UPLATNĚNÁ CERTIFIKOVANÁ METODIKA

Fakulta potravinářské a biochemické technologie Ústav analýzy potravin a výživy UPLATNĚNÁ CERTIFIKOVANÁ METODIKA Jana Hajšlová, Zdenka Vepříková, Marta Václavíková, Milena Zachariášová Stanovení mykotoxinů v semeni máku Praha, červenec 2012

Dedikace: Uplatněná certifikovaná metodika vznikla za finanční podpory Ministerstva zemědělství České republiky v rámci řešení projektu č. QH 92106. Jana Hajšlová, Zdenka Vepříková, Marta Václavíková, Milena Zachariášová, 2012 ISBN 978-80-7080-827-6

OBSAH 1. CÍL METODIKY... 4 2. TEORETICKÝ ÚVOD... 5 3. VLASTNÍ POPIS METODIKY... 6 3.1. Použitelnost metody... 6 3.2. Princip metody... 7 3.3. Bezpečnost práce... 7 3.4. Chemikálie a spotřební materiál... 8 3.5. Přístroje a zařízení... 9 3.6. Pracovní postup... 9 3.6.1. Příprava zásobních roztoků standardů... 9 3.6.2. Příprava kalibračních roztoků matričních standardů... 10 3.6.3. Homogenizace vzorků... 11 3.6.4. Extrakce a přečištění vzorků... 11 3.7. Identifikace a kvantifikace... 11 3.7.1. Kapalinová chromatografie... 12 3.7.2. Hmotnostní spektrometrie... 15 3.7.3. Identifikace a kvantitativní vyhodnocení analytů... 17 3.7.4. Výpočet koncentrace analytů ve vzorku... 17 3.8. Pracovní charakteristiky metody... 18 3.8.1. Správnost metody... 18 3.8.2. Rozsah metody a linearita... 18 3.8.3. Mez stanovitelnosti (LOQ)... 18 3.8.4. Opakovatelnost metody... 19 4. SROVNÁNÍ NOVOSTI POSTUPU... 21 5. POPIS UPLATNĚNÍ CERTIFIKOVANÉ METODIKY... 22 6. EKONOMICKÉ ASPEKTY... 23 7. SEZNAM SOUVISEJÍCÍ POUŽITÉ LITERATURY... 24 8. SEZNAM PUBLIKACÍ, KTERÉ PŘEDCHÁZELI METODICE... 25 9. AUTOŘI A OPONENTI... 26

1. CÍL METODIKY Dílčím cílem projektu QH 92106 podporovaného Ministerstvem zemědělství České republiky bylo vyvinout, optimalizovat a validovat novou analytickou metodu pracující na základě citlivého moderního systému UHPLC-MS/MS, která je vhodná pro stanovení širokého spektra mykotoxinů v semeni máku. Vypracovaná metodika bude dále předána pracovníkům laboratoří Státní zemědělské a potravinářské inspekce (SZPI), která bude tento laboratorní postup dále používat při analýze a kontrole komerčních vzorků semen máku. 4

2. TEORETICKÝ ÚVOD Mykotoxiny jsou toxické sekundární metabolity vláknitých hub (plísní). Jedná se o široké spektrum látek, jejichž nejčastějšími producenty v klimatických podmínkách České republiky jsou plísně rodu Fusarium, Alternaria, Penicillium a Aspergillus. Tyto přírodní kontaminanty významnou měrou ovlivňují hygienicko-toxikologickou, ale i technologickou kvalitu potravin rostlinného původu a to zejména cereálií, ovoce a jejich potravinářských produktů. V posledních letech byla pozornost zemědělců zaměřena na produkci máku, který se stal významným vývozním artiklem. Zatímco pro některé mykotoxiny jsou legislativně stanoveny jejich maximální limity ve vybraných potravinářských komoditách jako jsou obiloviny, jablka, oříšky, káva (např. COMMISSION REGULATION EC No 1881/2006 of 19 December 2006 setting maximum levels for certain contaminants in foodstuffs ), pro mák žádné hygienické limity stanoveny nejsou. Hlavním důvodem, je nedostatek dat podávajících informaci o míře mykotoxinové kontaminace máku, na základě kterých by mohl být obsah mykotoxinů v máku legislativně stanoven. S tím také souvisí problém dostupnosti vhodných metod pro stanovení těchto přírodních toxinů s co nejvyšší citlivostí. V České republice se vzhledem k absenci hygienických limitů mykotoxiny v máku dosud rutinně nesledovaly. Co se týče kontaminace máku mykotoxiny, nejsou v současné době dostupné žádné relevantní publikace týkající se této problematiky. Obecně lze konstatovat, že problematika výskytu mykotoxinů v potravinách je pro EU jednou z priorit z pohledu chemické bezpečnosti potravin. Dokumenty EU zabývající se danou problematikou zdůrazňují nutnost zavedení citlivých analytických metod pro monitoring a kontrolu celé řady mykotoxinů v různých potravinářských komoditách. V posledních letech získaly popularitu různé multimykotoxinové metody, které spočívají v jednoduché přípravě vzorku a následné identifikaci a kvantifikaci za pomoci sofistikované instrumentace jako je např. spojení ultraúčinné kapalinové chromatografie s tandemovou hmotnostní spektrometrií UHPLC-MS/MS. Takto je možné stanovit široké spektrum analytů v rámci jedné analýzy. 5

3. VLASTNÍ POPIS METODIKY 3.1. Použitelnost metody Analytická metoda je určena pro stanovení širokého spektra mykotoxinů (trichotheceny, altertoxiny, aflatoxiny, enniatiny, námelové alkaloidy a ostatní jako zearalenon a jeho metabolity, ochratoxin A) v semeni máku. Souhrnný seznam analytů je uveden v Tabulce I.. Tabulka I: Přehled stanovovaných analytů 6

3.2. Princip metody Mykotoxiny uvedené v Tabulce I mají velmi široké rozmezí fyzikálně-chemických vlastností. Proto je pro jejich extrakci / purifikaci využívána metoda QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe), která umožňuje snadné, efektivní a rychlé stanovení všech uvedených látek najednou v rámci jedné analýzy a přípravy vzorku. Extrakčním činidlem je směs acetonitrilu a 0,1% kyseliny mravenčí. Po extrakčním kroku následuje vysolení analytů do acetonitrilové fáze intenzivním třepáním vzorku s NaCl a MgSO4 a centrifugace. S ohledem na vyšší obsah tuku v matrici byl zařazen purifikační krok disperzní SPE zajišťující oddělení nepolárních látek z acetonitrilového extraktu matrice. Alikvotní podíl organické fáze acetonitrilu je přečištěn sorbentem Bondesil (modifikovaný C18 silikagel). Vzorek je následně centrifugován a pomocí vysoko-účinné kapalinové chromatografie ve spojení s tandemovou hmotnostní spektrometrí (UHPLC-MS/MS) analyzován. 3.3. Bezpečnost práce S kontaminovanými vzorky a standardy mykotoxinů je třeba pracovat jako s toxickými látkami (tj. látkami, které po vdechnutí, požití nebo proniknutí kůží mohou i v malém množství způsobit akutní nebo chronické poškození zdraví nebo smrt). Od přípravy vzorků až po UHPLC-MS/MS stanovení je nutno pracovat v gumových rukavicích. Všechny pracovní pomůcky včetně skla, které přišly do styku se standardy nebo roztoky mykotoxinů musí být dekontaminovány v roztoku chlornanu sodného. Zbytky standardních roztoků a vzorků po analýze jsou ukládány samostatně a po dekontaminaci roztokem chlornanu sodného likvidovány. Pozn.: Při přípravě vzorků (až po stanovení kapalinovou chromatografií)) je třeba pracovat v gumových rukavicích. Zbytky standardních roztoků a vzorků (vyextrahované původní vzorky i roztoky vzorků po HPLC analýze) jsou dekontaminovány v roztoku chlornanu sodného (0,25% NaClO / 0,025 M NaOH). 7

3.4. Chemikálie a spotřební materiál 1 acetonitril, HPLC gradient, Sigma-Aldrich (USA) deionizovaná voda (přečištěná z destilované vody pomocí zařízení Milli-Q, Millipore, Německo) aceton (p.a., Lachema Brno, Česká republika, čerstvě redestilovaný) methanol (Lichrosolv, gradient grade, for chromatography, Merck, Německo) octan amonný, 99,99%, Sigma-Aldrich (USA) kyselina mravenčí 85%, Penta, Crudim (ČR) mravenčan amonný 99%, Sigma Aldrich (USA) chlornan sodný, Penta, Chrudim, (ČR) chlorid sodný (NaCl) 99,5%, Sigma Aldrich (USA) síran hořečnatý (MgSO 4 ) 98%, Sigma-Aldrich (USA) Bondesil, C-18 sorbent, 40 µm, Agilent Technologies (USA) mikrofiltry 0,2µm, Alltech (USA) dusík (99.994 %) - Technoplyn (ČR) dávkovač Finnpipette Dispenser 5,0-30,0ml (USA) automatická mikropipeta, 0,5-5 ml, TreffLab (Švýcarsko) automatické mikropipety, 100 1000 a 20-200 µl, 10 ml, Biohit (Německo) mikrostříkačky o objemu 10, 100, 250 a 500 l, Hamilton (USA) běžné laboratorní sklo a vybavení plastové (PTFE) odměrné baňky plastové vialky (PTFE) s konickým dnem, víčka, septa plastové (PTFE) kyvety o objemu 50 ml a 15 ml certifikované standardy analytů uvedených v Tabulce I, Biopure (Rakousko, dodavatel Dynex s.r.o.), Sigma Aldrich (USA) 1 Validace metody byla provedena s uvedenými chemikáliemi; lze však použít i jiného dodavatele za předpokladu, že kvalita bude odpovídající. 8

3.5. Přístroje a zařízení mlýnek na mák Jihokov (Česká republika) laboratorní třepačka, model HS 250 basic, IKA Laboratortechnik (Německo) elektronické váhy, model HF-1200G, A&D Instruments LTD (Japonsko) analytické váhy, model GR-202, A&D Instruments LTD (Japonsko) centrifuga Rotina 35R, Hettich (Německo) přístroj pro přípravu deionizované vody Milli-Q, Millipore (Německo) LC-MS instrumentace - vysokoúčinný kapalinový chromatograf ACQUITY UPLC, Waters (USA) - kolona Acquity UPLC HSS T3 (100 mm 2,1 mm i.d., 1,8 μm), Waters (USA) - hmotnostní spektrometr QTRAP 5500 Systems, AB SCIEX TM (USA) 3.6. Pracovní postup 3.6.1. Příprava zásobních roztoků standardů Standardy jsou od výrobců dodávány buď v roztoku acetonitrilu, nebo jako pevné látky viz. Tabulka I. Pevné standardy jsou před použitím rozpuštěny v acetonitrilu či methanolu a spolu s kapalnými standardy jsou skladovány při teplotě -18 C. Základní roztoky standardů a jejich koncentrace jsou uvedeny v Tabulce II. Z těchto základních roztoků standardů jsou připraveny tři základní pracovní směsi standardů A - C v acetonitrilu, jejich koncentrace jsou uvedeny také v Tabulce II. Z uvedených tří pracovních směsí standardů je připraven pracovní roztok D o koncentraci 1000 ng/ml, který je dále použit k přípravě kalibračních řad matričních a rozpouštědlových standardů a pro cílenou kontaminaci vzorků za účelem zjištění validačních charakteristik využitých metod. Pro přípravu 25 ml pracovního standardu je do odměrné baňky odebráno 2,5 ml směsi standardu A, 5 ml směsi B a 12,5 ml směsi C a doplněno acetonitrilem po rysku. 9

Tabulka II: Přehled zásobních standardů analytů a jejich ředění pro přípravu pracovních standardů. Mykotoxin koncentrace standardu [µg/ml] pracovní směs A (10 µg/ml) přídavek zás. std [µl] pracovní směs B (5 µg/ml) přídavek zás. std [µl] pracovní směs C (2 µg/ml) přídavek zás. std [µl] aflatoxin B1 1000 100 x x aflatoxin G1 1000 100 x x aflatoxin B2 1000 100 x x aflatoxin G2 1000 100 x x nivalenol 500 200 x x deoxynivalenol 1000 100 x x DON-3-Glukosid 50 2000 x x 3-acetyldeoxynivalenol 1000 100 x x fusarenon X 1000 100 x x HT-2 toxin 100 1000 x x T-2 toxin 1000 100 x x neosolaniol 1000 100 x x diacetoxyscirpenol 100 1000 x x ochratoxin A 1000 100 x x zearalenon 1000 100 x x alfa-zearalenol 1000 100 x x beta-zearalenol 1000 100 x x sterigmatocystin 1000 100 x x alternariol 1000 100 x x alternariol-methylether 500 200 x x altenuen 200 500 x x enniatin A 100 x 500 x enniatin B 100 x 500 x enniatin A1 100 x 500 x enniatin B1 100 x 500 x ergosin 100 x x 500 ergokristin 100 x x 500 ergokristinin 25 x x 2000 ergokornin 100 x x 500 ergokorninin 25 x x 2000 ergokryptin 100 x x 500 ergokryptinin 25 x x 2000 ergotamin 100 x x 500 agroklavin 100 x x 500 3.6.2. Příprava kalibračních roztoků matričních standardů Matriční směsné standardy sledovaných analytů (body kalibrační křivky) o koncentracích 0 až 500 ng/ml jsou připraveny odebráním vypočítaných objemů z pracovního standardu D obsahujícího všechny mykotoxiny do vialek, odfoukáním acetonitrilu jemným proudem dusíku a rozpuštěním v 1 ml blankového extraktu (tj. extraktu vzorku, který neobsahuje mykotoxiny). Kalibrační roztoky čistých i matričních standardů byly uchovány v mrazáku při teplotě -18 C. 10

3.6.3. Homogenizace vzorků Laboratorní vzorek semen máku je homogenizován elektrickým mlýnkem na mák a před odběrem navážky důkladně promíchán. 3.6.4. Extrakce a přečištění vzorků Postup spočívá v navážení 2 g homogenizovaného vzorku semen máku, které jsou extrahovány směsí 10 ml 0,1% HCOOH a 10 ml acetonitrilu po dobu 30 minut na třepačce při 240 rpm. Následně je přidán 1 g NaCl a 4 g MgSO 4. Tato směs je třepána 3 min v ruce (díky exotermní reakci solí s vodou se vzorek samovolně zahřívá) a poté centrifugována po dobu 10 min při 15000 x g, díky čemuž dojde k oddělení jednotlivých fází extraktu. Cílové analyty jsou vysoleny do horní acetonitrilové vrstvy, zatímco polární matriční koextrakty (např. cukry nebo aminokyseliny) zůstanou ve fázi vodné. Alikvotní podíl 2 ml organické fáze acetonitrilu je převeden do nové kyvety a následně je k němu přidáno 100 mg sorbentu Bondesil (modifikovaný C18 silikagel) a 300 mg síranu hořečnatého. Tato směs je třepána po dobu 1 min a následně centrifugována po dobu 2 min při 7435 x g. Alikvotní podíl 1 ml je filtrován přes mikrofiltr a odebrán do vialky. 1 ml finálního vzorku připraveného tímto způsobem obsahuje 0,2 g původní matrice. Takto připravený vzorek je připraven k analýze. Vzorky ve vialkách jsou před analýzou skladovány v mrazícím boxu při -18 C. 3.7. Identifikace a kvantifikace Pro kvantitativní stanovení sledovaných analytů je použita metoda vysokoúčinné kapalinové chromatografie ve spojení s tandemovou hmotnostní detekcí (UPLC-MS/MS) s využitím kapalinového chromatografu Acquity UPLC (Waters) a hmotnostního spektrometru QTRAP 5500 (AB SCIEX TM ). Díky širokému rozmezí fyzikálně-chemických vlastností mykotoxinů jsou analyty rozděleny do dvou skupin (pozitivní a negativní ESI ionizace) na základě jejich optimálních parametrů pro MS/MS stanovení. Každý vzorek je tedy analyzován paralelně dvakrát, jednou v ESI+ a ESI- módu s využitím různých podmínek nastavení kapalinové chromatografie i hmotnostní detekce. 11

3.7.1. Kapalinová chromatografie Separace analytů je prováděna za podmínek dále popsané kapalinové chromatografie na koloně Acquity UPLC HSS T3 (Waters). Pro analyty ionizující v ESI+ a ESI- módu je použito jiné složení mobilní fáze i jiné nastavení gradientu. Mobilní fáze Příprava mobilní fáze: i) pro analyty měřené v negativním módu - redestilovaná voda je získána přečištěním z destilované vody pomocí zařízení Milli-Q - 5 mm vodný roztok octanu amonného se získá rozpuštěním 0,3854 g octanu amonného v 1 l redestilované vody - čistý methanol je do systému čerpán přímo z originální láhve od výrobce ii) pro analyty měřené v pozitivním módu - 5 mm kyselý roztok mravenčanu amonného se získá rozpuštěním 0,3125 g mravenčanu amonného v 1 l 0,2% kyseliny mravenčí - kyselý methanol (0,2%) je připravován smícháním 2 ml kyseliny mravenčí a doplnění odměrné nádoby o objemu 1 l methanolem Stabilizace systému - promytí kolony po dosažení nastavené teploty startovacím poměrem mobilní fáze alespoň 15 minut Pozn.: První dva až tří nástřiky standardu v sekvenci jsou pouze orientační a používají se k verifikaci systému, zejména k ověření stability retenčních časů. 12

Kapalinová chromatografie pro analyty stanovované UPLC-(ESI-)-MS/MS Parametry UPLC Přístroj Acquity UPLC Kolona Acquity UPLC HSS T3, (100 mm 2,1 mm, 1,8 µm) Teplota kolony 40 C Objem nástřiku 2 μl Složení mobilní fáze A: 5 mm octan amonný ve vodě B: 100 % methanol Teplota autosampleru 10 C Doba analýzy 10,5 min Gradient mobilní fáze Tabulka III Tabulka III: Gradient mobilní fáze UPLC-(ESI-)-MS/MS Čas (min) Průtok (ml/min) Složení mobilní fáze A (%) B (%) 0 0,350 90 10 1 0,350 50 50 6 0,400 20 80 6,5 0,500 0 100 8,5 0,700 0 100 10,5 0,450 90 10 13

Kapalinová chromatografie pro analyty stanovované UPLC-(ESI+)-MS/MS Parametry UPLC Přístroj Acquity UPLC TM Kolona Acquity UPLC HSS T3, (100 mm 2,1 mm, 1,8 µm) Teplota kolony 40 C Objem nástřiku 2 μl Složení mobilní fáze A: 5 mm mravenčan amonný v 0,2% kyselině mravenčí B: methanol, 0,2 % mravenčí kyselina Teplota autosampleru 10 C Doba analýzy 13 min Gradient mobilní fáze Tabulka IV Tabulka IV: Gradient mobilní fáze UPLC-(ESI+)-MS/MS Čas (min) Průtok (ml/min) Složení mobilní fáze A (%) B (%) 0 0,350 90 10 1 0,350 50 50 9 0,500 0 100 11 0,700 0 100 13 0,450 90 10 14

3.7.2. Hmotnostní spektrometrie Použitá technika MS/MS je spojení dvou hmotnostně-spektrometrických principů - kvadrupólu a iontové pasti - QTRAP. Sledované analyty jsou identifikovány na základě charakteristických fragmentačních přechodů mateřských iontů na ionty dceřiné (jednotlivé MS přechody byly při vývoji metody naladěny pomocí základních standardů mykotoxinů). Jednotlivé MS přechody spolu s optimálními detekčními podmínkami v Tabulce V. Pro každou sloučeninu byl sledován jeden kvantifikační a jeden konfirmační iont. Parametry UPLC-(ESI-)-MS/MS a UPLC-(ESI+)-MS/MS Hmotnostní analyzátor Přístroj QTRAP 5500 Typ tandemová MS, kvadrupól/iontová past UPLC-(ESI-)-MS/MS Iontový zdroj Ionizace ESI- Detekční mód MRM MRM detekce 60 sec Target scan time 0,55 sec Needle voltage -4500 V Source temperature 600 C CAD medium UPLC-(ESI+)-MS/MS Iontový zdroj Ionizace ESI+ Detekční mód MRM MRM detekce 60 sec Target scan time 0,55 sec Needle voltage +4500 V Source temperature 500 C CAD medium 15

Tabulka V: Sledované fragmentační přechody iontů a optimální podmínky při MS/MS Analyt t R a (min) Prekursorový iont (m/z) DP b (V) Produktový iont kvantifikační / konfirmační iont (m/z) CE c (V) CXP d (V) Fusarenon X 1,9 413,10 [M+CH 3 COO] - -50 353,1/263,0-14/-20-17/-17 Nivalenol 1,5 402,0 [M+CH 3 COO] - -50 311,1/281-14/-20-15/-17 Deoxynivalenol 1,8 355,1 [M+CH 3 COO] - -45 295,1/265,1-14/-20-15/-15 α-zearalenol 4,8 319,1 [M-H] - -110 275,0/174,0-30/-36-5/-9 β-zearalenol 4,2 319,1 [M-H] - -110 275,0/175,0-30/-37-5/-9 Zearalenon 5,3 317,1 [M-H] - -85 175,1/131,0-10/-10-11/-9 3-Acetyldeoxynivalenol 2,3 397,1 [M+CH 3 COO] - -55 336,9/306,9-12/-20-17/-17 Alternariol 4,0 257,0 [M-H] - -130 214,9/213,0-34/-31-13/-11 Alternariol-methylether 5,6 271,0 [M-H] - -176 255,9/228,0-71/-63-14/-14 DON-3-Glu 1,7 517,1 [M+CH 3 COO] - -60 456,9/426,9-20/-28-23/-11 Enniatin A 8,1 699,3 [M+NH 4 ] + 76 228,2/210,1 59/35 16/14 Enniatin A1 8,1 685,3 [M+NH 4 ] + 66 214,1/210,1 59/37 10/8 Enniatin B 7,9 657,3 [M+NH 4 ] + 51 213,9/196,1 59/39 20/4 Enniatin B1 7,9 671,2 [M+NH 4 ] + 66 228,1/214,1 57/61 12/10 Ergokornin 3,1 562,1 [M+H] + 86 223,2/268,2 57/39 10/12 Ergokorninin 3,7 562,1 [M+H] + 86 223,2/268,2 57/39 10/12 Ergotamin 2,9 582,1 [M+H] + 86 208,2/223,2 39/57 12/10 Ergokristin 3,8 610,1 [M+H] + 86 223,1/208,1 57/75 10/10 Ergokristinin 4,4 610,1 [M+H] + 86 223,1/208,1 57/75 10/10 Ergokryptin 3,7 576,1 [M+H] + 86 268,1/223,1 37/49 8/10 Ergokryptinin 4,3 576,1 [M+H] + 86 268,1/223,1 37/49 8/10 Ergosin 2,7 548,1 [M+H] + 86 223,1/208,0 67/65 8/10 Neosolaniol 2,0 340,0 [M+NH 4 ] + 66 305,1/215,1 17/23 36/24 Diacetoxyscirpenol 3,4 384,0 [M+NH 4 ] + 66 307,2/105,0 15/63 16/12 Altenuen 3,3 291,1 [M-H] - -76 202,9/247,9-13/-21-24/-30 Aflatoxin B1 3,3 313,0 [M+H] + 136 285,0/241,0 33/51 20/20 Aflatoxin B2 3,0 315,0 [M+H] + 141 287,1/259,0 37/41 20/24 Aflatoxin G1 2,7 331,1 [M+H] + 136 313,0/189,0 35/57 18/12 Aflatoxin G2 2,5 329,0 [M+H] + 138 243,0 / 200 34/51 20/18 HT-2 toxin 4,8 442,2 [M+NH 4 ] + 61 263,0/215,1 17/19 30/28 T-2 toxin 5,7 484,2 [M+NH 4 ] + 76 305,2/215,1 19/25 20/26 Sterigmatocystin 6,3 325,0 [M+H] + 106 310,0/281,0 35/51 20/18 Ochratoxin A 6,2 402,0 [M-H] - -91 358,1/166,8-35/-97-22/-12 Beauvericin 7,9 801,3 [M+NH 4 ] + 116 784,1/262,2 27/43 28/8 a Retenční čas b Deklastrační potenciál c Kolizní energie d Napětí na výstupu z cely 16

3.7.3. Identifikace a kvantitativní vyhodnocení analytů Identifikace sledovaných analytů se provádí na základě sledování hmot (m/z) specifických přechodů mateřského iontu na dceřiné ionty a také porovnáním retenčních časů analytů ve vzorku s příslušnými standardy, viz. Tabulka V. Kvantitativní vyhodnocení je založeno na metodě vnějšího standardu porovnáním odezvových charakteristik kvantifikačních iontů analytů s příslušnými standardy pomocí kalibrační závislosti. K vyhodnocení chromatogramů se používá program Analyst (Applied Biosystem). Kalibrační postup LC-MS/MS Kvantifikace je prováděna metodou vnější kalibrace pomocí matričních kalibračních standardů v koncentračním rozsahu 0,5 až 500 ng/ml. V případě velkých sérií vzorků je řada kalibračních standardů analyzována opakovaně vždy po nástřiku 15-20 reálných vzorků. Kalibrace je zpracovávána v programu Micorsoft Excel; linearity kalibračních závislostí jsou kontrolovány pomocí regresního koeficientu (R 2 ). Při sestavování kalibračních závislostí pro jednotlivé analyty je nutno používat takové koncentrace standardů, aby odezvy analytů ve vzorcích ležely v rozsahu kalibrace (mezi odezvou nejnižšího a nejvyššího bodu kalibrační závislosti). V případě, že odezva není v rozsahu kalibrace, je nutné vzorek naředit. 3.7.4. Výpočet koncentrace analytů ve vzorku C vz = (C vz1 -C sl ) k m r (V aliq / V ext ) C vz. koncentrace analytu ve vzorku (g/kg) C vz1... koncentrace analytu vypočítaná z kalibrační závislosti (ng) C sl.. koncentrace slepého pokusu vypočítaná z kalibrační závislosti (ng) m navážka vzorku (g) V aliq objem alikvotu po přečištění (ml) V ext. objem extraktu (ml) k. korekce na skutečný obsah analytu ve standardu (deklarovaná čistota (%/100)) r. zpětná výtěžnost postupu (%/100) 17

3.8. Pracovní charakteristiky metody 3.8.1. Správnost metody V současné době není komerčně dostupný certifikovaný referenční materiál obsahující celé spektrum sledovaných analytů. Správnost metody je pravidelně ověřována opakovanou analýzou uměle kontaminovaného materiálu (směsný standard přidaný ke vzorkům semen máku bez přítomnosti nebo s minimální přítomností analyzovaných mykotoxinů). Po přídavku roztoku se vzorek promíchá a nechá minimálně 60 min stát při laboratorní teplotě. Následně se extrahuje příslušným extrakčním postupem. Výtěžnosti jednotlivých analytů v semeni máku jsou uvedeny v Tabulce VI. 3.8.2. Rozsah metody a linearita Vzhledem k tomu, že se analyzované kontaminanty mohou vyskytovat ve vzorcích v širokém rozsahu koncentrací, je nutné volit kalibrační rozsah koncentrací standardů v dostatečně širokém rozmezí. V používaném kalibračním rozsahu 0,5 500 ng/ml pro jednotlivé analyty je odezva detektoru za podmínek metody lineární. Linearita kalibrace se kontroluje vynesením odezev jednotlivých analytů vůči koncentraci do grafu a pomocí regresního koeficientu (R 2 ). 3.8.3. Mez stanovitelnosti (LOQ) Mez stanovitelnosti je nejmenší množství stanovované látky (analytu) ve vzorku, které může být kvantitativně stanoveno s předem definovanou přesností. Většinou se stanovuje jako trojnásobek meze detekce. Pro uvažované aplikace je mez stanovitelnosti (LOQ = limit of quantification) zpravidla brána jako nejnižší hladina kalibrační křivky (použitého standardu o nejnižší koncentraci). LOQ všech analyzovaných mykotoxinů jsou uvedeny v Tabulce VI. Meze stanovitelnosti, při stanovení metodou UHPLC-MS/MS, pro jednotlivé analyty byly zjištěny pomocí nástřiku kalibrační řady standardů. 18

3.8.4. Opakovatelnost metody Opakovatelnost metody lze charakterizovat relativní směrodatnou odchylkou (RSDr, CV r ), která se získá z opakovaných analýz vzorku. Pro koncentrace nižší než 5 g/kg nesmí být RSDr > 20 %; pro koncentrace v rozmezí 5-100 g/kg musí být hodnota RSDr < 15 %; při koncentracích nad 150 g/kg musí být hodnota RSDr < 11 %. Uvedené hodnoty jsou stanoveny interními předpisy Metrologické a zkušební laboratoře 1316.2 a jsou přísnější než výkonnostní kriteria metod, jak jsou uvedeny v Nařízení komise (ES) č. 401/2006. Hodnoty RSDr (%), které byly získány pro validované matrice, jsou uvedeny v Tabulce VI. 19

Tabulka VI: Pracovní charakteristiky metody UHPLC-MS/MS pro stanovení mykotoxinů v semeni máku (přídavek standardu do semen máku neobsahujících mykotoxiny na hladině 100 ng/g, n=6). Mykotoxin Výtěžnost (%) LOQ (ng/g) Semena máku RSDr (%) 3-acetyldeoxynivalenol 101 25 2,9 Aflatoxin B1 91 2,5 2,6 Aflatoxin B2 90 2,5 1,5 Aflatoxin G1 88 2,5 2,0 Aflatoxin G2 84 2,5 5,9 Alternariol 137 2,5 2,7 Alternariol-methylether 124 2,5 2,6 Altenuen 127 5,0 8,1 Deoxynivalenol 126 25 7,2 Diacetoxyscirpenol 116 25 6,6 DON-3-Glukosid 51 25 10,9 Enniatin A 72 2,5 10,3 Enniatin A1 75 2,5 9,8 Enniatin B 74 2,5 11,4 Enniatin B1 77 2,5 11,2 Ergokornin 149 25 8,6 Ergokorninin 64 2,5 12,9 Ergokristin 90 2,5 14,9 Ergokristinin 64 2,5 14,7 Ergokryptin 126 25 6,4 Ergokryptinin 66 25 14,9 Ergosin 77 5,0 11,1 Ergotamin 74 2,5 10,8 Agroklavin 115 5 7,0 Fusarenon-X 96 2,5 10,2 HT-2 toxin 122 25 6,3 Neosolaniol 132 25 5,5 Nivalenol 86 50 9,6 Ochratoxin A 119 25 6,5 Sterigmatocystin 88 2,5 8,1 T-2 toxin 113 5 6,3 Zearalenon 128 2,5 3,5 α-zearalenol 126 2,5 4,5 β-zearalenol 138 2,5 3,0 20

4. SROVNÁNÍ NOVOSTI POSTUPU Pro stanovení mykotoxinů v semeni máku nebyl v praxi dosud zaveden žádný analytický postup, díky kterému by bylo možné v krátkém čase stanovit 34 mykotoxinů. Izolace analytů z matrice semen máku vychází z inovativní metody QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe), která je již delší dobu používána v laboratořích Ústavu analýzy potravin a výživy pro multimykotoxinové stanovení cereálií a krmiv. Tato metoda byla z důvodu vysokého obsahu lipidických látek v semeni máku modifikována a pro tuto matrici je používáno přečištění extraktu pomocí modifikované disperzní extrakce na tuhou fázi (Bondesil- modifikovaný C18 silikagel), které slouží k vyvázání nepolárních koextraktů. Výhoda výše uvedené metodiky spočívá v použití neselektivní extrakce vzorků, umožňující získání širokého spektra analytů s různými chemickými vlastnotmi a odstranění složek matrice rušící následující analytické stanovení. Je zde použita citlivá instrumentace pracující na principu ultraúčinné kapalinové chromatografie ve spojení s tandemovou hmotnostní detekcí UHPLC-MS/MS. Použité přístroje umožňují separaci a detekci 34 analytů s nízkými detekčními limity. Uvedená metoda může zajistit velmi operativní a rychlé analýzy vzorků v rámci nezbytné kontroly potravin, ale také širší monitoring výše uvedených toxinů. Získané výsledky mohou dále přispívat k rozšíření znalostí o výskytu mykotoxinů v semeni máku na území ČR. 21

5. POPIS UPLATNĚNÍ CERTIFIKOVANÉ METODIKY Multimykotoxinová metoda na principu UHPLC-MS/MS je vhodná ke stanovení mykotoxinů ve vzorcích semen máku a dalších matric na podobné bázi, které obsahují vyšší obsah lipidických látek. Metodika je výsledkem řešení výzkumného projektu č. QH92106 Pěstitelské systémy u máku se zaměřením na kvalitu a bezpečnost ekologické a integrované produkce. Metoda může být využita pro rutinní analýzy jak ve státních, tak v soukromých laboratořích a výzkumných centrech, díky její jednoduché a rychlé aplikaci. Vzhledem k tomu, že obsah mykotoxinů v máku není dosud legislativně regulován, popisovaná metoda by významně přispěla k získání dostatečného množství relevantních dat. Na základě výsledků by mohlo být posouzeno potenciální zdravotní riziko pro populaci a zavedeny příslušné legislativní opatření. 22

6. EKONOMICKÉ ASPEKTY Při bilanci ekonomických aspektů bylo předpokládáno, že laboratoř, která chce uvedenou metodu zavést, již má zkušenosti s analýzou na systémech LC-MS a vlastní tak kapalinový chromatograf s tandemovým hmotnostním spektrometrem. Ultraúčinný kapalinový chromatograf (UHPLC) umožní laboratoři úsporu jak času, tak i použitých chemikálií a rozpouštědel, náklady na jeho pořízení se pohybují kolem 1100 tis. Kč. Dále je k samotnému provedení analýzy potřebné běžné vybavení laboratoře, viz kapitola 3.4 a 3.5, další investice proto nejsou zapotřebí. Implementace metody zahrnuje zjištění aktuálních pracovních charakteristik, zejména zjištění limitů kvantifikace, linearity, ale také verifikaci metody pomocí přídavku mykotoxinů na předem známou hladinu (např. 100 µg/kg) a zjištění výtěžnosti, případně i opakovatelnosti metody (např. n=6). Za předpokladu, že by bylo provedeno 20 verifikačních a kontrolních analýz, přičemž provozní náklady na jednu analýzu by byly 2405 Kč, celkové náklady na implementaci by se rovnaly 48,7 tis. Kč. Pokud laboratoř UHPLC-MS/MS zařízení nevlastní pohybují se celkové náklady na zavedení výše uvedené metody ve výši 8903 tis. Kč. 23

7. SEZNAM SOUVISEJÍCÍ POUŽITÉ LITERATURY Nařízení komise (ES) č. 1881/2006 ze dne 19. prosince 2006, kterým se stanoví maximální limity některých kontaminujících látek v potravinách. Nařížení komise (ES) č. 401/2006 ze dne 23. února 2006, kterým se stanoví metody odběru vzorků a metody analýzy pro úřední kontrolu množství mykotoxinů v potravinách. Anastassiades M, Lehotay S, Stajnbaher D, Schenck F, Fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/partitioning and "dispersive solid-phase extraction" for the determination of pesticide residues in produce, Journal of AOAC, 2003, 86, 412-431. Beltran E., Ibanez M., Sancho J. V., Hernandez F.: Determination of mycotoxins in different food commodities by ultra-high-pressure liquid chromatography coupled to triple quadrupole mass spectrometry; Rapid Commun. Mass Spectrometry, 2009, 23, 1801 1809. Lehotay, S. J.; Mastovska, K.; Yun, S. J. Evaluation of two fast and easy methods for pesticides residue analysis in fatty food matrixes. Journal of AOAC International 2005, 88, 630-638. Sulyok M., Berthiller F., Krska R., Schuhmacher R.: A liquid chromatography/tandem mass spectrometric multi-mycotoxin method for the quantification of 87 analytes and its application to semi-quantitative screening of moldy food samples; Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2007, 389, 1505 1523. 24

8. SEZNAM PUBLIKACÍ, KTERÉ PŘEDCHÁZELI METODICE Vepříková Z., Malachová A., Zachariášová M., Kostelanská M., Poustka J., Hajšlová J., Kontaminace máku mykotoxiny,skalský dvůr, 4.-6.5.2010, ISSN 1802-1433 Vepříková Z., Zachariášová M., Kostelanská M., Džuman Z., Hajšlová J.: Stanovení mykotoxinů ve vzorcích máku zakoupených v maloobchodní síti v roce 2011, XLI. Symposium o nových směrech výroby a hodnocení potravin, Skalský Dvůr, 23. - 25.5. 2011, ISSN 1802-1433 Vepříková Z., Zachariášová M., Kostelanská M., Džuman Z., Hajšlová J.: Analysis of mycotoxins in poppy seeds, 5 th International Symposium on Recent Advances in Food Analysis, Praha, Česká republika, 1. 4. 11. 2011, ISBN 978-80-7080-795-8 25

9. AUTOŘI A OPONENTI Metodu zpracovali: Ing. Zdenka Vepříková, Ing. Marta Václavíková, PhD., Ing. Milena Zachariášová, PhD., Prof. Ing. Jana Hajšlová, CSc. Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Ústav analýzy potravin a výživy, FPBT Technická 3, 166 28 Praha 6 Dejvice Oponenti: 1) Ing. Radim Štěpán, Ph.D., Inspektorát SZPI v Praze, NRL Za Opravnou 4, 150 06 Praha Motol 2) Ing. Kateřina Lancová,Ph.D., Masarykova univerzita, Středoevropský technologický institut, Kamenice 753/5, 625 00 Brno Červenec 2012, Praha 26

Jana Hajšlová, Zdenka Vepříková, Marta Václavíková, Milena Zachariášová UPLATNĚNÁ CERTIFIKOVANÁ METODIKA Stanovení mykotoxinů v semeni máku Vydala: Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Technická 5, 166 28 Praha 6 Recenzenti: Ing. Radim Štěpán, Ph.D., Ing. Kateřina Lancová, Ph.D. Rok vydání: 2012 Počet stran: 27 Elektronická verze publikace ve formátu PDF na CD-ROM. 27