PAT kvalitativní a kvantitativní stanovení na IDgelových kartách Eliška Rýznarová LABMED Systems s.r.o. Princip testu Přímým antiglobulinovým (Coombsovým) testem (PAT) prokazujeme in vivo navázané imunoglobuliny a nebo složky komplementu na erytrocyty. Prokazujeme senzibilizaci ery. 1 2 Kdy se PAT provádí (1) V případě podezření na: 1. hemolytické onemocnění novorozenců (HON) 2. autoimunní hemolytickou anémii (AIHA) 3. hemolytickou transfuzní reakci (HTR) 4. medikaméntozně indukovanou hemolýzu Dále jako: 5. Negativní kontrola při průkazu ery antigenů nepřímým Coombsovým testem (NAT) 3 Kdy se PAT provádí (2) 6. V případě podezřelých laboratorních nálezů: pozitivní ctl / Rh kontrola pozitivní autokontrola (vlastní ery + vlastní sérum/plazma) pozitivní zkouška kompatibility vždy s určitými ery dárce (v 1 případu na 70 až 80 000 obyvatel je u dárce PAT + ) 4 1
Klinický význam PAT Pozitivní PAT při HON, AIHA nebo HTR diagnostikuje urychlenou destrukci ery na imunologickém podkladě s intra nebo extravaskulární hemolýzou ve slezině nebo játrech. Stupeň hemolýzy ery závisí na množství navázaných Ig nebo komplementu. Lýza ery Intravaskulární hemolýza: vždy při inkompatibilitě v AB0 a jiných systémech, kdy protilátka aktivuje komplement Extravaskulární hemolýza: v případě, kdy protilátky komplement neváží a senzibilizované ery jsou odstraňovány v RES 5 6 Imunoglobuliny IgG (1) Rozděleny do 4 podtříd: IgG1, 2, 3, 4 IgG1 a IgG3 mohou aktivovat komplement IgG2 a IgG4 aktivují komplement zřídka Podtřídy IgG1 a IgG3 jsou považovány za klinicky významné Aby mohlo dojít k indukci fagocytózy, musí být erytrocyt pokryt: 1 000 až 4 000 molekulami IgG1 nebo 135 až 500 molekulami IgG3 Imunoglobuliny IgG (2) Ery senzibilizované IgG mohou být předmětem: rychlého odbourávání fagocytózou a nebo na protilátkách závislou a buňkami zprostředkovanou cytotoxicitou, vyúsťující v extravaskulární hemolýzu ery ve sleziněči játrech (ADCC antibody dependent cell cytotoxicity) 7 8 2
Technika a citlivost PAT (1) PAT by měl být prováděn s polyspecifickým AGH, obsahujícím alespoň antiigg + C3d Technika a citlivost PAT (2) PAT je pozitivní, pokud je na erytrocyt vázáno: 100 až 500 molekul IgG 400 až 1100 molekul C3d složky komplementu Poznámka: Při vazbě komplementu in vivo zůstává na povrchu obvykle jen fragment C3d, což je způsobeno enzymatickou aktivitou v krevním oběhu pacienta. Komplement vázaný in vitro je obvykle C3b (C3c + C3d). 9 10 Pozitivní PAT (1) Nutné další testování zjištění příčiny. Ne každý pozitivní PAT je však spojen se zkrácenou dobou přežívání ery. Negativní PAT nevylučuje možnost procesu hemolýzy: daná protilátka může mít nízkou afinitu vazbu Ig na ery nemůžeme prokázat, protože je pod prahem citlivosti laboratorního testování Pozitivní PAT (2) Je nutno posuzovat společně s klinickým obrazem a dalšími laboratorními parametry: hemoglobin (Hb) hematokrit (Hk) laktátdehydrogenáza (LDH) haptoglobin retikulocyty hladina imunoglobulinů 11 12 3
Příklad: HON, novorozenec B Rh+, CcD.ee, Kmatka antid PAT a CTL Reakce nemusí spolu vzájemně souhlasit: U pozitivní CTL je často také PAT pozitivní U pozitivního PAT je obvykle CTL negativní U negativní CTL může být PAT pozitivní CTL není náhradou za PAT. 13 pokračování: Novorozenec: při vyšetření KS, fenotypu Rh a K na IDKartě zjištěny rozdíly: s polyklonálními reagenty falešně pozitivní reakce na 4+, ctl 4+ s monoklonálními reagenty ctl negativní a reakce s antid negativní, nutno ověřit Rh po eluci (zablokované ery antid protilátkou od matky a nemožnost reakce s dg. antid?) IDKarta DCScreening I prokázána senzibilizace ery novorozence IgG na 4+ Provedena eluce protilátek z ery novorozence. Zjištěno: v eluátu antid a ery novorozence Rh+14! Novorozenec prokázána senzibilizace ery IgG na 4+ pokračování: Jaké Rh má novorozenec? Nespecifické reakce s dg.polyklonálními, opakováno s dg.monoklonálními. Třeba vyšetřit PAT! 15 IDKarta DCScreening I 16 4
Novorozenec prokázána senzibilizace ery IgG jaké je Rh? V eluátu z ery novorozence prokázána antid protilátka Pokračování: Pokračování: Je novorozenec Rh negativní nebo Rh pozitivní? Třeba ověřit po eluci. Vyšetření eluátu proti panelu typových ery: zjištěna antid autokontrola: vlastní ery + vlastní sérum pozitivní = volná antid v séru 17 18 Novorozenec je po eluci protilátky antid chloroquinem Rh pozitivní! Závěr: ID gelové karty 1. LISS / Coombs Epitopy D antigenu na ery novorozence byly zablokovány antid protilátkou od matky. 2. 3. 4. 5. Po eluci reagují ery pozitivně s antid na IDKartě s monoklonálními dg. (antiigg, C3d) Coombs AntiIgG DC Screening II (IgG, C3d, ctl / IgG, C3d, ctl) DC Screening I (IgG, IgA, IgM, C3c, C3d, ctl) DAT IgG Dilution (antiigg 1:10, 1:30, 1:100, 1:300, 1:1000, ctl) 6. DAT IgG1 / IgG 3 (antiigg1 1:1, 1:100 / antiigg3 1:1, 1:100 / antiigg 1:10) 19 20 5
1. LISS / Coombs IDKarta LISS/Coombs se používá pro rutinní testování PAT (NAT: protilátek, zk.kompatibility) IDKarta se 6 mikrozkumavkami, obsahuje polyspecifické AGH (králičí antiigg, monoklonální antic3d, klon C 1399) AntiIgG není specifický pro těžké (H) řetězce γ, může reagovat i s lehkými (L) řetězci Kappa a Lambda tedy s i s IgA a IgM. Poznámka: Vzájemný poměr lehkých řetězců Kappa a Lambda ve všech molekulách Ig v organismu je specifický pro každý živočišný druh. U člověka je 65:35. Vyšetřované ery se ředí IDDiluentem 2 (50µl) Do IDKarty 50µl ery, 10 min v IDCentrifuze 21 LISS / Coombs pozitivní výsledek 22 2. Coombs AntiIgG IDKarta se 6 mikrozkumavkami, obsahuje králičí antiigg. Detekce antiigg je nejdůležitější funkcí AGH. Použití antiigg AGH neinterferuje se složkami komplementu, které se mohou vázat na ery nespecificky. Protilátky, detekovatelné pouze díky jejich schopnosti vázat komplement jsou ojedinělé. 23 3. DC Screening II IDKarta je pro vyšetření 2 pacientů a obsahuje: IgG, C3d, ctl / IgG, C3d, ctl IDKarta umožní v jednom kroku rozlišit mezi IgG nebo C3d vázanými na ery Ery nepropírat (aby se vazba komplementu neuvolnila), ředit v IDDiluentu 2 24 6
4. DC Screening I IDKarta obsahuje: IgG, IgA, IgM, C3c, C3d, ctl IDKarta umožní v jednom kroku rozlišit mezi IgG, IgA, IgM a složkami komplementu C3c nebo C3d vázanými na ery Ery nepropírat (aby se vazba komplementu a IgM neuvolnila), ředit v IDDiluentu 2 DC Screening I DCScreening II Umožní v jednom kroku rozlišit mezi třídami Ig nebo komplementem, vázaným na ery: IgG, IgA, IgM, C3c, C3d, ctl (DCScr.I) IgG, C3d, ctl / IgG, C3d, ctl (DCScr.II) Detekce IgG navázaných na ery je nejdůležitější funkcí AGH, nicméně detekce složek komplementu je důležitá při vyšetřování pacientů s AIHA. 25 26 DCScreening I a II hodnocení výsledků (1) Výsledky testování s monospecifickými reagenty pomáhají definovat klinický stav pacienta: Smíšený typ AIHA průkaz IgG i C3 AIHA s tepelnými protilátkami (WAIHA warm autoimmune haemolytic anaemia) nejčastěji je prokazována IgG senzibilizace ery ve 24 % IgG i C3 v 7% pouze samotný komplement mohou být přítomny i IgM, IgA 27 DCScreening I a II hodnocení výsledků (2) Onemocnění chladových aglutininů (CAD Cold Agglutinin Disease): častá senzibilizace ery pouze složkami komplementu mohou být přítomny i IgM, IgA Paroxysmální chladová hemoglobinurie (PCH Paroxysmal Cold Haemoglobinuria): senzibilizace ery pouze složkami komplementu pokud ale ery předem propereme 4 C fyziologickým roztokem, pak lze detekovat také IgG autoprotilátky K rozlišení CAD od PCH napomáhá test průkazu bifázických hemolyzinů: DonathLandsteinerův test (diagnostikuje chladovou hemoglobinurii) 28 7
IDKarta: 5. DAT IgG Dilution (1) Umožňuje indikaci klinické závažnosti pozitivního výsledku PAT v souvislosti s AIHA, HTR a HON a odhad rizika hemolýzy nebo HON. Je určena k posouzení relativního množství IgG vázaného na ery V případech, kdy je pozitivní NAT lze také stanovit hladinu IgG i séru /plazmě pomocí korespondujících IDDiaCell DAT IgG Dilution (2) IDKarta: Obsahuje antiigg v ředění: 1:10, 1:30, 1:100, 1:300, 1:1000, ctl Testované ery musí být předem 3 x proprány a naředěny na 0,8% suspenzi IDDiluentem 2 Po pipetování ery do karet, ihned centrifugovat 10 min v IDCentrifuze 29 30 DAT IgG Dilution hodnocení reakcí DAT AntiIgG Dilution titr 1:1000 závažné riziko hemolýzy Titr antiigg: ředění antiigg reakce 1 : 10 1 : 30 ± 1 : 100 Titr 1:30 je nezávažný, stanovení podtříd není nutné 1:300 1:1000 ctl ředění antiigg reakce 1 : 10 1 : 30 1 : 100 1:300 1+ 1:1000 ctl Titr 1:300 je klinicky závažný s rizikem hemolýzy, stanovení podtříd je nezbytné 31 32 8
DAT AntiIgG Dilution titr 1:1000 závažné riziko hemolýzy do titru 1:30 je riziko nezávažné 33 6. DAT IgG1 / IgG3 (1) IDKarta je určena k diferenciaci mezi nízkou a vysokou mírou rizika hemolýzy způsobené AIHA nebo HON IDKarta umožní definovat rizikové množství klinicky závažných podtříd IgG, IgG1 a IgG3 vázaných na ery IDKarta obsahuje dvě různáředění antiigg1 a antiigg3 : antiigg1 1:1, 1:100 antiigg3 1:1, 1:100 ctl antiigg 1:10 Testované ery musí být předem 3 x proprány a naředěny IDDiluentem 2 34 DAT IgG1 / IgG3 (2) DAT IgG1 / IgG3 hodnocení výsledků Aby mohlo dojít k indukci fagocytózy, musí být erytrocyt pokryt: 1000 4000 molekulami IgG1 nebo 135 500 molekulami IgG3 Na IDKartě představuje ředění 1:1 mez citlivosti: pro antiigg1 cca 1000 IgG1 molekul / ery pro antiigg3 cca 125 molekul IgG3 / ery Pozitivní reakce u druhého ředění 1:100 pak indukuje vysokou koncentraci IgG1 a IgG3 na ery a vysoké riziko hemolýzy 35 Nízká koncentrace molekul IgG1, IgG3 na ery = nízké riziko hemolýzy Vysoká koncentrace molekul IgG1, IgG3 na ery = vysoké riziko hemolýzy reakce antiigg1 1:1 1:100 antiigg3 1:1 1:100 ctl antiigg 1:10 riziko nízké vysoké vysoké nízké nízké vysoké 36 9
DAT IgG1 / IgG3 vysoké riziko hemolýzy Nízká koncentrace molekul IgG1, IgG3 na ery = nízké riziko hemolýzy Vysoká koncentrace molekul IgG1, IgG3 na ery = vysoké riziko hemolýzy 37 Závěr Pouze DiaMed nabízí kompletní řadu IDKaret, která umožní komplexní řešení a dořešení problému při pozitivitě PAT: 1. LISS / Coombs (antiigg, C3d) 2. Coombs AntiIgG 3. DC Screening II (IgG, C3d, ctl / IgG, C3d, ctl) 4. DC Screening I (IgG, IgA, IgM, C3c, C3d, ctl) 5. DAT IgG Dilution (antiigg 1:10, 1:30, 1:100, 1:300, 1:1000, ctl) 6. DAT IgG1 / IgG 3 (antiigg1 1:1, 1:100 / antiigg3 1:1, 1:100 / antiigg 1:10) 38 Děkuji za pozornost 39 10