Protilátky třídy IgM proti viru Epstein-Baarové Návod na použití WESTERNBLOT testu Objednací číslo Protilátky proti Třída Ig Substrát Formát DY 2790-1601 M DY 2790-2401 M Virus Epstein- IgM Baarové (kompletní antigeny) Westernblotové proužky potažené antigeny 16 x 01 (16) 24 x 01 (24) Indikace: Infekce virem Epstein-Baarové (infekční mononukleosa, Burkittův lymfom, karcinom nosohltanu). Princip testu: WESTERNBLOT test umožňuje kvalitativní in-vitro stanovení lidských protilátek proti antigenům viru Epstein-Baarové (EBV). Test obsahuje proužky s elektroforeticky rozdělenými extrakty antigenů z EBV. V prvním reakčním kroku se proužky blotu inkubují s ředěnými vzorky séra pacientů. V případě pozitivních vzorků, se specifické protilátky třídy IgM (také IgA a IgG) navážou na antigeny. K detekci navázaných protilátek slouží druhá inkubace provedená s protilátkou proti lidským IgM značenou enzymem (enzymový konjugát), která je schopna vyvolat barevnou reakci. Obsah kitu: - Testovací pružky s elektroforeticky rozdělenými antigeny EBV: 16 proužků - Enzymový konjugát: 10 x koncentrované alkalickou fosfatasou značené kozí anti-lidské IgM protilátky; 1 x 3 ml, které po na ředění poskytnou 30 ml konjugátu připraveného pro užití - Koncentrovaný pufr: 1 x 50 ml 10 x koncentrovaného pufru pro přípravu 500 ml universálního pufru Plus - Substrátový roztok : 1 x 30 ml 10 x koncentrovaného nitroblutetrazoliumchlorid/5-brom- 4-chlor-3-indolylfosfátu (NBT/BCIP) - Vyhodnocovací matrice - Vyhodnocovací protokol: 1 list - Inkubační komůrky: 2 x 8 kanálků - Plastová folie - Návod k použití Uskladnění: Diagnostický kit musí být skladován při teplotě mezi +2 o C až + 8 o C. Poznámka: Používejte vždy jen součásti, které mají stejné lot číslo. Upozornění: Některé reagencie jsou jedovaté (pufr, roztok chromogen/substrát). Vyvarujte se kontaktu s kůží. V případě kontaktu, omyjte kůži mýdlem a velkým množstvím vody. Příprava reagencií Upozornění: Všechny reagencie se musí nechat před použitím vytemperovat na pokojovou (+18 C až 25 C) teplotu. Potažené testovací proužky: Připravené pro užití. Neotvírejte balení s proužky dříve, než jsou pružky membrány vytemperované na pokojovou teplotu, zabráníte tím zvlhnutí jednotlivých proužků. Ihned po vyndání proužků, které budete užívat, přemístěte zbylé 1
proužky zpět do ochranného zalepovacího obalu a obal stiskem lepícího švu uzavřete. Zbylé proužky v již jednou otevřeném ochranném obalu se musí skladovat na suchém místě v rozmezí teplot +2 o C až + 8 o C. Universální pufr (10 x koncentrovaný): Pro přípravu universálního pufru Plus pro použití řádně protřepejte lahvičku (50 ml) a odeberte z lahvičky potřebné množství koncentrovaného pufru čistou pipetou a zřeďte je 1:10 deionizovanou, nebo destilovanou vodou. Na inkubaci jednoho proužku je potřeba 2 ml koncentrovaného pufru, který se naředí 18 ml deionizované, nebo destilované vody. Naředěný pufr je stabilní maximálně dva dny za teploty + 2 C až 8 C. Enzymový konjugát: Anti-lidské IgM jsou 10 x koncentrované. K přípravě enzymového konjugátu pro užití v testu odebereme z lahvičky potřebné množství konjugátu čistou pipetou a zředíme je 1:10 univerzálním pufrem. Na otestování jednoho proužku je potřeba 0,15 ml koncentrátu anti-lidského IgM, který se naředí 1,35 ml universálního pufru Plus. Substrátový roztok: Připravený pro užití. Uzavřete láhev ihned po použití, obsah je citlivý na světlo. Příprava vzorků: Vzorky séra a plazmy pro analýzu se ředí 1: 51 universálním pufrem Plus. Například, přidejte 30 µl séra k 1,5 ml naředěného universálního pufru a dobře promíchejte. Inkubace Blokování: Naplňte žlábky v inkubační komůrce podle počtu vzorků séra, které mají být testovány, a to tak, že do každého žlábku napipetujte 1,5 ml universálního pufru. Vyjměte potřebný počet testovacích proužků ze sáčku a vložte po jednom do žlábků. Číslo na proužku musí být dobře viditelné. Inkubujte 15 minut při pokojové teplotě na třepačce. Poté odsajte ze žlábků veškerou kapalinu. Inkubace vzorků: (1.krok) Promývání: Naplňte každý žlábek naředěným vzorkem séra a inkubujte při pokojové teplotě po dobu 30 minut na třepačce. Odsajte veškerou kapalinu z každého žlábku a promyjte 3 x 5 minut každý žlábek 1,5 ml universálního pufru za stálého třepání. Inkubace konjugátu: Napipetujte 1,5 ml ředěného enzymového konjugátu ( anti-lidské IgM (2. krok) kojugované s alkalickou fosfatasou) do každého žlábku a inkubujte při pokojové teplotě po dobu 30 minut na třepačce. Promývání: Odsajte veškerou kapalinu z každého žlábku a promyjte 3 x 5 minut každý žlábek 1,5 ml universálního pufru za stálého třepání. Inkubace substrátu: Napipetujte 1,5 ml roztoku substrátu do každého žlábku a (3. krok) inkubujte při pokojové teplotě po dobu 10 minut na třepačce. Zastavení: Odsajte veškerou kapalinu z každého žlábku a promyjte každý žlábek 3 x deionizovanou nebo destilovanou vodou. 2
Vyhodnocení a interpretace výsledků testu Anti-EBV-WESTERNBLOT (IgM) Postup zpracování výsledků: Proužky blotu po inkubaci položte na filtrační papír a opatrně je vysušte. Pomocí čisté lepící pásky je přilepte na plastovou folii, která je dodávána spolu s vyhodnocovacím protokolem. Položte vyhodnocovací matrici na nalepené bloty tak, že černý pružek nad čísly blotů je v jedné linii se značením ve vyhodnocovací matrici. Číslo šarže na vyhodnocovací matrici musí být identické s číslem na balení, ze kterého byly vyjmuty blotovací proužky. Jasně rozpoznatelné proužky na blotu, které zaujímají stejnou pozici jako vyznačené proužky na vyhodnocovací matrici, se zaznamenají do vyhodnocovacího protokolu. Pod číslem na proužku blotu je kontrolní proužek. Správné provedení inkubace je potvrzeno intenzivním vybarvením kontrolního proužku. Antigeny: Zdrojem antigenů pro EUROIMMUN Anti EBV WESTERNBLOT je celkový extrakt z P3HR1 buněk. Virový extrakt se rozdělil podle molekulové hmotnosti na diskontinuální elektroforeze na polyakrylamidovém gelu a proteiny se přenesly na nitrocelulosovou membránu. Z každé soupravy (kitu), se odeberou dva proužky a inkubují se s referenčním sérem Jeden z těchto proužků je součástí testu, druhý zůstává u EUROIMMUN pro potřeby dokumentace. Specifikace antigenů EBVna testovacích proužcích (číslo=molekulová hmotnost v kda). VCA (kapsidový EA (časný antigen) protein viru) p125, EA-R p93, EA-D p45, p65,p42,p41,p40,p33, EA-D p43 p22 (p22 je markerem pro pozdní fázi EBV ) EBNA (EB-jaderný antigen) EBNA 1 p79 Další antigeny p27 Interpretace výsledků: Ze zkušenosti víme, že výsledky EBV-WESTERNBLOT testu lze rozdělit do tří kategorií: negativní, nerozhodné a pozitivní výsledky. Třída IgG protilátek VCA Negativní Žádný z VCA proužků není pozitivní Nerozhodný Alespoň jeden VCA proužků je pozitivní se střední intenzitou Pozitivní Alespoň jeden VCA proužků je pozitivní se silnou intenzitou EA Negativní Žádný z EA proužků není pozitivní Nerozhodný Alespoň jeden EA proužků je pozitivní se střední intenzitou Pozitivní Alespoň jeden EA proužků je pozitivní se silnou intenzitou EBNA-1 Negativní EBNA-1 proužek je negativní Nerozhodný EBNA-1 proužek je se střední intenzitou Pozitivní EBNA-1 proužek je se silnou intenzitou 3
Třída IgM protilátek VCA Negativní Žádný z VCA proužků není pozitivní Nerozhodný Alespoň jeden VCA proužků je pozitivní se střední intenzitou Pozitivní Alespoň jeden VCA proužků je pozitivní se silnou intenzitou Vztah mezi průběhem a výsledky Anti-EBV-WESTERNBLOT testu Stav Negativní Primární Pozdní fáze Reaktivace Anti-EBV-WESTERNBLOT Žádný proužek, nebo jen velmi slabé signály Alespoň jeden silný VCA-proužek je pozitivní při detekci IgG- a IgM protilátek Poznámky: Asi u 5% pacientů se netvoří IgM protilátky proti VCA. Studie s klinicky charakterizovanými séry ukázaly, že v těchto případech protilátky třídy IgG proti VCA v kombinaci s protilátkami třídy IgM proti EBNA-1 a p27 ukazují na primární infekci. Při detekci IgG je pozitivní a alespoň jeden silný VCA- proužek. Poznámky: Asi u 5% pacientů se netvoří protilátky IgG proti EBNA-1, nebo je jejich titr zanedbatelný. Studie s klinicky charakterizovanými séry ukázaly, že v těchto případech protilátky třídy IgG proti VCA- proužek p22 ukazují na pozdní fázi. Při detekci protilátek třídy IgG je pozitivní proužek odpovídající EBNA-1 a alespoň jeden silný VCA- proužek a alespoň jeden silný EA proužek, nebo alespoň jeden silný VCA- proužek při detekci protilátek třídy IgM. Při detekci protilátek IgG je proužek EBNA-1 negativní a alespoň jeden VCA proužek při detekci IgG je pozitivní a VCA proužky při detekci IgM protilátek jsou negativní a alespoň jeden EA-proužek při detekci IgG je pozitivní. Následující kombinace výsledků jsou průkazné pro reaktivaci, stejně tak pro primární infekci se ztrátou protilátek proti EBNA-1: EBNA-1 proužek je negativní a alespoň jeden silný VCA proužek při detekci IgG protilátek je pozitivní. Při detekci protilátek třídy IgM jsou EA-proužky negativní a VCAproužky jsou také negativní. Klinické studie Pomocí testu EUROIMMUN Anti- EBV WESTERNBLOT bylo zkoumáno 143 klinicky charakterizovaných sér pacientů (Dr. Gaertner, University Hospital Saarland, Homburg/Saar, Německo). Stav Negativní (n=12) Reaktivace (n=30) WESTERN BLOTvýsledky Pozitivní Nerozhodné Negativní Pozitivní Nerozhodné Anti -VCA- IgM (%) 12 (100) 4 (13) 2 (7) Anti-VCA- IgG (%) 2 (17) 10 (83) 30 (100) Anti-EA- IgG (%) 3 (25) 9 (75) Anti-EBNA-1- IgG (%) 0(0) 12 )100) 22 (73) 4 (13) 4
Primární (n=15) Pozdní fáze (n=86) Negativní 24 (80) 4 (13) Pozitivní 8 (53) 13 (87) 20 (67) 4 (27) Nerozhodné 2 (13) 2 (13) 3(10) 2 (13) Negativní 5 (33)* 7 (13) 9 (60) Pozitivní Nerozhodné Negativní 85 (99) 1 (1) 76 (88) 7(8) 3(3)** Pět sér s primární infekcí EBV nevykázalo žádné anti-vca protilátky typu IgM. Dvě z těchti sér obsahovala kromě anti-vca protilátek typu IgG ještě protilátky typu IgM proti EBNA-1 a p27. Tři séra od pacientů v pozdní fázi nevykázala žádné protilátky typu IgG proti EBNA-1, ale tři séra vykázala protilátky IgG proti VCA-proužku p22. Všechna séra pacientů s pozdní fází vykázala protilátky typu IgG proti VCA-p22, zatímco žádné sérum pacientů v primární fázi neobsahovalo protilátky typu IgG proti VCA-p22 proužku. Klinický význam Virus Epstein-Baarové způsobuje infekční mononukleosu, horečnaté onemocnění se zánětem hltanu a lymfadenopathií, které je často doprovázené hepatosplenomegalií a zřídka vyrážkou. Avšak EBV se často dávají do spojitosti i Burkittovým lymfomem a karcinomem nosohltanu. Infekční mononukleosa se musí odlišit od cytomegalie a toxoplasmosy a v případě atypického vývoje i od HIV a dalších infekcí. Imunitní odpověď na EBV-CA patří mezi heterofilní protilátky a se zvýšením titru protilátek IgG se uplatňuje při indikaci primárního ranného stadia EBV. Jsou-li přítomné protilátky proti jadernému antigenu viru Epstei-Baarové (EBNA), jedná se obvykle o pozdní fázi EBV. Ačkoli se jaderné antigeny EBV, označované EBNA 1 až 6 syntetizují dříve, než další EBV antigeny (časné antigeny a antigeny kapsidového proteinu) v průběhu, jsou presentovány imunitnímu systému až po zničení B-buněk. Chronologicky se proto detekují dříve protilátky proti kapsidovým antigenům a časným antigenům EBV, než proti EBNA. Protilátky proti časným antigenům EBV (EA) se vyskytují u 70 až 80 % pacientů s infekční mononukleosou, ačkoli jen přechodně během akutní fáze. Vysoké titry protilátek proti EA označují chronickou infekci, nebo její reaktivaci. Avšak, tyto protilátky jsou také nalézány ve spojitosti s Burkittovým lymfomem a rakovinou nosohltanu. Sérologická diferenciace mezi primární infekcí EBV a reaktivací není vždy možná. Jestliže se určí protilátky pouze proti EBV-EA a nikoli proti EBV-CA nebo EBNA, předpokládáme, že jde o primární infekci. Jestliže se v tomtéž čase detekuji protilátky proti EBNA, jedná se o reaktivaci. Diferenciace mezi čerstvě probíhající infekcí a infekcí, která již nějakou dobu trvá, je velkou výzvou sérologie. V současnosti je nejběžnějším prostředkem diferenciace určení hladiny specifických protilátek třídy IgM, které by se měly obecně objevit vždy v počáteční fázi. Ale určení protilátek třídy IgM je velmi často nejisté a problematické. Interferenčními faktory je přetrvávající odpověď IgM, nedetekovatelná, nebo zpožděná tvorba IgM a nespecifická tvorba IgM způsobená polyklonální stimulací B-buněk. V 5 až 20 % všech případů čerstvé EBV nelze detekovat IgM protilátky proti EBV kapsidovému antigenu (EBV-CA), v 15% případů je tvorba IgM protilátek zpožděná, na druhé straně u 4 % pacientů IgM odpověď přetrvává. Pro bezpečné určení časné primární se v posledních letech užívá určení avidity protilátek třídy IgG: První reakcí 5
organismu na infekci je tvorba nízkoaviditních protilátek. V průběhu se tvoří stále více IgG protilátek s vyšší adaptací k antigenům a avidita roste. Proto jakmile v séru nejsou detekovány IgG protilátky s vysokou aviditou, předpokládá se, že je stále v počátečním stádiu (EUROIMMUN testovací systém pro určení avidity IgG protilátek proti EBV-CA). Literatura: 1. Koch H.G.: Infektionen mit dem Epstein-Barr-Virus. Deutsches Arzteblatt 7: 140 144 (1995). 2. Dopakte H.D., Schuy W.: Compact Epstein-Barr virus diagnosis based on defined antigen mix and specific IgA. Res.Virol. 147: 53-66 (1996). 3. Selgneurin J.-M.: Diagnostik von Infektionen mit dem Epstein-Barr-Virus. Diagnose und Labor 42: 83 89 (1992). 4. Dolken G., Weitzmann U., Boldt C., Bitzer M., Brugger, Lohr W.: Enzyme-Linked Assay for IgG Antiboduies to Epstein-Barr-Virus Associated Early Antigens and Viral Capsid Antigen. J. Immunol.Meth. 67: 225-233 (1984). 5. Porstmann T.: Epstein-Barr-Virus. Diagnostische Bibliothek 6/7 (1992). 6. Lennette E.T.: Epstein-Barr-Virus. Virology 74: 905-909 (1987). 6
Přehled diagnostiky EBV EBNA-1-IgG negativní VCA-IgG pozitivní VCA-IgG negativní Není VCA-IgM pozitivní nebo EBNA-1 a p27-igm pozitivní VCA-IgM negativní Primární EA-IgG silně pozitivní Primární, reaktivace nebo ztráta anti-ebna-1-protilátek v pozdní fázi EA-IgG negativní Reaktivace nebo ztráta anti-ebna-1 protilátek v pozdní fázi VCA-IgG p22 pozitivní Ztráta anti-ebna-1 protilátek v pozdní fázi EBNA-1-IgG pozitivní VCA IgG pozitivní a EA-IgG silně pozitivní nebo VCA-IgA silně pozitivní nebo VCA IgM pozitivní Jen VCA-IgG pozitivní Pozdní fáze reaktivace 7
EUROIMMUN - Protilátky proti EBV Návod na použití WESTERNBLOT testu PROTOKOL PRO INKUBACE Před upotřebením: vložte proužek blotu do inkubačního kanálku obsahujícího 1,5 ml univerzálního pufru 15 min, třepat 1. Inkubace vzorku Odsajte všechnu kapalinu, do inkubačního žlábku napipetujte 1,5 ml vzorku séra (1:51) 30 min, třepat Promývání: 3 x 5 min 2. Inkubace s konjugátem: Odsajte všechnu kapalinu, do inkubačního žlábku napipetujte 1,5 ml enzymového konjugátu (1:10) 30 min, třepat Promývání: 3 x 5 min 2. Inkubace se substrátem: Odsajte všechnu kapalinu, do inkubačního žlábku napipetujte 1,5 ml roztoku substrátu 10 min, třepat Zastavení: Odsajte všechnu kapalinu, promyjte vodou Vizuální hodnocení 8