ÚLOHA 17 Stanovení koncentrace peroxidu vodíku fluorimetricky s činidlem Amplex Red. Stanovení aktivity enzymu xanthinoxidasy v purifikované formě a v buněčném extraktu. Teoretický úvod Reaktivní formy kyslíku (ROS, reactive oxygen species) jsou chemicky reaktivní molekuly obsahující kyslík. Jejich reaktivita je způsobena přítomností nepárového elektronu ve valenční vrstvě. Tento nepárový elektron vzniká homologickým štěpením vazby, přijetím nebo naopak ztrátou elektronu. ROS vznikají jako vedlejší metabolické produkty a hrají důležitou roli v buněčné signalizaci a v udržení homeostázy. Reaktivní formy kyslíku se dělí na dvě skupiny, a to na skupinu volných radikálů a skupinu látek, které nejsou volné radikály. K volným radikálům reaktivních forem kyslíku patří: superoxid (. O - 2 ), hydroxylový radikál (. OH), peroxyl (. ROO), alkoxyl (. RO), hydroperoxyl (. HO 2 ). K látkám, které nejsou volné radikály a patří ke skupině reaktivních forem kyslíku řadíme: peroxid vodíku (H 2 O 2 ), kyselinu chlornou (HOCl), ozon (O 3 ), singletový kyslík ( 1 O 2 ). V Tabulce 1 je uveden přehled zdrojů a biologických účinků ROS. Nejbohatším zdrojem metabolitů kyslíku jsou membránově vázané reduktasy. Nejvýznamnější je cytochromoxidasa v mitochondriích, která provádí čtyřelektronovou redukci kyslíku. Další reduktasy dýchacího řetězce endoplazmatického retikula a membrán jsou schopny jednoelektronově a dvouelektronově redukovat kyslík. Superoxid se tvoří v mitochondriích z koenzymů ubisemichinonu a semiflavinu, v endoplazmatickém retikulu vzniká z oxykomplexu cytochromu P450 a v leukocytech a v makrofázích je produkován NADPH oxidasou obsaženou v cytoplasmatické membráně jako součást baktericidního ochranného systému. Tyto buňky obsahují také myeloperoxidasu, která produkuje kyselinu chlornou. Peroxid vodíku vzniká ve tkáni hlavně dismutací superoxidu nebo je tvořen také přímo působením oxidas, jako je monoaminoxidasa, glutathionoxidasa a xanthinoxidasa. Proces vzniku volných kyslíkových radikálů a jejich působení na buňky organismu se souhrnně nazývá oxidativní stres. Mezi reakce charakteristické pro oxidativní stres patří oxidace polynenasycených mastných kyselin (významný důsledek oxidativního stresu, typická radikálová řetězová reakce, vedoucí ke vzniku poměrně široké škály často toxických produktů, jako jsou aldehydy - malondialdehyd, 4-hydroxy-2-nonenal, dienaly; alkany; izoprostany; konjugované dieny), oxidace nukleotidů (oxidace DNA je charakterizována oxidací deoxyribosy, změnou struktury dusíkatých bází - zejména guaninu a rozrušením dusíkové vazby, snížení metabolické přeměny proteinů, snížení syntézy specifických enzymů a receptorů ústící v nadprodukci příslušných genů, poškození mitochondriálních funkcí, buněčné membrány. Zejména v důsledku snížení fluidity fosfolipidové dvojvrstvy, zvýšení výměny fosfolipidů mezi vrstvami a zvýšení propustnosti membrány výše zmíněné děje ústí v buněčnou smrt. Tabulka 1 Přehled zdrojů a biologických účinků ROS (Piterková et al., 2005) Forma kyslíku Zdroj Biologický efekt O 2.- osvětlené chloroplasty, PSII a PSI, mitochondrie v přítomnosti NADH, Fe-S proteiny, cytochrom P450 elektronový transportní řetězec v endoplasmatickém retikulu, herbicidy (paraquat a nitrofen), enzymové reakce: xanthinoxidasa, NAD(P)H oxidasa, aldehydoxidasa, urikasa (EC 1.7.3.3). peroxidace lipidů, inaktivace enzymů, depolymerizace polysacharidů, reakce s H 2 O 2 za tvorby OH., schopnost oxidovat síru, askorbát a NADPH, redukovat cytochrom c a ionty kovů
H 2 O 2 glykolátoxidasa v glyoxysomech, osvětlené chloroplasty - PSII, mitochondrie v přítomnosti NADH, β-oxidace mastných kyselin, Fe-S proteiny a enzymové reakce (SOD, glykolátoxidasa, aminoxidasa, oxalátoxidasa (EC 1.2.3.4), peroxidasy ) inhibice fixace CO 2, inaktivace enzymů Calvinova cyklu, oxidace sulfhydrylů a flavonolů, substrát oxidační reakce OH. Haberova-Weissova reakce, Fentonova reakce velmi silné oxidační činidlo, poškození DNA, peroxidace lipidů, degradace 1 O 2 excitované chlorofylové molekuly v tripletovém stavu, znečištění vzduchu (NO 2, O 3, atd.) proteinů, produkce C 2 H 4 mutageneze, peroxidace lipidů, fotooxidace aminokyselin Dvouelektronovou redukcí kyslíku vzniká peroxid vodíku (H 2 O 2 ), který je řazen mezi ROS i přesto, že není volným radikálem. V nepřítomnosti přechodných kovů je vysoce stabilní a nereaktivní, dokonce i v tak vysokých koncentracích, než mohou být produkovány v živých systémech. Díky této vlastnosti je více mobilní v pletivech a lze jej potencionálně využívat jako substrát v různých reakcích i jako molekulu zapojenou v ROS signalizaci. V rostlinných buňkách je peroxid vodíku produkován zejména v mitochondriích, chloroplastech, peroxisomech/glyoxysomech, dále v cytoplasmě, plasmatické membráně a v buněčné stěně. Poměr produkce H 2 O 2 v chloroplastech a peroxisomech je 1:2,5; a v chloroplastech/peroxisomech a mitochondriích 35:1. Tyto hodnoty byly stanoveny z rychlosti produkce H 2 O 2 podle Foyer & Noctor (2003). H 2 O 2 je produkován disproporcionační reakcí katalyzovanou superoxiddismutasou (SOD), redukcí superoxidového aniontu redukčními činidly jako jsou např. askorbát, thioly, ferredoxiny atd. K uvolňování H 2 O 2 dochází aktivitou i jiných oxidas, např. glykolátoxidasami, glukosaoxidasami nebo sulfitoxidasami. Mezi další enzymové zdroje O - 2 / H 2 O 2 patří peroxidasy vázané na buněčnou stěnu, oxalátoxidasy, aminooxidasy a NADPH oxidasy plasmatické membrány. Produkce H 2 O 2 a ROS může probíhat v mnoha reakcích fotosyntézy a respirace, což má za následek tvorbu nežádoucích vedlejších produktů normálního aerobního metabolismu. NADPH-dependentní oxidasa plasmatické membrány rostlinných buněk patří mezi nejintenzivněji studovaný oxidasový systém. Jedná se o enzym katalyzující produkci superoxidového anion radikálu jednoelektronovou redukcí kyslíku, kde NADPH funguje jako donor elektronu. Tvorba superoxidového anion radikálu probíhá v prostoru apoplastu a následně dochází k přeměně na H 2 O 2, která může být buď spontánní, nebo způsobena aktivitou extracelulární SOD. Úloha H 2 O 2 v rostlinné biochemii a fyziologii byla popsána v řadě studií. Po vystavení rostliny stresovému faktoru dochází ke zvýšení koncentrace H 2 O 2, rychlost produkce H 2 O 2 je závislá na intenzitě a době působení stresového faktoru. Byla také pozorována odlišnost produkce H 2 O 2 pro různé typy stresu v různých částech buňky, např. stres z nadbytečného světla způsobuje nadprodukci H 2 O 2 hlavně v chloroplastu. Rostlinné buňky vykazují vyšší rezistenci k vyšším koncentracím H 2 O 2 než živočišné buňky, pro které je peroxid vodíku toxický v rozmezí koncentrací 10-10 2 μm. U rostlinných buněk byla prokázána tolerance 10 2-2x10 5 μm. V rostlinných systémech má peroxid vodíku dvojí roli, v nízkých koncentracích působí jako signální molekula při spouštění tolerance na různé typy stresových faktorů (abiotické, biotické) a v příliš vysokých koncentracích vede k oxidativnímu stresu, který spouští programovanou buněčnou smrt. V širokém spektru fyziologických procesů jako je růst
a vývoj rostliny, fotorespirace a fotosyntéza, pohyb stomat, senescence byla prokázána úloha H 2 O 2 jako klíčového regulátoru. Evoluce všech aerobních organismů je závislá na vývoji účinných H 2 O 2 odstraňujících mechanismů. Pro eliminaci H 2 O 2 je nutné odstranění všech ostatních ROS, rovnovážná hladina buněčného H 2 O 2 je závislá na redoxním stavu buňky. U rostlinných buněk je proces produkce a eliminace H 2 O 2 přísně regulován a koordinován ve stejných nebo různých kompartmentech buňky. Antioxidační systém rostlin je vícestupňový, skládající se z antioxidantů jako je askorbát, α-tokoferol nebo glutathion a celé řady ROS detoxifikujících enzymů jako je askorbátperoxidasa, glutathionperoxidasa, superoxiddismutasa, katalasa a enzymy askorbátglutathionového cyklu. Enzym xanthinoxidoreduktasa (XOR) se vyskytuje ve dvou formách, xanthinoxidasa (XOD, EC 1.17.3.2) a xanthindehydrogenasa (XDH, EC 1.1.1.204). Nejvyšší aktivita xanthinoxidoreduktasy byla zaznamenána v játrech, střevní sliznici, v mléčné žláze a může se uvolnit i z orgánů a zachytit na povrchu malých cév a kapilár. Za fyziologických podmínek převažuje jeho dehydrogenasová forma XDH, zvaná D-forma. Za patologických podmínek se reversibilní sulfhydrylovou oxidací D-forma enzymu přemění na O-formu (xanthinoxidasu), která není schopna se vázat na NAD + a elektrony pak předává na molekulární kyslík za vzniku superoxidu nebo peroxidu vodíku. Irreversibilní přeměna probíhá tryptickou proteolýzou. XDH je složena ze dvou identických podjednotek o velikosti asi 150 kda, které jsou na sobě katalyticky nezávislé. V každé podjednotce je obsažen jeden molybdopterin, dva Fe-S klastry a jeden FAD. Redoxní centrum se nachází ve třech doménách: dva Fe-S klastry v 20 kda doméně, FAD v 40 kda doméně, molybdopterin v 40 kda doméně. Xanthinoxidasa hraje významnou roli v metabolismu purinů, katalyzuje oxidaci hypoxanthinu na xanthin a dále oxidaci xanthinu na kyselinu močovou. U savců bylo objeveno, že XOD má vztah k signální molekule oxidu dusnatého (NO). XOD i XDH jsou inaktivovány NO a za určitých podmínek se může XOD podílet na tvorbě peroxynitritu. Peroxynitrit pak může regulovat přeměnu XDH na XOD a zpětně tak regulovat aktivitu XOD. Mnoho rostlinných extraktů má inhibiční efekt na aktivitu XOD nebo má schopnost ničit superoxidový radikál. XOD má také klinický význam. Při patologických stavech, např. při poškození jater, je hladina XOD v krevním séru zvýšena. Inhibitor XOD allopurinol má význam při léčbě dny. Dna je onemocnění, při kterém se kyselina močová a krystaly jejích solí hromadí v kloubech a vyvolávají prudké bolesti, otoky a zarudnutí. Krystaly se také mohou ukládat i v ledvinách a kůži. Kvantifikace peroxidu vodíku fluorescenčními sondami Fluorescenční sondy jsou fluorofory (tj. přidávají se ke vzorkům, které nemají vhodné fluorescenční vlastnosti), které se vážou ke sledované látce a často přitom mění své fluorescenční vlastnosti. Jsou známy tisíce sond, jejichž relativně nejúplnější přehled lze
nalézt na webových stránkách firmy Molecular Probes, avšak podrobnější informace jsou dostupné jen v primární literatuře. Existuje rozsáhlá řada fluorogenních substrátů sloužících jako donor atomu vodíku, které se často používají ve spojení s křenovou peroxidasou (HRP, EC 1.11.1.7). Mezi nejčastěji používané substráty patří diacetyldichlorofluorescein, homovanilová kyselina a Amplex Red. Řada kolorimetrických substrátů jako tetramethylbenzidin (TMB) nebo fenolová červeň byly také používány ve spojení s HRP pro stanovení koncentrace peroxidu vodíku. Kolorimetrické metody jsou méně citlivé než fluorescenční metody detekce, avšak přístrojové náklady jsou výrazně nižší. Amplex Red neboli N-acetyl-3,7-dihydroxfenoxazin reaguje s peroxidem vodíku v přítomnosti peroxidasy za tvorby resorufinu. Produkt lze stanovit měřením absorbance při 570 nm nebo také měřením fluorescence (excitační/emisní maximum 571/585 nm). Homovanilová kyselina se vyskytuje v podobě monomeru, který nevykazuje fluorescenci. Při oxidaci peroxidu vodíku za katalýzy HRP dochází k dimerizaci a vzniklý produkt lze stanovit měřením fluorescence (excitace 315 nm, emise 425 nm). Při použití polystyrénových titračních mikrodestiček v blízké UV oblasti byl pozorován vysoký falešně pozitivní signál.
Pro kvantifikaci peroxidu vodíku pomocí substrátů přeměňovaných HRP je nutné brát na vědomí následující fakta: některé sloučeniny uvnitř buňky (např. thioly) mohou být substrátem pro HRP endogenní katalasová aktivita může snížit množství H 2 O 2 v buňce některé buněčné komponenty mohou ovlivnit fluorescenční signál v závislosti na excitační a emisní vlnové délce. Pro detekci ROS a RNS se používá nespecifická fluorescenční sonda 2,7- dichlorodihydrofluorescein diacetát (H 2 DCF DA) nebo její acetomethylový ester (H 2 DCFDA- AM) umožňující lokalizaci a případně i kvantifikaci. Tato sonda má schopnost procházet skrz buněčné membrány, esterasy H 2 DCF DA přeměňují na H 2 DCF, které se oxiduje pomocí H 2 O 2, HO., ROO.,. NO a NOO - na fluorescenční 2,7-dihydrofluorescein DCF (excitace 498 nm, emise 522 nm). Původně se předpokládalo, že DCF je specifickým činidlem pro stanovení H 2 O 2, avšak nedávno bylo prokázáno, že může docházet k jeho autooxidaci a tím ke zvýšení fluorescence bez ohledu na přítomnost ROS. Navíc není dostatečně selektivní, protože reaguje jak s různými druhy ROS, tak s některými druhy RNS. Pro umožnění přímé selektivní reakce s H 2 O 2 bylo vyvinuto několik nových fluorescenčních prób např. Peroxy Green 1 (PG1) a Peroxy Crimson 1 (PC1). Tyto próby obsahující boronátovou skupinu vykazující vysokou selektivitu a dobrou prostupnost membránami. Pro PG1 je excitační vlnová délka 460 nm, emisní maximum 510 nm. PC1 má excitační vlnovou délku 480 nm a emisní 584 nm. Peroxy Green 1 Peroxy Crimson 1
Materiál a chemikálie 1. Rostlinný materiál: etiolované a zelené rostliny Pisum sativum 2. Komerční enzym XOD z podmáslí (Sigma 67684, 50 mg 0,068 U/mg rozpustit v 340 μl pufru s 20% glycerolem výsledný preparát 0,01 U/μl) 3. Zásobní roztoky: - 5x reakční pufr: 500 mm Tris-HCl, ph=7,6 (TRIS MW = 121,4, navážka 12,1 g na 200 ml) - 20 mm xanthin rozpuštěný v 40 mm NaOH (MW = 174,1, navážka 34,8 mg/10 ml) - 3% roztok peroxidu vodíku stabilizovaný (k 1 ml 30% peroxidu vodíku přidat 9 ml vody) 4. Před měřením aktivity připravit roztoky (množství na 100 jamek s objemem 100 μl): - Amplex Red roztok rozpustit 0,26 mg AR v 100 μl DMSO (chránit před světlem a uchovávat při -20 C) - 1x reakční pufr naředit 4ml 5x pufru se 16 ml deionizované H 2 O - křenová peroxidasa HRPX připravit 200 μl roztoku s aktivitou 0,4 U/ml v 50 mm Na- Pi, ph 7,4 (komerční preparát Fluka 232686 aktivita 560 U/mg) - 20 mm H 2 O 2 naředit 23μl 3% roztoku s 977μl vody - XOD naředit na 0,01 mu/μl 5. Příprava kalibrační křivky pro XOD: - ze zásobního roztoku XOD (0,01 mu/μl) připravit řadu roztoků o aktivitě 0,06-1,25 mu/ml (ředění 1x reakčním pufrem, do jedné jamky mikrotitrační destičky se pipetuje 50 μl pro trojí opakování připravit 150 μl, do jedné kyvety se pipetuje 0,5 ml pro trojí opakování připravit 1,5 ml) 6. Pracovní činidlo AR/HRPX/xanthin: V 50ml zkumavce smíchat: - 250 μl roztoku Amplex Red v DMSO - 100 μl roztoku peroxidasy - 100 μl roztoku xanthinu - 24,4 ml 1x reakčního pufru Jednokanálové pipety s nastavitelným objemem 20-200 μl, 100-1000 μl, 1-5ml, multikanálová pipeta s nastavitelným objemem 20-200 μl, termostat, třepačka pro mikrotitrační destičky Reader mikrotitračních destiček Biotek Synergy HT, software KC4 Kyvetový fluorimer Aminco Bowman 2, software Ab2 Postup 1. Příprava rostlinného extraktu 2 g nadzemní části etiolovaného a zeleného hrachu homogenizujeme na ledu s 0,1 M Tris-HCl pufrem v poměru 1:2 (w:v). Extrakt centrifugujeme po dobu 10 minut při 5000 g a teplotě 4 C. Odebereme supernatant do předem připravených a popsaných eppendorfek. Pro měření aktivity XOD je nutné vzorky uchovávat na ledu. Pro měření je nutné extrakty vhodně naředit 0,1 M Tris-HCl pufrem (opt. 5-10x).
2. Měření na readru Synergy HT (použít černé destičky pro fluorescenci!) Kalibrační křivka XOD: do jamek postupně pipetujeme ve třech opakováních : 50 μl blanku (1x reakční pufr), 50 μl roztoků pro kalibrační křivku XOD. Přidáme 50 μl pracovního činidla AR/HRPX/xanthin a inkubujeme 30 minut v termostatu na třepačce při 37 C. Poté změříme nárůst fluorescence (excitace 530 nm, emise 590 nm) při citlivosti 50. Kinetická metoda: v programu ovládání mikrodestičkového readru vytvoříme nový protokol a provedeme nastavení parametrů: excitace 530 nm, emise 590 nm, citlivost 50, kinetika: celková doba měření 15 minut, interval měření 15 s. 3. Měření na kyvetovém fluorimetru Aminco Bowman 2 Upozornění: - nutno používat speciální křemenné kyvety pro fluorescenci opatrné zacházení - po ukončení měření je nutno nechat min. několik minut běžet přístroj před vypnutí lampy, jinak může dojít k jejímu přehřátí a nevratnému poškození Spuštění přístroje 1) Přepněte vypínač lampy na levé straně přístroje nahoru do polohy LAMP ENABLE 2) Zapněte přístroj přepnutím vypínače na levé straně přístroje (za napájecím kabelem) při správné funkci se indikátorová dioda na pravé straně rozsvítí žlutě a po cca 15 s svítí zeleně, indikátorová dioda lampy na čelní straně svítí červeně 3) Zapněte řídící PC, spusťte software Ab2 kliknutím na ikonu na ploše monitoru 4) Proveďte kalibraci štěrbin - v programu Ab2 vyberte menu Setup/Instrument Setup/Send Commands a do příkazového řádku napište: EX:SLITCAL a stiskněte Send, poté napište EM: SLITCAL a opět stiskněte Send. Měření kalibrační křivky 1) Po spuštění přístroje a softwaru vyberte v menu Channels v boxu Source 1 Emmission left, v boxu Source 2 Reference, v boxu Operator / (lomítko) a v boxu Available Channels emisní kanál Eml/Ref. 2) Otevřte menu Monochromators, nastavte hodnoty Exc a Em vlnové délky, šířky štěrbin ( Bandpass ) a otevřte uzávěrky ( Open shutters ) 3) Otevřte menu Sensitivity a vložte do přístroje kyvetu s nejvyšší koncentrací standardu (s očekávanou nejvyšší hodnotou fluorescence). 4) Nastavte automaticky citlivost stisknutím Auto-range 5) Vložte do přístroje kyvetu s blankem nebo standardem s nejnižší koncentrací a vyberte Offset used 6) V menu Applications vyberte možnost Make quantitative standard 7) Odlikněte box u výběru Use standard list pro aktivaci možnosti vkládat údaje o standardech postupně během měření 8) Zvolte parametry: metoda vyhodnocení kalibrační závislosti ( Method total peak height ), rozměr koncentrace ( Conc. Label ), měřeného kanálu ( Channel Eml/Ref ), typ proložení kalibrační křivky ( Degree of Fit hodnota 1 pro lineární regresi) 9) Pro zahájení vlastního měření standardů zvolte Applications/Start application 10) Vyplňte v dialogovém boxu název souboru a klikněte na Start 11) V boxu Make quantitative standard Manual control klikněte na Acquire next standard 12) V boxu vyplňte hodnotu koncentrace standardu a potvrďte OK
13) Po změření vzorku přístroj zobrazí výslednou hodnotu v tabulce grafu a grafu kalibrace 14) Stejný postup jako v bodech 11-13, opakujte postupně pro všechny standardy 15) Po ukončení měření uložte soubor v boxu Make Quantitative Standard vyberte v menu Standard/Store v dialogovém boxu zadejte jméno souboru a klikněte OK Měření vzorků s použitím uložené kalibrační křivky 1) V menu Applications vyberte Quantitative Analysis 2) V dialogovém boxu Quantitative Analysis vyberte uloženou kalibraci klikněte na tlačítko Retrieve a vyberte uložený kalibrační soubor 3) Vyberte možnost Enter standards at run time pro možnost vkládání údajů o vzorcích během měření a klikněte na OK po uzavření dialogového okna 5) V menu Applications zvolte Start Application, zadejte jméno souboru a klikněte na Start 6) Otevře se box Manual Quantitative Analysis a klikněte na Acquire 7) Zadejte označení vzorku a případně další parametr, klikněte na OK - naměřená data se zobrazí ve výsledkové tabulce 9) Postup 5-8 opakujte postupně pro všechny vzorky -po ukončení uložte soubor v menu File/Store Měření kinetiky TIME TRACE 1) V dialogovém boxu Setup/Setup Instrument/Monochromators otevřete uzávěrky a nastavte hodnoty excitační a emisní vlnové délky 2) Doporučené výchozí parametry: krok 1 nm ( Step size ), 16 nm šířka štěrbiny ( Bandpass ) 3) V dialogovém boxu Sensitivity nastavte citlivost (nutno emipircky stanovit pro každou metodu a rozsah měření daného parametru koncentrace látky, aktivita enzymu atd.) 4) Dialogové okno Instrument Status nechte během měření otevřené pro kontrolu intenzity signálu 5) Vyberte v menu Applications možnost Time Trace 6) V dialogovém okně nastavte hodnoty rozsahu časové osy ( Range tj. jak dlouho bude měření probíhat), hodnotu časového rozlišení ( Resolution tj. v jakých intervalech se bude měřit během zadané doby) a případného opakování měření v každém časovém bodě ( Repetition data opakovaných měření se poté průměrují) - stiskněte OK Kalibrační křivka XOD end-point metoda: do 2ml eppendorfek pipetujeme ve třech opakováních: 0,5 ml blanku/roztoku pro kalibrační křivku XOD/vzorku. Přidáme 0,5 ml pracovního činidla AR/HRPX/xanthin a inkubujeme 30 minut v termostatu na třepačce při 37 C. Spuštění přístroje, kontrolu správné funkce přístroje a vlastní měření provedeme podle výše uvedeného postupu. Vyhodnocení 1. Porovnejte použité metody z hlediska pracnosti, rychlosti, meze detekce a lineárního rozsahu odezvy naměřené na mikrodestičkovém readru a kyvetovém fluorimetru. Literatura 1. Piterková J., Tománková K., Luhová L., Petřivalský M., Peč P. (2005) Oxidativní stres: Lokalizace tvorby aktivních forem kyslíku a jejich degradace v rostlinném organismu. Chem. Listy 99, 455-466. 2. Protokol firmy InVitrogen : http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp22182.pdf