Metody vyšetření imunity
Motto lab.vyš Cílem je nalézt abnormální funkci imunitního systému, která přináší vysvětlení příznaků/nemoci /nemocí Některé chybné funkce se nemusí projevovat onemocněním pacienta Některé příznaky/nemoc nemusí být provázeny zjistitelnou poruchou vždy je měřící metoda nedokonalá a málo přesná Technologie se intenzívně vyvíjejí a klinická věda má potíž se vyrovnat s jejich interpretací
Oblasti vyšetření imunity Buněčná imunita Zastoupení imunokompetentních buněk Počty buněk, subpopulací, prekurzorů Funkční testy změna fenotypu (membránový znak) při změně funkce (aktivaci) in vivo, in vitro Tvorba produktů buňky - Ig, cytokiny Změny v jaderném materiálu
Humorální složky imunity Imunoglobuliny, protilátky - specifické nespecifické proteiny akutní fáze systém komplemetu vyšetření séra (moč, mozkomíšní mok, patologické výpotky)
METODY VYŠETŘOVÁNÍ HUMORÁLNÍ IMUNITY aglutinace turbidimetrie a nefelometrie enzymoimunoanalýza (ELISA) elektroforéza, imunofixace, imunoblotting nepřímá imunofluorescence
Aglutinace princip: reakce mezi Ag a Ab se projeví tvorbou sraženiny viditelné pouhým okem (aglutinát) korpuskulární Ag (bakterie, Ag na nosiči) + vyšetřované sérum průkaz spec. protilátek hodnocení: kvalitativní (ano/ne), kvantitativní (titrace séra)
Množství precipitátu Imunoprecipitační metody princip: reakce mezi solubilním Ag a Ab se projeví tvorbou imunokomplexu (precipitátu) PRECIPITAČNÍ KŘIVKA Imunoprecipitační křivka Y Y nadbytek Ab ZÓNA EKVIVALENCE nadbytek Ag koncentrace antigenu konstantní množství protilátky
Radiální imunodifuze princip: reakce Ag a Ab v agarózovém gelu po difuzi (prstencový precipitát) gel s homogenním obsahem Ab + vyšetřované sérum průměr prstence úměrný množství Ag uplatnění: stanovení Ig
Turbidimetrie a nefelometrie princip: měření množství imunitních komplexů Ag-Ab při nadbytku Ab reakce v tekutém prostředí v kyvetě hodnocení: koncentrace Ag přímo úměrná - rychlosti tvorby zákalu (kinetický systém) - hustotě zákalu ( end point )
Nefelometrie precipitace v roztoku měří se intenzita světla odraženého od precipitátu kalibrační křivka
Turbidimetrie precipitace v roztoku měří se úbytek intenzity světla, které prošlo roztokem v kyvetě (absorbance precipitátu) kalibrační křivka
Uplatnění turbidimetrie a nefelometrie stanovení koncentrace sérových proteinů (imunoglobuliny, proteiny akutní fáze, složky komplementu C3, C4, transferin, albumin ) rychlé, plně automatizované metody pro velké série vzorků
Imunoreakce se značenými protilátkami RIA Ab značena radioizotopem EIA Ab značena enzymem detekce reakce dle povahy sbustrátu: fotometrie, fluorometrie, luminometrie, ELISA
Enzymová imunosorpční analýza (ELISA) protilátka konjugovaná s enzymem protilátky v testovaném vzorku substrát pro enzym barevný produkt
Stanovení optické density hodnocení: fotometricky čím intenzita barevné reakce, tím koncentrace stanovované látky OD koncentrace
Uplatnění ELISY Stanovení specifických IgE protilátek proti alergenům ELISA UniCAP alergen adsorbován na pevnou fázi (CNBr celulosa) reaguje s IgE v séru pacienta detekce sekundární protilátkou proti IgE značenou enzymem, hodnocení fluorescence
Elektroforéza dělení proteinů na základě pohyblivosti v elektrickém poli (podle náboje nebo velikosti) gel (agaróza, polyakrylamid)
Elektroforéza séra základní orientace v zastoupení krevních proteinů
Elektroforéza séra
Imunofixace (1) elektroforéza séra v několika drahách nanesení protilátek (anti-igg, -IgA, -IgM, -κ, - ) vytvoření precipitátu (např. imunokomplex= IgG+anti-IgG) barvení
Imunofixace (2)
Aplikace imunofixace detekce paraproteinu/monoklonálního Ig diagnostika monoklonálních gamapatií (mnohočetný myelom, makroglobulinémie, CLL, B-lymfom) paraprotein: syntetizovaný jedním klonem myelomových buněk (nádorově transformované B lymfocyty)
Imunoblotting (Western blot) 1) elektroforéza dělení dle velikosti 2) přenos proteinů z gelu na nitrocelulózovou membránu v elektrickém poli 3) imunodetekce: + vzorek séra + značená sekundární Ab (HRP) + substrát vznik barevné reakce
Uplatnění imunoblottingu průkaz přítomnosti Ab proti jednotlivým Ag (bakteriálním, autoantigenům, ) Borrelia burgdorferi detekce i několika Ab proti specifickým Ag najednou imunodot: komerční uměle čištěné nebo rekombinantní antigeny fixované na membráně
Imunodot
Autoprotilátky reagují se složkami vlastního organizmu fyziologicky: v nízkých koncentracích, věkem využívají se v diagnostice autoimunitních nemocí orgánově nespecifické (např. proti buněčnému jádru, mitochondriím, ) orgánově specifické (např. proti antigenům slinivky břišní)
Nepřímá imunofluorescence
ANA protilátky (anti-nuclear) reagují s jadernými antigeny (ds-dna, histony, jadérko, mitotický aparát, ) substrát: Hep 2 buňky nukleolární typ fluorescence (autoprotilátky proti jadérku) homogenní typ fluorescence (autoprotilátky proti ds-dna a histonům)
Vyšetření komplementu nefelometrie - stanovení koncentrace C3 a C4 indikace: geneticky podmíněný deficit, patogenetická úloha imunokomplexů inhibitor složky C1 indikace: podezření na deficit (dg. hereditárního angioedému)
Funkční testy komplementu CH 50 hemolytický test Princip: testované sérum + ovčí erythrocyty s navázanou Ab aktivace komplementu, lýza ery Hodnocení: spektrofotometricky měření absorbance uvolněného hemoglobinu, přímo úměrné počtu lyzovaných ery převrácená hodnota ředění séra, potřebné k vyvolání 50% hemolýzy
METODY DETEKCE BUNĚČNÉ IMUNITY Fenotypizace imunitních buněk - průtoková cytometrie metody stanovení funkční aktivity lymfocytů testy fagocytárních funkcí
Průtoková cytometrie (FACS) analýza jednotlivých buněk v suspenzi současné měření řady parametrů chemické, fyzikální a biologické vlastnosti buňky (ph, membránový potenciál, velikost, granularita, viabilita) exprese povrchových membránových molekul obsah DNA a jiných intracelulárních molekul selekce požadované buněčné populace (sortování)
Průtoková cytometrie Mnohoparametrový soubor dat o individuálních buňkách získávaný rychlostí 1000-2000 buněk / sec Exprese membránových znaků - imunofenotypizace Měření intracelulárních charakteristik - oxidativní vzplanutí, fosforylace proteinů, cytoplazmatická produkce cytokinů, buněčného cyklu
Průtokový cytometr PE PE-Cy7 FITC APC detektory fluorescence LASER FSC SSC označené buňky PC analýza
Izolace lymfocytů z krve gradientová centrifugace (oddělení buněk podle rozdílů v jejich hustotě)
Rozdělení leukocytů podle velikosti a granularity granulocyty scattergram monocyty lymfocyty
Značení buněk pro FACS PŘÍMÉ ZNAČENÍ NEPŘÍMÉ ZNAČENÍ excitace (laser) emise fluorescence emise fluorescence fluorochromem značená sekundární Ab/streptavidin fluorochromem značená mab membránový marker purifikovaná/biotinylovaná mab
Dvojbarevné značení CD8 PE dot plot CD4 FITC
Uplatnění FACS analýzy fenotypizace buněk (diagnostika primárních imunodeficitů, autoimunitních chorob, leukémií a lymfomů, monitorování pacientů po transplantaci) funkční testy leukocytů a trombocytů hodnocení spermatogeneze, detekce virů, bakterií a parazitů, vyšetření chromozomů, vyšetření aktivity enzymů, stanovení intracelulárního vápníku
Fenotypizace lymfocytů CD3+/CD4+ Th lymfocyty (52-69%) CD3+/CD8+ cytotoxické lymfocyty (27-46%) CD16+/CD56+ NK buňky (4-18%) CD19+ B lymfocyty (7-18%) diagnostika primárních imunodeficitů (SCID, Brutonova agamaglobulinemie) monitorování odpovědi na léčbu sekundárních imunodeficitů (HIV)
Funkční testy lymfocytů exprese aktivačních markerů proliferace cytotoxicita sekrece cytokinů tvorba protilátek
Sledování exprese aktivačních markerů časné aktivační markery (CD69) CD69 CD25, CD71 pozdní aktivační markery (VLA) CD4
CFSE Rovnoměrné rozdělení intracelulárních proteinů obarvených CFSE mezi dceřinné buňky
Proliferace lymfocytů (opakování) rozeznání nativního antigenu (BCR) + kostimulační signál od Th2 lymfocytů (IL-4, 5, CD40L) rozeznání komplexů antigenních peptidů s MHC I/II na povrchu APC buněk (TCR) + kostimulační signál (IL-4/12, CD80/86)
Proliferační testy (1) 3 H- tymidinový test kultivace izolovaných lymfocytů v médiu se stimulačními látkami (3-7 dní/37 C) inkubace s radioaktivně značeným tymidinem ( 3 H) inkorporace 3 H- tymidinu do DNA proliferujících lymfocytů detekce -záření ( -counter) čím proliferace tím naměřená radioaktivita
Látky stimulující proliferaci lymfocytů antigeny aktivují paměťové buňky vytvořené po očkování tetanický toxoid, tuberkulin jsou nutné APC monoklonální protilátky aktivace celé populace T lymfocytů anti-cd3, anti-tcr
Látky nespecificky stimulující proliferaci lymfocytů mitogeny rostlinné lektiny (vazba na sacharidy) ConA, PHA (T lymfocyty) PWM (B lymfocyty) LPS (B lymfocyty) superantigeny stafylokokové proteiny produkty onkogenních retrovirů
Cytotoxické mechanismy Tc a NK buněk (opakování) FasL - Fas TNF - TNFR TNFR granzymy TNF perforiny, granzymy CTL ADCC (NK buňky) nádorová buňka
Cytotoxické testy vyšetření schopnosti T lymfocytů a NK buněk zabíjet cílové buňky (nádorové, virem infikované) test založený na uvolňovaní radioaktivně značeného chromu ( 51 Cr) z nádorových buněk vitální barvení nádorových buněk mikroskopické nebo cytometrické vyhodnocení
Provedení testu s 51 Cr izolované lymfocyty + inkubace (37 C/3,5h) nádorové buňky inkubované s 51 Cr Výpočet % cytotoxické aktivity 100x (aktivita vzorku-spon)/(max-spon) 51 Cr detekce -záření v supernatantu
Stanovení sekrece cytokinů ELISA intracelulární stanovení průtokovým cytometrem ELISPOT detekce a kvantifikace T lymfocytů reagujících na antigenní podnět sekrecí konkrétních cytokinů počet spotů v jamce = počet buněk sekretujících cytokiny
Uplatnění funkčních testů lymfocytů diagnostika SCID diagnostika a prognostika zhoubných nádorů monitorování buněčné imunity (sekundární imunodeficity, traumata, sepse, pooperační stavy) monitorování rozvoje štěpu po transplantaci kostní dřeně testování nových léků (farmakologie, protinádorová imunoterapie)
Fagocytóza (opakování) fagocytující buňky neutrofily, eozinofily, monocyty, makrofágy fagocytované částice bakterie, pozůstatky vlastních buněk organismu fáze fagocytózy diapedéza, chemotaxe, rozpoznání, ingesce, usmrcení a destrukce částic určených k fagocytóze
Testy fagocytárních funkcí stanovení exprese adhezívních molekul testování chemotaxe fagocytóza baktericidní test testy oxidačního vzplanutí
Testování chemotaxe fagocytů suspenze testovaných buněk médium médium chemotaxin (fmlp)
Fagocytóza (1) vyšetření fáze ingesce substrát Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, polymerové partikule suspenze partikul nebo kvasinek + plná krev (inkubace 37 C/1hod) zhotovení krevního nátěru fixace a barvení odečítání ve světelném mikroskopu
Fagocytóza (2) hodnocení 100 buněk, pozitivní obsahují 3 a více pohlcených částic fagocytární aktivita % fagocytů s pohlcenými částicemi ze všech fagocytujících buněk fagocytární index průměrný počet částic pohlcených jednou buňkou
Baktericidní test vyšetření fáze usmrcení pohlcené částice substrát Staphylococus aureus, Candida albicans inkubace plné krve s mikroorganismy (37 C/1hod) hodnocení mikroskopicky (vitální barvení trypanovou modří) cytometricky (vitální barvení PI, Hoechst) očkování na plotny (počítání narostlých kolonií)
Testy oxidačního vzplanutí (1) vyšetření schopnosti fagocytů tvořit kyslíkové radikály (aktivace NADPH oxidázy) testy využívající průtokovou cytometrii plná krev + forbolové estery + dihydrorhodamin vznik rhodaminu (působení kyslíkových radikálů) měření intenzity fluorescence
Principy studií aktivovaných bazofilů Anafylaktická degranulace bazofilů rychlé morfologické změny, exocytoza IC granulí a uvolnění preformovaných mediátorů Piecemeal degranulace pomalé morfologické změny bez degranulace CD63, CD203c, CRTH2-FITC /CD203c-PE/CD3-PC7 CD69, Cd107a, CD123, CD 164, basogranulin a další... Detekce mediátorů a enzymů CD63 CD203c synonymum gp53, lysosyme-associated membrane protein (LAMP)-3 Rodina transmembránový znak typu 4, tetraspanin diferenciační Ag povrchu neuronů E-NPP3 pyrofosfatáza /fosfodiesteráza E-NPP3 Klidové bazofily Velmi vzácně Konstitutivně přítomné IgE aktiv. bazofily Zvýšení během 10 min, vysoká exprese (1 log) Méne výrazný vzestup exprese