Monitorování hladin etoposidu a topotekanu pomocí kapalinové chromatografie při periokulární a intravitreální aplikaci v terapii retinoblastomu Klapková E 1., Petrušková D 2., Pochop P 2., Průša R 1. 1) Ústav lékařské chemie a klinické biochemie 2) Oční klinika dětí a dospělých 2. LF UK a FN Motol 24.9.2012
Retinoblastom primární zhoubný nádor sítnice, který vychází zembryonálních nediferencovaných i diferencovaných retinoblastů 70 % jednostranné nádory, většinou na podkladě nedědičné somatické mutace charakteristika: rychlý růst, záhy vyplňuje sklivcovou dutinu, po úplném postižení bulbu prorůstá do orbity, optického nervu a do CNS
aplikace cytostatik přímo do nádoru projevy: strabismus, leukokorie (Beerův příznak) zornice - světlá, šedobílá či nažloutlá, ztuhlá amauroticky metastázy: kostní dřeň, kosti, plíce, CNS možnosti léčby: laserová terapie chirurgická léčba radioterapie chemoterapie
Současná terapie pokročilých forem retinoblastomu Pokročilá forma retinoblastomu = skupina C a D podle International Intraocular Retinoblastoma Classification (IRC, ABC klasifikace) Murphree, 2005 = skupina IV a V podle Reese-Ellsworth CHEMOREDUKCE + LOKÁLNÍ OČNÍ TERAPIE: úspěch v 85 % (IRC A,B) x v 47 % (IRC C,D)* zvýšení úspěšnosti záchranné terapie: Intenzifikace chemoterapie Lokální aplikace chemoterapie
Etopozid Topotekan derivát podofylotoxinu s glykosidicky navázanými substituenty Aplikace nádory plic, pleury, mediastina, trávicí trubice, gynekologické nádory, retinoblastom Vedlejší účinky nausea, zvracení, hematotoxicita (leukopenie, trombopenie) derivát kamptotecinu Aplikace karcinom plic, ovárií, retinoblastom Vedlejší účinky nausea, zvracení, průjem, obstipace, mukozitida hematotoxicita (leukopenie, trombopenie, neutropenie, anémie)
? účinné, netoxické, snesitelné koncentrace Cíl stanovení koncentrací sklivec, periferní krev výpočet AUC (Cílová AUC ve sklivci pro etoposid 2 : 276 492 μg/ml.h Cílová AUC ve sklivci pro topotekan 3 : 0,12 0,18 μg/ml.h) sledování toxicity etopozidu a topotekanu najít ideální techniku a způsob aplikace cytostatik na modelu králičího bulbu 2 Lowis SP, Price L et al. (1998). A study of the feasibility and accuracy of pharmacokinetically guided etoposide dosing in children. Br J Cancer 77:2318-2323. 3 Stewart CF, Iacono LC et.al. (2004). Results of a phase II upfront window of pharmacokinetically guided topotecan in high-risk medulloblastoma and supratentorial primitive neuroectodermal tumor. J Clin Oncol 22:3357-3365.
Metody "In vivo" experiment byl schválen etickou komisí pro ochranu zvířat podle vyhlášky č.207/2004 s.11 Ministerstva zemědělství České Republiky 24 zdravých, dospělých Novozélandských bílých králíků Samci o váze 2,59 ± 0.38 kg Levé bulby byly u všech králíků ponechány bez aplikace jako bulby kontrolní
Aplikace etopozidu 2,5 mg ET periokulárně 0,5 mg ET intravitreálně Metody Periokulární aplikace Aplikace topotekanu 1 μg topotekanu intravitreálně 2 μg topotekanu intravitreálně Odběr vzorků (sklivec, plazma) 1., 2., 6. hodině 1., 2., 7., 14. den 3. týden Intravitreální aplikace
Kapalinový chromatograf Agilent 1200 degasser kvartérní pumpa autosampler termostat kolon DAD detektor
HPLC - Etopozid příprava vzorku 200 μl vzorku + 20 μl I.S. (difenylhydantoin) protřepat přidat 5 ml dichlormetanu 5 min třepat centrifugace (5 min, 3000 ot/min) odpipetovat 4 ml org. vrstvy sušení při 37 C rozpuštění odparku ve 100 μl MF Chromatografické podmínky DAD detektor, 229 nm MF: ACN:metanol:voda (45:20:35) průtok MF: 1,0 ml/min kolona: kolona Supelcosil LC-18, 15 cm x 4,6 mm x 5µm t: laboratorní
Záznam analýzy etopozid I.S. Kato Y. et al., Journal of Chromatography 57, 21-24, 2003
Koncentrace etopozidu ve sklivci při intravitreální aplikaci
Koncentrace etopozidu v plazmě
HPLC - Topotekan příprava vzorku 100 μl vzorku + 200 μl metanolu 10 s třepat centrifugace (5 min, 14 000 ot/min, 4 C) 50 μl nástřik Chromatografické podmínky DAD detektor, 267 nm MF: ACN:0,01 M KH 2 PO 4 (85:35) průtok MF: 1,5 ml/min kolona: Inertsil ODS 3V, 15 cm x 4,6 mm x 5µm t: 25 C
Záznam analýzy topotekan
Koncentrace topotekanu ve sklivci při intravitreální aplikaci
Koncentrace topotekanu v plazmě při intravitreální aplikaci
Koncentrace topotekanu v levém oku při intravitreální aplikaci 2 μg 0,16 0,14 0,12 koncentrace (ug/ml) 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 1 2 3 králíci 4 5 6
VÝSLEDKY Etopozid Periokulárně Sklivec: nulová koncentrace Plazma: 1,9 7,7 μg/ml AUC: 374,7 μg/ml.h Intravitreálně Sklivec: 87 251 μg/ml Plazma: 1,9 3,2 μg/ml AUC sklivec : 928,7 μg/ml.h AUC plazma : 233,1 μg/ml.h Topotekan Intravitreálně 1 μg Sklivec: 0,24 0,46 μg/ml Plazma: 0 0,36 μg/ml AUC sklivec : 2,155 μg/ml.h AUC plazma : 1,067 μg/ml.h Intravitreálně 2 μg Sklivec: 0,66 1,35 μg/ml Plazma: 0,25 0,81 μg/ml AUC sklivec : 5,338 μg/ml.h AUC plazma : 3,136 μg/ml.h
ZÁVĚR peribulbární aplikací nelze docílit terapeutických hladin cytostatik ve sklivci králíka stabilní terapeutické hladiny byly dosaženy intravitreální aplikací transkorneální intravitrealní aplikace se ukázala nejvhodnějším způsobem aplikace cytostatik do sklivcového prostoru králičího bulbu pro snížení rizika diseminace tumoru přímá aplikace cytostatik do sklivce by mohla být u vybraných případů zavedena do praxe Práce byla podpořena granty IGA MZd ČR NR/9532-3/2007 a GAUK 63008
Děkuji Vám za pozornost