Metody vyšetření imunity

Podobné dokumenty
METODY VYŠETŘOVÁNÍ BUNĚČNÉ IMUNITY. Veřejné zdravotnictví

Metody vyšetření imunity

Specifická imunitní odpověd. Veřejné zdravotnictví

Metody testování humorální imunity

Precipitace, radioimunodifúze (RID), nefelometrie, turbidimetrie

Metody testování humorální imunity

Nové metody v průtokové cytometrii. Vlas T., Holubová M., Lysák D., Panzner P.

Imunologické metody fagocytóza, stanovení oxidačního metabolismu, chemiluminiscence, baktericidní test

Rozdělení imunologických laboratorních metod

Imunochemické metody. na principu vazby antigenu a protilátky

Precipitační a aglutinační reakce

Imunitní systém.

Precipitace, radioimunodifúze (RID), nefelometrie, turbidimetrie

Vybrané imunologické metody

Protinádorová imunita. Jiří Jelínek

Obsah. Seznam zkratek Předmluva k 5. vydání... 21

Humorální imunita. Nespecifické složky M. Průcha

Imunitní odpověd - morfologie a funkce, nespecifická odpověd, zánět. Veřejné zdravotnictví

Obsah. Seznam zkratek Předmluva k 6. vydání... 23

T lymfocyty. RNDr. Jan Lašťovička, CSc. Ústav imunologie 2.LF UK, FN Motol

Marcela Vlková Jana Nechvátalová. FN u sv. Anny v Brně LF MU Brno

Vyšetření imunoglobulinů

Funkční testy: BasoFlowEx Kit FagoFlowEx Kit

Mnohobarevná cytometrie v klinické diagnostice

Průtoková cytometrie Flow Cytometry

Základy imunologických metod: interakce antigen-protilátka využití v laboratorních metodách

Serologické vyšetřovací metody

Elektroforéza. Rozdělení proteinů na základě pohyblivosti v el. poli

Elektroforéza. Rozdělení proteinů na základě pohyblivosti v el. poli

Aglutinace Mgr. Jana Nechvátalová

KOMPLEMENTOVÝ SYSTÉM

2) Vztah mezi člověkem a bakteriemi

SKANÁ imunita. VROZENÁ imunita. kladní znalosti z biochemie, stavby membrán n a fyziologie krve. Prezentace navazuje na základnz

Nespecifické složky buněčné imunity. M.Průcha

Variabilita takto vytvořených molekul se odhaduje na , což je více než skutečný počet sloučenin v přírodě GENETICKÝ ZÁKLAD TĚŽKÉHO ŘETĚZCE

Co jsou imunodeficience? Imunodeficience jsou stavy charakterizované zvýšenou náchylností k infekcím

Imunoblot, imunoelektroforéza

nejsou vytvářeny podle genetické přeskupováním genových segmentů Variabilita takto vytvořených což je více než skutečný počet sloučenin v přírodě

Veronika Janů Šárka Kopelentová Petr Kučera. Oddělení alergologie a klinické imunologie FNKV Praha

Aplikace průtokové cytometrie v klinické imunologii a hematologii

Změny v parametrech imunity v průběhu specifické alergenové imunoterapie. Vlas T., Vachová M., Panzner P.,

Interpretace sérologických nálezů v diagnostice herpetických virů. K.Roubalová

Funkce imunitního systému

Příklady biochemických metod turbidimetrie, nefelometrie. Miroslav Průcha

RNDr. Ivana Fellnerová, Ph.D. Katedra zoologie, PřF UP Olomouc

IMUNOGENETIKA I. Imunologie. nauka o obraných schopnostech organismu. imunitní systém heterogenní populace buněk lymfatické tkáně lymfatické orgány

VZTAH DÁRCE A PŘÍJEMCE

Vybrané imunochemické metody

Játra a imunitní systém

Intracelulární detekce Foxp3

Nespecifické složky buněčné imunity. RNDr. Jan Lašťovička, CSc. Ústav imunologie 2.LF UK, FN Motol

PREZENTACE ANTIGENU A REGULACE NA ÚROVNI Th (A DALŠÍCH) LYMFOCYTŮ PREZENTACE ANTIGENU

Příloha č.4 Seznam imunologických vyšetření. Obsah. Seznam imunologických vyšetření

Příloha č.4 Seznam imunologických vyšetření

T lymfocyty. RNDr. Jan Lašťovička, CSc. Ústav imunologie 2.LF UK, FN Motol

OBRANNÝ IMUNITNÍ SYSTÉM

Podrobný seznam vyšetření - imunologie

ZÁKLADNÍ DĚLENÍ IMUNOLOGICKÝCH LABORATORNÍCH VYŠETŘENÍ

Václav Hořejší Ústav molekulární genetiky AV ČR. IMUNITNÍ SYSTÉM vs. NÁDORY

Funkce imunitního systému. Imunodefekty. Biomedicínská technika a bioinformatika

Výskyt MHC molekul. RNDr. Ivana Fellnerová, Ph.D. ajor istocompatibility omplex. Funkce MHC glykoproteinů

Progrese HIV infekce z pohledu laboratorní imunologie

IMUNOFLUORESCENCE. Mgr. Petr Bejdák Ústav klinické imunologie a alergologie Fakultní nemocnice u sv. Anny a Lékařská fakulta MU

Laboratorní diagnostika v klinické imunologii Indikace a interpretace testů

RNDr. Ivana Fellnerová, Ph.D. Katedra zoologie PřF UP Olomouc

Příspěvek k hodnocení prognostického potenciálu indexu proliferace a apoptózy plazmatických buněk u mnohočetného myelomu

Teorie protinádorového dohledu Hlavní funkcí imunitního systému je boj proti infekcím

Atestační otázky z oboru alergologie a klinická imunologie

Podrobný seznam vyšetření - imunologie

1 Metody stanovení protilátek

IMUNOMUDULAČNÍ AKTIVITY IZOTONICKÉHO A HYPERTONICKÉHO ROZTOKU QUINTON

Komplementový systém a nespecifická imunita. Jana Novotná Ústav lékařské chemie a biochemie 2 LF UK

III/2- Inovace a zkvalitnění výuky prostřednictvím IVT

RADIOIMUNOANALÝZA (RADIOIMMUNOASSAY) Převzato: sciencephoto.com Test krve hepatitis virus

Antigeny. Hlavní histokompatibilitní komplex a prezentace antigenu

Likvor a jeho základní laboratorní vyšetření. Zdeňka Čermáková OKB FN Brno

IMUNOCHEMICKÉ METODY

K čemu slouží záznam provedených výkonů logbook?

Základy imunologických metod: interakce antigen-protilátka využití v laboratorních metodách

Vliv různých léčivých přípravků u pacientů s mnohočetným myelomem na laboratorní vyšetření

Imunologické laboratorní vyšetření

Imunitní systém člověka. Historie oboru Terminologie Členění IS

NÁLEZ DVOJITĚ POZITIVNÍCH T LYMFOCYTŮ - CO TO MŮŽE ZNAMENAT? Ondřej Souček Ústav klinické imunologie a alergologie Fakultní nemocnice Hradec Králové

Specifická imunita. Ond!ej Beran. Laborato! AIDS a bun"#né imunologie III. klinika infek#ních a tropick$ch nemocí 1. FK UK a FN Na Bulovce

Princip testu. Kdy se PAT provádí (1) Kdy se PAT provádí (2) PAT kvalitativní a kvantitativní stanovení na ID-gelových kartách

OBMI OKBHI Laboratorní příručka OKBHI Příloha č. 3 Podrobný seznam vyšetření - IMUNOLOGIE

Imunopatologie. Viz také video: 15-Imunopatologie.mov. -nepřiměřené imunitní reakce. - na cizorodé netoxické antigeny (alergie)

Fagocytóza je proces pohlcení a degradace částic větších než 0,5 µm.

Principy a instrumentace

SEZNAM LABORATORNÍCH VYŠETŘENÍ

K čemu slouží záznam provedených výkonů logbook?

ZÁVĚREČNÝ PROTOKOL O TESTOVÁNÍ BIOAKTIVNÍCH VLASTNOSTÍ LÁTKY CYTOPROTECT

Přínos metody ELISPOT v diagnostice lymeské boreliózy

ÚVOD DO TRANSPLANTAČNÍ IMUNOLOGIE

EUC Laboratoře s.r.o. EUC Laboratoře Praha Palackého 720/5, Praha 1

Tematické okruhy k SZZ v bakalářském studijním oboru Zdravotní laborant bakalářského studijního programu B5345 Specializace ve zdravotnictví

PŘEDČASNĚ NAROZENÝCH DĚTÍ

Subpopulace B lymfocytů v klinické imunologii

Výukové materiály:

Transkript:

Metody vyšetření imunity

Motto lab.vyš Cílem je nalézt abnormální funkci imunitního systému, která přináší vysvětlení příznaků/nemoci /nemocí Některé chybné funkce se nemusí projevovat onemocněním pacienta Některé příznaky/nemoc nemusí být provázeny zjistitelnou poruchou vždy je měřící metoda nedokonalá a málo přesná Technologie se intenzívně vyvíjejí a klinická věda má potíž se vyrovnat s jejich interpretací

Oblasti vyšetření imunity Buněčná imunita Zastoupení imunokompetentních buněk Počty buněk, subpopulací, prekurzorů Funkční testy změna fenotypu (membránový znak) při změně funkce (aktivaci) in vivo, in vitro Tvorba produktů buňky - Ig, cytokiny Změny v jaderném materiálu

Humorální složky imunity Imunoglobuliny, protilátky - specifické nespecifické proteiny akutní fáze systém komplemetu vyšetření séra (moč, mozkomíšní mok, patologické výpotky)

METODY VYŠETŘOVÁNÍ HUMORÁLNÍ IMUNITY aglutinace turbidimetrie a nefelometrie enzymoimunoanalýza (ELISA) elektroforéza, imunofixace, imunoblotting nepřímá imunofluorescence

Aglutinace princip: reakce mezi Ag a Ab se projeví tvorbou sraženiny viditelné pouhým okem (aglutinát) korpuskulární Ag (bakterie, Ag na nosiči) + vyšetřované sérum průkaz spec. protilátek hodnocení: kvalitativní (ano/ne), kvantitativní (titrace séra)

Množství precipitátu Imunoprecipitační metody princip: reakce mezi solubilním Ag a Ab se projeví tvorbou imunokomplexu (precipitátu) PRECIPITAČNÍ KŘIVKA Imunoprecipitační křivka Y Y nadbytek Ab ZÓNA EKVIVALENCE nadbytek Ag koncentrace antigenu konstantní množství protilátky

Radiální imunodifuze princip: reakce Ag a Ab v agarózovém gelu po difuzi (prstencový precipitát) gel s homogenním obsahem Ab + vyšetřované sérum průměr prstence úměrný množství Ag uplatnění: stanovení Ig

Turbidimetrie a nefelometrie princip: měření množství imunitních komplexů Ag-Ab při nadbytku Ab reakce v tekutém prostředí v kyvetě hodnocení: koncentrace Ag přímo úměrná - rychlosti tvorby zákalu (kinetický systém) - hustotě zákalu ( end point )

Nefelometrie precipitace v roztoku měří se intenzita světla odraženého od precipitátu kalibrační křivka

Turbidimetrie precipitace v roztoku měří se úbytek intenzity světla, které prošlo roztokem v kyvetě (absorbance precipitátu) kalibrační křivka

Uplatnění turbidimetrie a nefelometrie stanovení koncentrace sérových proteinů (imunoglobuliny, proteiny akutní fáze, složky komplementu C3, C4, transferin, albumin ) rychlé, plně automatizované metody pro velké série vzorků

Imunoreakce se značenými protilátkami RIA Ab značena radioizotopem EIA Ab značena enzymem detekce reakce dle povahy sbustrátu: fotometrie, fluorometrie, luminometrie, ELISA

Enzymová imunosorpční analýza (ELISA) protilátka konjugovaná s enzymem protilátky v testovaném vzorku substrát pro enzym barevný produkt

Stanovení optické density hodnocení: fotometricky čím intenzita barevné reakce, tím koncentrace stanovované látky OD koncentrace

Uplatnění ELISY Stanovení specifických IgE protilátek proti alergenům ELISA UniCAP alergen adsorbován na pevnou fázi (CNBr celulosa) reaguje s IgE v séru pacienta detekce sekundární protilátkou proti IgE značenou enzymem, hodnocení fluorescence

Elektroforéza dělení proteinů na základě pohyblivosti v elektrickém poli (podle náboje nebo velikosti) gel (agaróza, polyakrylamid)

Elektroforéza séra základní orientace v zastoupení krevních proteinů

Elektroforéza séra

Imunofixace (1) elektroforéza séra v několika drahách nanesení protilátek (anti-igg, -IgA, -IgM, -κ, - ) vytvoření precipitátu (např. imunokomplex= IgG+anti-IgG) barvení

Imunofixace (2)

Aplikace imunofixace detekce paraproteinu/monoklonálního Ig diagnostika monoklonálních gamapatií (mnohočetný myelom, makroglobulinémie, CLL, B-lymfom) paraprotein: syntetizovaný jedním klonem myelomových buněk (nádorově transformované B lymfocyty)

Imunoblotting (Western blot) 1) elektroforéza dělení dle velikosti 2) přenos proteinů z gelu na nitrocelulózovou membránu v elektrickém poli 3) imunodetekce: + vzorek séra + značená sekundární Ab (HRP) + substrát vznik barevné reakce

Uplatnění imunoblottingu průkaz přítomnosti Ab proti jednotlivým Ag (bakteriálním, autoantigenům, ) Borrelia burgdorferi detekce i několika Ab proti specifickým Ag najednou imunodot: komerční uměle čištěné nebo rekombinantní antigeny fixované na membráně

Imunodot

Autoprotilátky reagují se složkami vlastního organizmu fyziologicky: v nízkých koncentracích, věkem využívají se v diagnostice autoimunitních nemocí orgánově nespecifické (např. proti buněčnému jádru, mitochondriím, ) orgánově specifické (např. proti antigenům slinivky břišní)

Nepřímá imunofluorescence

ANA protilátky (anti-nuclear) reagují s jadernými antigeny (ds-dna, histony, jadérko, mitotický aparát, ) substrát: Hep 2 buňky nukleolární typ fluorescence (autoprotilátky proti jadérku) homogenní typ fluorescence (autoprotilátky proti ds-dna a histonům)

Vyšetření komplementu nefelometrie - stanovení koncentrace C3 a C4 indikace: geneticky podmíněný deficit, patogenetická úloha imunokomplexů inhibitor složky C1 indikace: podezření na deficit (dg. hereditárního angioedému)

Funkční testy komplementu CH 50 hemolytický test Princip: testované sérum + ovčí erythrocyty s navázanou Ab aktivace komplementu, lýza ery Hodnocení: spektrofotometricky měření absorbance uvolněného hemoglobinu, přímo úměrné počtu lyzovaných ery převrácená hodnota ředění séra, potřebné k vyvolání 50% hemolýzy

METODY DETEKCE BUNĚČNÉ IMUNITY Fenotypizace imunitních buněk - průtoková cytometrie metody stanovení funkční aktivity lymfocytů testy fagocytárních funkcí

Průtoková cytometrie (FACS) analýza jednotlivých buněk v suspenzi současné měření řady parametrů chemické, fyzikální a biologické vlastnosti buňky (ph, membránový potenciál, velikost, granularita, viabilita) exprese povrchových membránových molekul obsah DNA a jiných intracelulárních molekul selekce požadované buněčné populace (sortování)

Průtoková cytometrie Mnohoparametrový soubor dat o individuálních buňkách získávaný rychlostí 1000-2000 buněk / sec Exprese membránových znaků - imunofenotypizace Měření intracelulárních charakteristik - oxidativní vzplanutí, fosforylace proteinů, cytoplazmatická produkce cytokinů, buněčného cyklu

Průtokový cytometr PE PE-Cy7 FITC APC detektory fluorescence LASER FSC SSC označené buňky PC analýza

Izolace lymfocytů z krve gradientová centrifugace (oddělení buněk podle rozdílů v jejich hustotě)

Rozdělení leukocytů podle velikosti a granularity granulocyty scattergram monocyty lymfocyty

Značení buněk pro FACS PŘÍMÉ ZNAČENÍ NEPŘÍMÉ ZNAČENÍ excitace (laser) emise fluorescence emise fluorescence fluorochromem značená sekundární Ab/streptavidin fluorochromem značená mab membránový marker purifikovaná/biotinylovaná mab

Dvojbarevné značení CD8 PE dot plot CD4 FITC

Uplatnění FACS analýzy fenotypizace buněk (diagnostika primárních imunodeficitů, autoimunitních chorob, leukémií a lymfomů, monitorování pacientů po transplantaci) funkční testy leukocytů a trombocytů hodnocení spermatogeneze, detekce virů, bakterií a parazitů, vyšetření chromozomů, vyšetření aktivity enzymů, stanovení intracelulárního vápníku

Fenotypizace lymfocytů CD3+/CD4+ Th lymfocyty (52-69%) CD3+/CD8+ cytotoxické lymfocyty (27-46%) CD16+/CD56+ NK buňky (4-18%) CD19+ B lymfocyty (7-18%) diagnostika primárních imunodeficitů (SCID, Brutonova agamaglobulinemie) monitorování odpovědi na léčbu sekundárních imunodeficitů (HIV)

Funkční testy lymfocytů exprese aktivačních markerů proliferace cytotoxicita sekrece cytokinů tvorba protilátek

Sledování exprese aktivačních markerů časné aktivační markery (CD69) CD69 CD25, CD71 pozdní aktivační markery (VLA) CD4

CFSE Rovnoměrné rozdělení intracelulárních proteinů obarvených CFSE mezi dceřinné buňky

Proliferace lymfocytů (opakování) rozeznání nativního antigenu (BCR) + kostimulační signál od Th2 lymfocytů (IL-4, 5, CD40L) rozeznání komplexů antigenních peptidů s MHC I/II na povrchu APC buněk (TCR) + kostimulační signál (IL-4/12, CD80/86)

Proliferační testy (1) 3 H- tymidinový test kultivace izolovaných lymfocytů v médiu se stimulačními látkami (3-7 dní/37 C) inkubace s radioaktivně značeným tymidinem ( 3 H) inkorporace 3 H- tymidinu do DNA proliferujících lymfocytů detekce -záření ( -counter) čím proliferace tím naměřená radioaktivita

Látky stimulující proliferaci lymfocytů antigeny aktivují paměťové buňky vytvořené po očkování tetanický toxoid, tuberkulin jsou nutné APC monoklonální protilátky aktivace celé populace T lymfocytů anti-cd3, anti-tcr

Látky nespecificky stimulující proliferaci lymfocytů mitogeny rostlinné lektiny (vazba na sacharidy) ConA, PHA (T lymfocyty) PWM (B lymfocyty) LPS (B lymfocyty) superantigeny stafylokokové proteiny produkty onkogenních retrovirů

Cytotoxické mechanismy Tc a NK buněk (opakování) FasL - Fas TNF - TNFR TNFR granzymy TNF perforiny, granzymy CTL ADCC (NK buňky) nádorová buňka

Cytotoxické testy vyšetření schopnosti T lymfocytů a NK buněk zabíjet cílové buňky (nádorové, virem infikované) test založený na uvolňovaní radioaktivně značeného chromu ( 51 Cr) z nádorových buněk vitální barvení nádorových buněk mikroskopické nebo cytometrické vyhodnocení

Provedení testu s 51 Cr izolované lymfocyty + inkubace (37 C/3,5h) nádorové buňky inkubované s 51 Cr Výpočet % cytotoxické aktivity 100x (aktivita vzorku-spon)/(max-spon) 51 Cr detekce -záření v supernatantu

Stanovení sekrece cytokinů ELISA intracelulární stanovení průtokovým cytometrem ELISPOT detekce a kvantifikace T lymfocytů reagujících na antigenní podnět sekrecí konkrétních cytokinů počet spotů v jamce = počet buněk sekretujících cytokiny

Uplatnění funkčních testů lymfocytů diagnostika SCID diagnostika a prognostika zhoubných nádorů monitorování buněčné imunity (sekundární imunodeficity, traumata, sepse, pooperační stavy) monitorování rozvoje štěpu po transplantaci kostní dřeně testování nových léků (farmakologie, protinádorová imunoterapie)

Fagocytóza (opakování) fagocytující buňky neutrofily, eozinofily, monocyty, makrofágy fagocytované částice bakterie, pozůstatky vlastních buněk organismu fáze fagocytózy diapedéza, chemotaxe, rozpoznání, ingesce, usmrcení a destrukce částic určených k fagocytóze

Testy fagocytárních funkcí stanovení exprese adhezívních molekul testování chemotaxe fagocytóza baktericidní test testy oxidačního vzplanutí

Testování chemotaxe fagocytů suspenze testovaných buněk médium médium chemotaxin (fmlp)

Fagocytóza (1) vyšetření fáze ingesce substrát Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, polymerové partikule suspenze partikul nebo kvasinek + plná krev (inkubace 37 C/1hod) zhotovení krevního nátěru fixace a barvení odečítání ve světelném mikroskopu

Fagocytóza (2) hodnocení 100 buněk, pozitivní obsahují 3 a více pohlcených částic fagocytární aktivita % fagocytů s pohlcenými částicemi ze všech fagocytujících buněk fagocytární index průměrný počet částic pohlcených jednou buňkou

Baktericidní test vyšetření fáze usmrcení pohlcené částice substrát Staphylococus aureus, Candida albicans inkubace plné krve s mikroorganismy (37 C/1hod) hodnocení mikroskopicky (vitální barvení trypanovou modří) cytometricky (vitální barvení PI, Hoechst) očkování na plotny (počítání narostlých kolonií)

Testy oxidačního vzplanutí (1) vyšetření schopnosti fagocytů tvořit kyslíkové radikály (aktivace NADPH oxidázy) testy využívající průtokovou cytometrii plná krev + forbolové estery + dihydrorhodamin vznik rhodaminu (působení kyslíkových radikálů) měření intenzity fluorescence

Principy studií aktivovaných bazofilů Anafylaktická degranulace bazofilů rychlé morfologické změny, exocytoza IC granulí a uvolnění preformovaných mediátorů Piecemeal degranulace pomalé morfologické změny bez degranulace CD63, CD203c, CRTH2-FITC /CD203c-PE/CD3-PC7 CD69, Cd107a, CD123, CD 164, basogranulin a další... Detekce mediátorů a enzymů CD63 CD203c synonymum gp53, lysosyme-associated membrane protein (LAMP)-3 Rodina transmembránový znak typu 4, tetraspanin diferenciační Ag povrchu neuronů E-NPP3 pyrofosfatáza /fosfodiesteráza E-NPP3 Klidové bazofily Velmi vzácně Konstitutivně přítomné IgE aktiv. bazofily Zvýšení během 10 min, vysoká exprese (1 log) Méne výrazný vzestup exprese