivek ve výsledné tabulce pro dotčený vzorek. Pro potvrzení přítomnosti monoklonální složky v sérovém vzorku je nutné ošetřit vzorek β-merkaptoethanolem a opakovat analýzu vzorku po tomto redukčním zpracování. V takovém případě (i) připravte 1 % β-merkaptoethanol (BME nebo 2-merkaptoethanol, 2 ME) v roztoku Fluidil (SEBIA, kat. č. 4587, 1 lahvička 5 ml), (ii) přidejte 100 µl tohoto redukčního roztoku k 300 µl čistého séra, (iii) promíchejte na vortexu a vyčkejte nejméně 15 minut (a maximálně 30 minut) a potom zopakujte standardní postup. DŮLEŽITÉ : Po redukční úpravě pomocí β-merkaptoethanolu musí být vzorek neprodleně analyzován. V systému MINICAP nesmí žádná poloha čekat na analýzu. Pokud se stejný varovný signál objeví u více elektroforetických vzorů, zavolejte Technický servis SEBIA. Doporučuje se provést identifikaci monoklonálních nebo oligoklonálních složek. - imunotypizací pomocí sady SEBIA MINICAP IMMUNOTYPING nebo, - imunofixací pomocí sad SEBIA HYDRAGEL IF. Pro pomoc při interpretaci výsledků elektroforézy sérových bílkovin, viz LITERATURA. Zóna alfa 2 : V některých vzorcích a v souladu s fenotypem haptoglobinu se může zóna alfa-2 rozštěpit, viz. ELEKTROFORETICKÉ VZORY. Interference a omezení Viz ANALYZOVANÉ VZORKY Lipoproteiny / triglyceridy nebo biliární pigmenty (s charakteristickou žlutozelenou barvou séra) mohou při vysokých koncentracích ve vzorku způsobit podle elektroforetického vzoru zdání bisalbuminemie. V případě podezření na kontaminaci mezi dvěma vzorky (velmi vzácná), způsobené přítomností nějakých monoklonálních složek (ve vyšších koncentracích na vzorek) se doporučuje zopakovat test na již vyzkoušených vzorcích (kontaminujících a potenciálně kontaminovaných) v obráceném pořadí analýz. Vzhledem k omezené rozlišovací schopnosti a citlivosti zónové elektroforézy je možné, že některé monoklonální komponenty nebudou touto metodou detekovány. Monoklonální komponent nemusí být detekován (například. polymerizovaný imunoglobulinový stěr nebo skrytý v polyklonálním pozadí). Naopak mírné zkreslení elektroforetického záznamu může naznačovat přítomnost monoklonálního imunoglobulinu. Ve všech případech je třeba analyzovat klinický kontext, a pokud je podezření na gamopatii, doporučuje se provést imunotypizační analýzu vzorku. Pokud nejistota přetrvává, ověřte výsledek imunofixačním postupem na agarovém gelu. Odstraňování problémů Pokud při dodržení veškerých instrukcí pro přípravu, skladování a provedení testu uvedených v příbalovém letáku testy nevycházejí, kontaktujte technickou podporu společnosti SEBIA. Bezpečnostní datové listy soupravy činidel a informace o čištění a likvidaci odpadů, označování a bezpečnostní pravidla používaná společností SEBIA, obaly pro přepravu biologických vzorků a informace o čistění přístroje jsou k dispozici na webových stránkách SEBIA : www.sebia.com. ÚDAJE O VÝKONU Výsledky získané metodou MINICAP PROTEIN(E) 6 vykazují velmi dobrou reprodukovatelnost kvantitativní analýzy s průměrem CV% kolem 2,1 % pro každou frakci proteinů. Výsledky uvedené níže byly stanoveny za použití standardních parametrů přístrojového software MINICAP (vyhlazení 2, automatický posun). Reprodukovatelnost mezi sekvencemi a jednotlivými analýzami Čtyři (4) různé vzorky sér byly měřeny na 2 zařízení MINICAP pomocí postupu MINICAP PROTEIN(E) 6 a za použití stejné šarže pufru. Každý vzorek byl měřen pět krát na obou kapilárách obou dvou systémů. Pro každou zónu a šarži byly vypočteny průměry, SD a CV (n = 10). Tabulka ukazuje hodnoty 4 testovaných vzorků, rozdělených na jednotlivé frakce za použití 2 systémů MINICAP. - 134 -
Frakce Albumin Alfa1 Alfa2 Beta 1 Beta 2 Gama Sérum A : systém č. 1 - systém č. 2 PRŮMĚR (%) 59.2-58.6 5.0-5.2 8.6-8.6 4.9-5.1 4.5-4.5 17.8-18.0 SD 0.53-0.74 0.14-0.16 0.28-0.16 0.21-0.15 0.11-0.13 0.29-0.30 CV % 0.9-1.3 2.8-3.0 3.2-1.9 4.3-3.0 2.5-2.9 1.6-1.7 Sérum B : systém č. 1 - systém č. 2 PRŮMĚR (%) 60.7-59.7 3.5-3.6 8.9-9.2 6.7-7.1 5.2-5.0 15.0-15.5 SD 0.55-0.45 0.09-0.10 0.23-0.15 0.18-0.11 0.17-0.15 0.20-0.24 CV % 0.9-0.8 2.7-2.7 2.5-1.6 2.7-1.5 3.3-3.0 1.3-1.6 Sérum C : systém č. 1 - systém č. 2 PRŮMĚR (%) 55.4-54.1 3.6-3.7 10.1-10.5 5.7-5.8 3.8-3.9 21.3-22.1 SD 0.73-0.49 0.14-0.14 0.27-0.16 0.13-0.05 0.11-0.13 0.45-0.25 CV % 1.3-0.9 3.8-3.8 2.7-1.5 2.3-0.9 2.8-3.3 2.1-1.1 Sérum F : systém č. 1 - systém č. 2 PRŮMĚR (%) 60.9-60.9 4.7-4.2 9.0-9.6 6.3-6.2 4.5-4.5 14.6-14.7 SD 0.38-0.46 0.10-0.10 0.21-0.18 0.18-0.13 0.14-0.12 0.20-0.20 CV % 0.6-0.7 2.2-2.5 2.3-1.9 2.9-2.1 3.0-2.7 1.4-1.4 SD MAX 1.2 0.4 0.7 0.7 0.5 0.5 CV (%) MAX 2.0 7.0 7.0 7.0 7.0 4.0 POZNÁMKA : Maximální hodnoty standarní odchylky a koeficientu variace (SD MAX and CV (%) MAX) byly určeny dodatečnou analýzou reprodukovatelnosti kontrolního sŕa provedené na řadě přístrojů. Jsou nezávislé na hodnotách ve výše uvedené tabulce výsledků. Reprodukovatelnost mezi analýzami Pět (5) různých vzorků sér bylo měřeno deset krát pomocí postupu MINICAP PROTEIN(E) 6 na třech různých systémech MINICAP a s pufrem z jedné šarže. Pro každou zónu a šarži byly vypočteny průměry, SD a CV (n = 10). Tabulka ukazuje limitní hodnoty pro 5 testovaných vzorků na 3 systémech a průměrné CV spočítané z CV každé frakce (n = 15). FRAKCE PRŮMĚR (%) SD CV % PRŮMĚR CV (%) Albumin 52.4-61.1 0.21-0.60 0.4-1.0 0.7 % Alfa1 3.4-4.9 0.06-0.28 1.8-6.6 3.1 % Alfa2 9.1-12.5 0.09-0.29 0.8-3.0 1.4 % Beta 1 5.4-6.7 0.05-0.17 1.0-2.7 1.9 % Beta 2 3.5-6.8 0.04-0.16 1.3-3.7 2.4 % Gama 14.1-18.5 0.06-0.44 0.4-2.4 1.4 % Reprodukovatelnost mezi systémy Pět (5) různých vzorků sér bylo měřeno deset krát pomocí postupu MINICAP PROTEIN(E) 6 na třech různých systémech MINICAP a s pufrem z jedné šarže. Pro každý vzorek, zónu a šarži na 3 systémech byly vypočteny průměry, SD a CV (n = 30). Tabulka ukazuje limitní hodnoty pro 5 testovaných vzorků na 3 systémech a průměrné CV spočítané z CV každé frakce (n = 5). FRAKCE PRŮMĚR (%) SD CV % PRŮMĚR CV (%) Albumin 52.6-60.5 0.39-1.00 0.7-1.7 1.2 % Alfa1 3.5-4.8 0.13-0.31 2.9-7.0 4.4 % Alfa2 9.5-12.2 0.12-0.36 1.0-3.8 2.7 % Beta 1 5.4-6.5 0.10-0.31 1.8-4.9 3.1 % Beta 2 3.7-6.8 0.13-0.21 1.9-5.6 3.7 % Gama 14.2-18.2 0.15-0.45 1.0-3.0 2.0 % Přesnost Různé vzorky patologických a normálních sér (n = 60) byly analyzovány postupem MINICAP PROTEIN(E) 6 a dalším komerčně dostupným systémem používající princip kapilární elektroforézy. Korelační parametry spočítané pro jednotlivé zóny z dat naměřených postupem MINICAP PROTEIN(E) 6 proti srovnávacímu systému kapilární elektroforézy (y = MINICAP PROTEIN(E) 6) byly následující : Frakce Korelační koeficient y-úsek Sklon Rozsah hodnot (%) MINICAP PROTEIN(E) 6 Albumin 0.996 0.046 0.985 37.4-74.0 Alfa1 0.987 0.032 1.012 3.1-13.0 Alfa2 0.993 0.347 1.024 7.8-23.5 Beta 1 0.944 0.686 0.911 3.1-10.2 Beta 2 0.986-0.232 1.035 1.9-14.4 Gama 0.999 0.222 0.986 3.5-34.7-135 -
Citlivost Postupně ředěný vzorek séra s monoklonální bílkovinou o koncentraci 0,103 g/dl byl elektroforeticky analyzován pomocí postupu MINICAP PROTEIN(E) 6. Největší zředění s rozpoznatelným monoklonálním pásem odpovídal hodnotě : 4. nebo koncentraci 26 mg/dl monoklonálního proteinu. POZNÁMKA : V závislosti na umístění monoklonální komponenty a polyklonálního pozadí v gama zóně, se může detekční limit lišit. Linearita Roztoky albuminu o koncentraci 5,2 g/dl a gamaglobulinu o koncentraci 3,1 g/dl (koncentrace proteinu stanovená nefelometricky při 280 nm) byly smíchány v různých koncentracích od 10 ku 10 (100 % roztoku albuminu + 0 % roztoku gamaglobulinu, 90 % + 10 % atd..., až po 0 % roztoku albuminu + 100 % roztoku gamaglobulinu) a směs byla analyzován na elektroforéze metodou MINICAP PROTEIN(E) 6. Výsledky dokázaly, že získané procento každé frakce perfektně koreluje s teoretickým procentem každé frakce ve směsi, a že mohou být metodou MINICAP PROTEIN(E) 6 lineárně detekovány jakékoli varianty. Bylo určeno, že test MINICAP PROTEIN(E) 6 je lineární pro frakce albuminu a gamaglobulinu v celém studovaném rozsahu koncentrací (mezi 0,0 a 5,2 g/dl albuminu a 3,1 g/dl gamaglobulinu). - 136 -
BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAPHY 1. Clark R et al. Rapid capillary electrophoretic analysis of human serum proteins : qualitative comparison with high-throughput agarose gel electrophoresis. J. Chromatogr. A, 744, 205-213 (1996). 2. Henskens Y et al. Detection and identification of monoclonal gammopathies by capillary electrophoresis. Clin. Chem., 44, 1184-1190 (1998). 3. Jellum E et al. Diagnostic applications of chromatography and capillary electrophoresis. J. Chromatogr. B, 689, 155-164 (1997). 4. Jenkins MA and Guerin MD. Quantification of serum proteins using capillary electrophoresis. Ann. Clin. Biochem., 32, 493-497 (1995). 5. Jenkins MA et al. Evaluation of serum protein separation by capillary electrophoresis : prospective analysis of 1000 specimens. J. Chromatogr. B, 672, 241-251 (1995). 6. Jenkins MA and Guerin MD. Capillary electrophoresis procedures for serum protein analysis : comparison with established techniques. J. Chromatogr. B, 699, 257-268 (1997). 7. Jenkins MA and Ratnaike S. Five unusual serum protein presentations found by capillary electrophoresis in the clinical laboratory. J. Biochem. Biophys. Methods, 41, 31-47 (1999). 8. Katzmann JA et al. Identification of monoclonal proteins in serum : A quantitative comparison of acetate, agarose gel, and capillary electrophoresis. Electrophoresis, 18, 1775-1780 (1997). 9. Landers JP. Clinical Capillary Electrophoresis. Clin. Chem., 41, 495-509 (1995). 10. Oda RP et al. Capillary electrophoresis as a clinical tool for the analysis of protein in serum and other body fluids. Electrophoresis, 18, 1715-1723 (1997). 11. Wijnen PA and van Dieijen-Visser M. Capillary Electrophoresis of serum proteins : Reproducibility, comparison with agarose gel electrophoresis and a review of the literature. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 34, 535-545 (1996). 12. Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité. Impact-Internat, 1986 ; Sept : 93-97. 13. Le Carrer D, Bach-Ngohou K. L'électrophorèse capillaire automatisée en biologie clinique. Spectra Biologie, 146 : 47-52 (2005). 14. Blancher A., Boulestin A., Abbal M. (2007) Diagnostic biologique des gammapathies monoclonales en 2007 et leur identification immunologique. Feuillets de biologie, 48, N 279, 29 36. 15. Blessum C., Jeppsson J.O., Aguzzi F., Bernon H., Bienvenu J. (1999) L électrophorèse capillaire : principe et applications au laboratoire de biologie clinique. Annales de Biologie Clinique. Volume 57, Numéro 6, 643-57, Novembre - Décembre 1999. 16. Chartier C. et al (2011) Evaluation of two automated capillary electrophoresis systems for human serum protein analysis. Clin. Biochem., DOI:10.1016/j.clinbiochem.2011.05.022. - 197 -
SCHÉMAS / FIGURES PROFILS ÉLECTROPHORÉTIQUES - ELECTROPHORETIC PATTERNS Figure 1 Albumin Gamma Beta-2 Beta-1 Alpha-2 Alpha-1 Gammaglobulins C3 Complement C4 Complement Transferrin Hemopexin 2-2 Haptoglobin phenotype Alpha-2 macroglobulin Prealbumin Albumin α-lipoproteins preß-lipoproteins ß-lipoproteins Alpha-1 acid glycoprotein Alpha-1 antitrypsin Figure 2 1-1 Haptoglobin phenotype Gamma Beta-2 Beta-1 Alpha-2 Alpha-1 Albumin - 198 -
SCHÉMAS / FIGURES PROFILS ÉLECTROPHORÉTIQUES - ELECTROPHORETIC PATTERNS Figure 3 1-2 Haptoglobin phenotype Gamma Beta-2 Beta-1 Alpha-2 Alpha-1 Albumin - 199 -
Benelux SCS / Comm. V Jan Olieslagerslaan 41 1800 Vilvoorde Belgique / België Tél. : 32 (0)2 702 64 64 Fax : 32 (0)2 702 64 60 e-mail : sebia.benelux@sebia.be Brasil Edifício Baker Office Tower Rua Barão do Triunfo, 73, conjunto 51 CEP 04602-000 Bairro Brooklin Paulista, São Paulo - SP Brasil Tel. : 55 11 3849 0148 Fax : 55 11 3841 9816 e-mail : sebia@sebia.com.br GmbH Münsterfeldallee, 6 36041 Fulda Deutschland Tel. : 49 (0)661 3 30 81 Fax : 49 (0)661 3 18 81 e-mail : sebia@sebia.de Hispania S.A. C/Sicilia, n 394 08025 Barcelona España Tel. : 34 93 208 15 52 Fax : 34 93 458 55 86 e-mail : sebia@sebia.es Inc. 400-1705 Corporate Drive Norcross, GA 30093 U.S.A. Tel. : 1 770 446-3707 Fax : 1 770 446-8511 e-mail : info@sebia-usa.com Italia S.r.l. Via Antonio Meucci, 15/a 50012 Bagno a Ripoli (FI) Italia Tel. : 39 055 24851 Fax : 39 055 0982083 e-mail : info@sebia.it UK Ltd River Court, Meadows Business Park Station Approach, Blackwater Camberley, Surrey, GU17 9AB United Kingdom Tel. : 44 (0)1276 600636 Fax : 44 (0)1276 38827 e-mail : info@sebia.co.uk Parc Technologique Léonard de Vinci CP 8010 Lisses - 91008 EVRY Cedex - France Tél. : 33 (0)1 69 89 80 80 - e-mail : sebia@sebia.com Shanghai Representative Office Cross Tower, Room 2306-07 318 Fuzhou Road Shanghai 200001 China Tel. : 00 86 (21) 6350 1655 Fax : 00 86 (21) 6361 2011 e-mail : sebia@sebia.cn