P. BARTÁK, P. VÁCLAVEK, M. KOSTKOVÁ, K. MIKULÁŠKOVÁ, B. ŠIMEK

Prevalence lentivirových onemocnění malých přežvýkavců v ČR s využitím sérologické diagnostiky P. BARTÁK, P. VÁCLAVEK, M. KOSTKOVÁ, K. MIKULÁŠKOVÁ, B. ŠIMEK Státní veterinární ústav Jihlava SOUHRN Barták P., Václavek P., Kostková M., Mikulášková K., Šimek B. Prevalence lentivirových onemocnění malých přežvýkavců v ČR s využitím sérologické diagnostiky. Veterinářství 2017;67(3):227-232. Onemocnění maedi-visna ovcí (MV) a virová arteritida a encefalitida koz (CAE) patří do skupiny virů z čeledi Retroviridae, označované souhrnně jako lentivirové infekce malých přežvýkavců (SRLV). V současné době jsou MV a CAE rozšířeny po celém světě včetně České republiky. Na základě požadavků chovatelů vznikl výzkumný projekt, jehož cílem je zpracování programu zdravotní kontroly lentivirových infekcí malých přežvýkavců s využitím metod časné detekce infekce MV a CAE a genetické selekce na základě markerů genetické rezistence k infekci. Jedním z cílů projektu je vyvinutí postupu sérologické identifikace chovů jako prvního stupně programu eradikace. Pro potřebu řešení projektu bylo odebráno 3410 vzorků krve ovcí a koz z 23 chovů, z toho 2801 ovcí z 16 chovů a 609 koz ze sedmi chovů. Zjištěná sérologická prevalence MVV u ovcí je 19,9 % (556/2801) a celková prevalence CAEV u koz je 14,1 % (86/609). Prevalence v jednotlivých chovech se pohybovala v rozmezí 0 56,2 %. Z dostupných zdrojů byla sumarizována sérologická prevalence z monitoringu nákaz v letech 1997 2015. SUMMARY Barták P., Václavek P., Kostková M., Mikulášková K. Šimek B., Prevalence of lentiviral diseases in small ruminants in the Czech Republic with the use of serologic diagnostic. Veterinářství 2017;67(3):227-232. Maedi-visna (MV) and caprine arthritis-encephalitis (CAE) are infections belonging to the family of Retroviridae, which are persistent lentivirus infections within sheep and goats and are often grouped together as small ruminant lentiviruses (SRLVs). The current spread of MV and CAE is throughout the world including the Czech Republic. Due to the requirements of breeders has been launched a research project to determine how to control the lentiviral infections in small ruminants with the use of early detection methods of MV and CAE as well as genetic selection on the base of markers of genetic resistance to infection. One of the key targets of the project is to develop a method of serological identification of herds as the first phase of the eradication program. The total number of 3410 blood samples of sheep and goats from 21 herds, out of 2801 ovine samples from 16 herds and 609 caprine samples from seven herds were collected for the purpose of the project. Detected serological prevalence of MVV in sheep was 19.9% (556/2801) and prevalence of CAE in goats was 14.1% (86/609). Prevalence amongst individual herds ranged between 0 and 56.2%. From accessible sources of diseases monitoring was summarized the serological prevalence during the years 1997 to 2015. Úvod Původci onemocnění maedi-visna ovcí (MV) a virová arteritida a encefalitida koz (CAE) přísluší do čeledi Retroviridae, rod Lentivirus, kam mimo jiné náleží i virus infekční anémie koní nebo virus HIV 1 jako původce AIDS. Historicky bylo onemocnění s klinickými projevy progresivní pneumonie poprvé popsáno v jižní Africe v roce 1915. 1 Současný název maedi-visna pochází z islandštiny podle typických klinických projevů dyspnoe (maedi) a nervových příznaků (visna). Nejzávažnější epizootie MV v historii byla zaznamenána na Islandu, kam byla infekce zavlečena importem karakulských ovcí z Německa v roce 1933, které byly dovezeny za účelem zvýšení VETERINÁŘSTVÍ 3/2017 227

užitkovosti původního primitivního plemene krátkoocasé islandské ovce. 2 MV je charakteristická dlouhou inkubační dobou několika měsíců až let. V produkčních chovech se většina infikovaných zvířat nedožívá takového věku, aby se mohly klinické příznaky projevit. Hlavní cesty přenosu viru jsou požití infikovaného kolostra nebo mléka jehňaty od matek nebo inhalace respiratorních sekretů i mezi dospělými jedinci, do úvahy přichází i transplacentární přenos. 3 Virus MV infikuje buňky kostní dřeně promonocyty, které posléze cirkulují v krevním řečišti jako monocyty a následně maturují ve tkáních do formy makrofágů, v nichž probíhá replikace viru. Kostní dřeň tedy slouží jako rezervoár viru v organismu, ze kterého se uvolňují infikované monocyty do periferního krevního oběhu a do tkání. 3 Pokud dojde k progresi onemocnění, projevuje se zejména postižením plic ve formě dyspnoe s patologickým nálezem intersticiální pneumonie a mléčné žlázy ve formě chronické intersticiální lymfocytární mastitis. Postižení CNS je výjimečné a vyskytovalo se prakticky pouze v době islandské epizootie. 4,5 CAEV je virus blízce příbuzný MVV, je však samostatným druhem rodu Lentivirus. Přirozený mezidruhový přenos nebyl potvrzen, experimentální infekce ovcí CAEV a koz MVV je možná. CAE u koz má specifické klinické projevy, od nichž je odvozen název a které jsou odlišné od klinických projevů MV u ovcí. Dominujícími příznaky jsou chronická polyartritida, synovitida a bursitida, postižení CNS ve formě encefalitidy je vzácnější a vyskytuje se prakticky pouze u kůzlat mezi dvěma až šesti měsíci věku. 4,5 Na rozdíl od jiných lentivirových infekcí (HIV, FIV) nejsou u MV a CAE popsány příznaky imunodeficience. Infikovaná zvířata zůstávají imunokompetentní a reagují na infekci tvorbou specifických protilátek, ale humorální odpověď na infekci MVV je významně pomalejší než u jiných virových infekcí s akutním průběhem. K sérokonverzi dochází různě, a to od několika týdnů do několika měsíců po infekci. Bylo zjištěno, že neutralizační protilátky v organismu zvířat nejsou účinné v eliminaci viru, ale naopak napomáhají ve složitém mechanismu perzistence viru. Součástí tohoto procesu je intenzivní glykosylace neutralizačních epitopů viru bránící účinné vazbě protilátek a vysoká frekvence mutací se vznikem vysokého počtu neutralizačních variant v důsledku selekčního tlaku humorální imunity. Protilátky typu IgG po přirozené infekci MVV/CAEV jsou přítomné po celou dobu života zvířete a slouží jako základní indikátor monitorování nákazy v chovech a selekční kritérium při eliminaci nákazy. 5 Lentivirové infekce mohou být v laboratorních podmínkách diagnostikovány jak virologickými, tak sérologickými metodami. Obecně je doporučována kombinace minimálně dvou testů kvůli konfirmaci výsledků. Jako optimální postup laboratorní diagnostiky lentivirových infekcí je doporučována kombinace ELISA testu a přímého průkazu metodou PCR. 6 Základem diagnostiky SRLV infekcí jsou sérologické metody zahrnující spektrum ověřených laboratorních technik jako imunodifuzní test (IDT/ AGID), různé varianty imunoenzymatických testů (ELISA), radioimunoanalýzu (RIA), radioimunoprecipitaci (RIPA) a Western blot (WB). Obecně lze sérologické testy rozdělit na screeningové testy (ELISA, IDT) a testy s vyšší náročností provedení používané na konfirmaci (RIPA, RIA, WB). IDT test je postaven na celém viru a detekuje zejména protilátky proti kapsidovému proteinu p25viru MV (u koz p28 viru CAE) a obalovému glykoproteinu gp135. Specifita imunodifuzního testu se pohybuje kolem 98,3 %, ale nevýhodou je jeho nízká senzitivita (76 %). Proto bývá využíván jako orientační test a za určitých okolností může být použit i pro konfirmaci výsledku získaného ELISA testem. 6,7 Za účelem screeningu či monitoringu ELISA test postupně nahradil IDT ve všech laboratořích a od roku 2004 je používán jako test první volby pro mezinárodní obchod. ELISA test je ve srovnání s IDT testem značně rychlejší (2 3 hodiny vs. 2 3 dny) a umožňuje zpracování velkého množství vzorků najednou. Složitější testy, jako je WB a RIPA, jsou relativně nákladné a časově náročné, a proto jsou používané spíše pro výzkumné účely. V současné době je MV rozšířena po celém světě včetně České republiky. Stupeň rozšíření a související ekonomické ztráty jsou obtížně vyčíslitelné, vzhledem k nedostatku seriózních epidemiologických studií a obtížnosti hodnocení možných ekonomických dopadů. Hlavním dokumentovatelným ekonomickým dopadem je omezení mezinárodního i domácího obchodu s chovnými zvířaty, kde je základním zdravotním kritériem nákazový status chovu, tj. chov prostý nákazy. Sledování výskytu MV a CAE v ČR v rámci monitoringu nákaz začíná na počátku 90. let s využitím komerčně dostupných diagnostických testů. Počty vyšetření v letech 1997 2015 jsou uvedeny v tabulkách 1 a 2. Vyšetřování v rámci Metodiky kontroly zdraví SVS ČR na náklady státu je v současné době prováděno pouze v chovech zařazených v kontrole užitkovosti (KU). Hospodářství musí být prosté na základě vyhodnocení laboratorního vyšetření z předešlého roku ze strany KVS anebo se jedná o nové hospodářství zařazené do kontroly užitkovosti, respektive již ozdravené hospodářství. Pozitivní hospodářství z předešlých let může být do monitoringu zařazeno až po ozdravení a na základě rozhodnutí příslušné KVS SVS. V hospodářstvích (stádech), v nichž se provádí kontrola užitkovosti, se vyšetření provádí 1x ročně. Do reprezentativního počtu zvířat se zařazuje 25 % samičích zvířat (všech plemen) starších 12 měsíců nebo v laktaci, a to nejméně 50 samičích zvířat (je-li v hospodářství méně než 50 zvířat, musí být vyšetřena všechna starší 12 měsíců, nebo která jsou v laktaci) a všichni nekastrovaní samci starší šesti měsíců, vyjma jatečných beránků. Opatření pro eradikaci nákazy v pozitivních chovech ve formě ozdravovacího programu nebo povinnost periodické kontroly nebyla doposud závazně 228 VETERINÁŘSTVÍ 3/2017

Tab. 1 Sérologický monitoring maedi-visna (MV) v ČR v letech 1997 2015 8 Rok Počet vyšetřených Využití testů zvířat IDT/ELISA v % Pozitivních Prevalence (%) 1997 7 211 100/0 88 1,22 1998 4 732 100/0 52 1,10 1999* 3 084 100/0 53 1,72 2000 9 081 100/0 545 6,00 2001 12 804 100/0 228 1,78 2002 12 518 100/0 179 1,43 2003 13 494 99,4/0,6 68 0,50 2004 12 388 98,9/1,1 452 3,65 2005 10 404 65,1/34,9 346 3,33 2006 11 548 53,5/46,5 365 3,16 2007 11 163 23,6/76,4 336 3,01 2008 11 568 28,4/71,6 116 1,00 2009 11 381 14,3/85,7 73 0,64 2010 12 668 0,3/99,7 216 1,71 2011 11 682 0,1/99,9 138 1,18 2012 11 345 0,1/99,9 37 0,33 2013 14 376 0/100 317 2,21 2014 14 370 0/100 16 0,11 2015 14 295 0/100 15 0,10 Tab. 2 Sérologický monitoring artritidy a encefalitidy koz (CAE) v letech 1997 2015 8 Rok Počet vyšetřených Využití testů zvířat (IDT/ELISA) v % Pozitivních Prevalence (%) 1997 1 727 100/0 23 1,33 1998 569 100/0 2 0,35 1999* 201 100/0 3 1,49 2000 653 100/0 7 1,07 2001 468 100/0 0 0,00 2002 302 100/0 0 0,00 2003 240 99,2/0,8 2 0,83 2004 199 97,0/3,0 28 14,07 2005 136 79,4/20,6 2 1,47 2006 92 70,7/29,3 2 2,17 2007 215 78,6/21,4 3 1,40 2008 170 64,1/35,9 4 2,35 2009 807 32,7/67,2 12 1,49 2010 2849 0,9/99,1 72 2,53 2011 3167 0,1/99,9 137 4,33 2012 3095 0,1/99,9 29 0,94 2013 3989 0/100 131 3,28 2014 4047 0,1/99,9 10 0,25 2015 4991 0/100 24 0,48 * data pouze z SVÚ Jihlava stanovena, nicméně jediným možným postupem byla radikální metoda postupné eliminace séropozitivních zvířat. Tímto způsobem bylo postupně dosaženo ozdravení prakticky všech chovů zařazených do kontroly užitkovosti. Výjimku z těchto podmínek mají stáda šumavské ovce, která je zařazena do světového genofondu ohrožených druhů hospodářských zvířat, a u níž by eradikace znamenala zánik tohoto vzácného plemene s úzkou plemennou základnou. Na základě požadavků chovatelů vznikl výzkumný projekt, jehož cílem je vyvinutí programu zdravotní kontroly lentivirových infekcí malých přežvýkavců s využitím metod časné detekce infekce MV a CAE a genetické selekce na základě markerů genetické rezistence k infekci. Do projektu byly zařazeny vybrané chovy šumavské ovce a další chovy ostatních plemen mimo KU. Jedním z cílů projektu je vyvinutí postupu sérologické identifikace chovů jako součásti programu eradikace, na kterou navazují postupy detekce viru metodami molekulární biologie (polymerázová řetězová reakce PCR) a identifikace markerů genetické rezistence. Materiál a metodika Odběr vzorků biologického materiálu Pro diagnostické účely byla odebrána periferní krev zvířat (věková kategorie: minimálně čtyři měsíce po odstavu) se zaměřením na chovy, u kterých se neprovádí pravidelné zdravotní zkoušky cílené na průkaz protilátek proti SRLV v rámci metodiky kontroly zdraví zvířat. Odebraná krev, která byla ošetřena antikoagulantem K 3 EDTA, byla testována po separaci plasmy a krevních elementů na průkaz protilátek i provirové DNA. Vzorky byly odebírány v počtu tří od jednoho jedince. Jeden vzorek byl vždy uložen na Jihočeské univerzitě v Českých Budějovicích a dva vzorky v laboratořích SVÚ Jihlava. Vzorky jsou archivovány v hlubokomrazicím boxu při 80 C. Bylo odebráno 3410 vzorků krve ovcí a koz z 21 chovů, z toho 2801 ovcí z 16 chovů a 609 koz ze sedmi chovů. Diagnostické metody Pro sérologickou diagnostiku k průkazu protilátek proti lentivirům byly použity komerční ELISA testy čtyř výrobců IDEXX MVV/CAEV p28 Ab Screening Test (IDEXX, USA), IDEXX MVV/CAEV p28 Ab Verification Test (IDEXX, USA), IDEXX CAEV/MVV Total Ab Test (IDEXX, USA), Elitest MVV/CAEV (HYPHEN BioMed, Francie), ID Screen MVV/CAEV Indirect (IDvet, Francie), Small Ruminant Lentivirus Antibody Test Kit (VMRD Inc., USA) a jeden komerční imunodifuzní test AGID MAEDITEC (APHA Scientific, UK). Charakteristika jednotlivých testů je uvedena v tabulce 3. Základním testem pro screening byl zvolen ELISA test IDEXX MVV/CAEV p28 Ab Screening Test. Jako konfirmační test byl použit ELISA test IDEXX MVV/CAEV p28 Ab Verification Test, kterým byly testovány všechny suspektní vzorky s hodnotou S/P 0,6 1,2. Vybrané vzorky byly testovány dalšími jmenovanými ELISA testy a imunodifuzním testem. Výsledky ELISA testů byly hodnoceny podle kritérií daných výrobcem. Výsledky sérologické diagnostiky Celkem bylo identifikováno 642 sérologicky pozitivních zvířat z celkového počtu 3410, což představuje prevalen- VETERINÁŘSTVÍ 3/2017 229

Tab. 3 Přehled testů pro sérologickou diagnostiku MVV/CAEV v krevním séru ovcí a koz Název testu Typ testu Antigeny viru MV/CAE v testu IDEXX MVV/CAEV p28 Ab Screening nepřímý ELISA test ci 18,8 %. Prevalence v jednotlivých chovech se pohybovala v rozmezí 0 56,2 %. Celková prevalence MV u ovcí byla 19,9 % (556/2801) a celková prevalence CAE u koz byla 14,1 % (86/609). V 17 vzorcích nebylo možno identifikovat jejich status použitými testy a jsou hodnoceny jako dubiózní. Výsledky jsou uvedeny v tabulkách 4. a 5. Protilátky proti viru MV byly zjištěny v osmi chovech ze šestnácti a CAE ve třech chovech ze sedmi. Dalšími testy bylo konfirmováno celkem 371 vzorků (tabulka 6). Celkem 109 vzorků bylo testováno všemi uvedenými ELISA testy a imunodifuzním testem (tab. 7). imunogenní peptidy z transmembránových proteinů (TM, ENV gene) a rekombinantního proteinu p28 virové kapsidy (GaG gene) 7 imunogenní peptidy z transmembránových proteinů (TM, IDEXX MVV/CAEV p28 Ab nepřímý ELISA test dvoujamkový verifikační formát ENV gene) a rekombinantního proteinu p28 virové kapsidy Verification (GaG gene) 7 IDEXX CAEV/MVV Total Ab nepřímý ELISA test inaktivovaný virový antigen MVV (kmen OLV)9,10,11 Elitest MVV/CAEV (Hyphen) ID Screen MV Indirect (IDvet) SRL Ab test Kit (VMRD) nepřímý ELISA test nepřímý ELISA test kompetitivní ELISA syntetický peptid transmembránového proteinu gp46 a rekombinantní protein p25 kapsidy MVV 7,12 kombinace peptidů MVV/CAEV z oblasti GAG, TM a ENV genu 13,14 povrchový protein gp135 viru CAEV-63 navázaný monoklonální protilátkou F7-299 15,16 AGID MAEDITEC (AHVLA) imunodifuzní test celý virus 6,7,17 Tab. 4 Séroprevalence viru Maedi-Visna (MVV) v chovech ovcí v roce 2016 Chov/ Počet Prevalence Kraj Okres farma č. vzorků pozitivní dubiózní negativní % 1 JHC ČB 8 0 0 8 0 2 JHC ST 50 0 2 48 0 3 JHC JH 2 0 0 2 0 4 JHC PT 200 97 3 100 48,5 5 JHC ČK 50 0 0 50 0 6 JHC ČB 248 0 1 247 0 7 JHM BM 42 0 0 42 0 8A KVK KV 280 63 1 216 22,5 8B KVK KV 299 146 1 152 48,8 9 LBK JN 431 42 3 386 9,7 10 LBK LI 206 0 1 205 0 11 OLK JS 274 154 0 120 56,2 12 PAK SY 50 0 1 49 0 13 PLK KT 150 24 1 125 16 14A PLK KT 230 20 0 210 8,7 14B PLK KT 100 10 0 90 10 15 PLK KT 90 0 0 90 0 16 PLK KT 91 0 0 91 0 Celkem 2801 556 14 2231 19,9 % Diskuse Prevalence MV a CAE při sérologickém monitoringu v letech 1997 2015 se jeví jako překvapivě nízká, přestože na začátku 90. let byla odhadována kolem 60 %. 2 Nalezené záznamy o provedených vyšetřeních z roku 1993 v části ČR uvádí procento pozitivity mezi 3 80 % v devíti okresech z 33, celková průměrná pozitivita byla 16,2 %. 8 Další výsledky sledování ze samotného počátku tohoto období se bohužel nepodařilo dohledat. První reálně dokumentované navazující výsledky od roku 1997 ukazují prevalenci mírně nad 1 % s maximem 6 % pozitivních nálezů v roce 2000, kdy byl pravděpodobně monitoring rozšířen na další neidentifikované chovy. Avšak hned v následujících letech 2001 až 2003 pak postupně klesá prevalence až na 0,5 %. 8 Následné zvýšení na hodnoty nad 3 % souvisí se zavedením ELISA testů do systému monitoringu, kde se projevila vyšší senzitivita ELISA testu oproti do té doby používanému IDT. Lze tedy předpokládat, že v tomto časovém období existovaly chovy s vysokou incidencí séropozitivních nálezů, které byly postupně ozdravovány nebo z monitoringu vyřazeny. Současná prevalence založená výhradně na ELISA testu je 0,1 %, což by mohlo vést k závěru, že populace je prakticky ozdravena. Tento výsledek je však dán faktem, že systém monitoringu zahrnuje pouze chovy v kontrole užitkovosti, u nichž je negativita vyžadována. Tyto chovy však reprezentují pouze menší část populace ovcí a koz chovaných v ČR (asi 20 %), v ostatních chovech včetně šumavské ovce, je nákazová situace nadále neznámá. Prevalence MV a CAE zjištěná v provedené studii ve vybraných chovech naznačuje možnou nákazovou situaci v nesledované části populace. Cílem této části projektu rovněž bylo identifikovat dostatečný počet infikovaných zvířat pro epidemiologické a genetické studie pro další části projektu. Výsledky naší studie cílené především do chovů mimo KU prokazují až 56,2 % pozitivních zvířat v jednotlivém stádě, předpoklad vysoké pozitivity byl potvrzen rovněž ve stádech šumavské ovce. ELISA testy na diagnostiku SRLV infekcí lze obecně rozdělit na nepřímé a kompetitivní. Nepřímé ELISA testy jako antigen využívají celý virus, rekombinantní proteiny nebo syntetické peptidy. Kompetitivní testy jsou postaveny na monoklonálních protilátkách proti defino- 230 VETERINÁŘSTVÍ 3/2017

Tab. 5 Séroprevalence viru infekční artritidy a encefalitidy (CAEV) v chovech koz v roce 2016 Chov/ Počet Prevalence Kraj Okres farma č. vzorků pozitivní dubiózní negativní % 1 JHC ST 103 0 0 103 0 2 JHC ČK 19 0 0 19 0 3 JHC ČB 31 0 0 31 0 4 JHM BM 18 0 0 18 0 5 LBK JN 243 32 3 208 13,2 6 OLK JS 173 53 0 120 30,6 7 PAK SY 22 1 0 21 4,5 Celkem 609 86 3 520 14,1 Tab. 6 Využití testů pro konfirmaci výsledků screeningového vyšetření (2016) Test Celkem vzorků negativní dubiózní pozitivní IDEXX MVV/CAEV p28 Ab Screening 3 410 2 831 27 552 IDEXX MVV/CAEV p28 Ab Verification 371 137 16 218 IDEXX CAEV/MVV Total Ab 200 57 11 132 Elitest MVV/CAEV (Hyphen) 163 16 0 147 ID Screen MV Indirect (IDvet) 139 26 0 113 SRL Ab test Kit (VMRD) 123 34 0 89 AGID MAEDITEC (AHVLA) 117 11 20 86 Tab. 7 Srovnání testů na skupině vybraných vzorků (N=109) Test Pozitivita pozitivní negativní dubiózní (%) IDEXX MVV/CAEV p28 Ab Screening 48 53 8 44,0 IDEXX MVV/CAEV p28 Ab Verification 69 28 12 63,3 IDEXX CAEV/MVV Total Ab 69 30 10 63,3 Elitest MVV/CAEV (Hyphen) 103 6 0 94,5 ID Screen MV Indirect (IDvet) 91 18 0 83,5 SRL Ab test Kit (VMRD) 79 30 0 72,5 AGID MAEDITEC (AHVLA) 83 10 16 76,1 vaným epitopům viru. U ELISA testů s celým virem se senzitivita pohybuje mezi 92 100 % a specifita mezi 93 až 100 %. 4,6 ELISA testy postavené na rekombinantních či peptidových antigenech využívají např. rekombinantní proteiny kapsidy (CA), jako je p55, p25, p16, p14, transmembránový protein (TM) gp46 nebo purifikovaný obalový protein gp135. 7,18 Používány jsou rovněž syntetické peptidy odvozené od p25 nebo TM proteinu. 6 CA protein je považován za skupinově specifický antigen s výraznou křížovou sérologickou reaktivitou mezi izoláty viru maedi-visna, která zahrnuje rovněž izoláty viru CAE. 2 TM glykoprotein je pokládán za vysoce imunogenní komponentu viru. Experimenty s rekombinantním TM glykoproteinem prokázaly přítomnost protilátek až u 97 % infikovaných ovcí. 19 Protilátky proti kapsidovému proteinu p25 vzrůstají relativně brzo po infekci a hladina těchto protilátek začne klesat, když se objeví klinické příznaky. Protilátky proti obalovým glykoproteinům gp46 a gp135 vzrůstají později po infekci a perzistují přes klinickou fázi. 6,20 Většina současných komerčních ELISA testů tak využívá kombinaci kapsidového proteinu (např. p25, p27, nebo p28) viru maedi-visna produkovaného na Escherichia coli a peptidu získaného z imunodominantního regionu transmembránového proteinu gp46. Výsledkem je pak senzitivita pohybující se u různých testů většinou nad 90 % a vysoká specifita v rozmezí 96 100 %. Každý z testů používaných k sérologické diagnostice má své přednosti a nevýhody s ohledem na potenciální možnosti využití, kterými jsou zejména jejich různá specifita a senzitivita. Protože neexistuje žádný oficiální zlatý standard sérologických testů na diagnostiku infekcí SRLV, jsou většinou porovnávány navzájem mezi sebou a výsledné studie tak mají různou obtížně porovnatelnou kvalitu. Ve studiích na určení specifity a senzitivity by měla být využita experimentálně infikovaná zvířata s jasně definovaným infekčním statutem a podle OIE doporučený počet minimálně 300 pozitivních a 1000 negativních vzorků (OIE Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, 2000). 21 Tato kritéria nejsou v praxi reálně dosažitelná, a proto jsou využívány různým způsobem definované vzorky po přirozené infekci. Zjištěná senzitivita a specifita testů se podle přístupu v různých studiích může výrazně lišit. Významnější rozdíly bývají hlavně v senzitivitě testů, specifita bývá většinou vysoká. Ojediněle se mohou vyskytovat i falešně pozitivní výsledky, u kterých důvod reakce není možno objektivně objasnit. 7 V posledních letech se v některých evropských zemích objevily falešně pozitivní reakce způsobené nedostatečně purifikovanými vakcínami proti viru katarální horečky ovcí. 13 Porovnáním výsledků uvedených v tabulce 7, kde je uvedeno hodnocení 109 vzorků testovaných ve všech testech, je možno vyhodnotit relativní senzitivitu jednotlivých testů. Jako nejvíce citlivý test se jeví Elitest MVV/CAEV, srovnatelnou úroveň vykazuje ID Screen MV Indirect. Paradoxně za nejméně citlivý test lze považovat IDEXX MVV/CAEV p28 Ab Screening Test, kterým byla testována většina vzorků. Senzitivita testů může být významně ovlivněna vysokou variabilitou viru, kterou je nutno v sérologických testech zohlednit. Pro posouzení citlivosti sérologických testů je třeba bližší identifikace genotypů viru, které se vyskytují v daném regionu. Senzitivita ELISA testů se může lišit také podle druhu zvířete (ovce, koza) a podle stadia infekce (subklinická, klinická a chronická fáze). 6 Z těchto důvodů budou vybraná zvířata, která byla hodnocena ve finálním hodnocení jako suspektní, dále sledována a opakovaně testována na přítomnost protilátek a viru. VETERINÁŘSTVÍ 3/2017 231

Komerční ELISA testy jsou sestaveny tak, aby vykazovaly vysokou senzitivitu i specifitu. Problémem ovšem zůstává intermitentní sérologická odezva, která se projevuje časovou variabilitou humorální odezvy, a to od několika týdnů do několika měsíců po infekci. Obecně se předpokládá, že titr protilátek při sérokonverzi dosáhne maximální výše a pak klesne na nižší, ale stabilní hladinu. Některé studie ovšem uvádí, že u určitého procenta zvířat (10 20 %) dochází k tzv. intermitentní protilátkové odezvě zjištěné jak ve WB, IDT, tak ELISA testu a toto období může trvat týdny, měsíce, ale i roky. 6,22 Titry protilátek proti různým proteinům (p25, p16, p14 nebo proteinům obalu) pak mohou průběžně kolísat nebo mohou dočasně klesnout pod detekční schopnost testů a vykazovat tak negativní výsledek. Tento fenomén v praxi komplikuje diagnostiku a eradikaci infekcí SRLV. Kvůli výše popsaným omezením je sérologie vhodná zejména pro screening stád či průběžný monitoring, ale omezeně použitelná k identifikaci zdravotního statusu u jednotlivých zvířat. Závěr Zjištěná sérologická prevalence MVV u ovcí je 19,9 % (556/2801) a celková prevalence CAEV u koz je 14,1 % (86/609). Prevalence v jednotlivých chovech se pohybovala v rozmezí 0 56,2 %. Z dostupných zdrojů byla sumarizována sérologická prevalence z monitoringu nákaz v letech 1997 2015. Senzitivita testů může být významně ovlivněna vysokou genetickou variabilitou viru, druhem použitého antigenu, druhem zvířete a stadiem infekce. Pro dosažení optimálního výsledku sérologické diagnostiky je třeba provedení širší srovnávací studie dostupných testů s cílem stanovení vhodné kombinace testů pro příslušný region. Existence početné populace s neznámou nákazovou situací představuje stálé riziko zavlečení infekce do ozdravených chovů zařazených v KU. Vypracování programu zdravotní kontroly lentivirových infekcí by mělo především přispět k rozšíření možností ochrany prostých chovů jednak zavedením metod časné detekce infekce MV a CAE pro možnost realizace účinných opatření v případě zavlečení infekce, jednak zvýšením přirozené rezistence k infekci genetickou selekcí na základě markerů rezistence. Právě zvýšení genetické rezistence by mohlo být dlouhodobým řešením pro ozdravení plemene šumavská ovce, kde není možno použít radikální eliminační metody. Uplatnění programu pro ozdravování chovů mimo KU může být předmětem další diskuse. Poděkování: práce vznikla za podpory projektu NAZV QJ1610096 Literatura: 1. PALSSON, P. A. Maedi and Visna in sheep. Slow virus diseases of animals and man. Amsterdam, R. H. Kimberlin 1976:43. 2. CELER, V. Diagnostické využití strukturálních proteinů viru Maedi-Visna. Disertační práce, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, 1997. 3. PETERHANS, E., GREENLAND, T., BADIOLA, J., HARKISS, G., BERTONI, G., AMORENA, B., ELIASZEWICZ, M., JUSTE, R. A., KRASSNIG, R., LAFONT, J. P., LENIHAN, P., PÉTURSSON, G., PRITCHARD, G., THORLEY, J., VITU, C., MORNEX, J.F., PÉPIN, M. Routes of transmission and consequences of small ruminant lentiviruses (SRLVs) infection and eradication schemes. Vet Res 2004;35:257-274. 4. MINGUIJÓN, E., REINA, R., PÉREZ, M., POLLEDO, L., VILLORIA, M., RAMÍREZ, H., LEGINAGOIKOA, I., BADIOLA, J.J., GARCÍA-MARÍN, J. F., DE ANDRÉS, D., LUJÁN, L., AMORENA, B., JUSTE, R. A. Small ruminant lentivirus infections and diseases. Vet Microbiol 2015;181(1-2):75-89. 5. BLACKLAWS, B. A. Small ruminant lentiviruses: Immunopathogenesis of visna-maedi and caprine arthritis and encephalitis virus. Comp Immunol Microbiol Infect Dis 2012;35:259-269. 6. DE ANDRÉS, D., KLEIN, D., WATT, N. J., BERRIATUA, E., TORSTEINSDOTTIR, S., BLACKLAWS, B. A., HARKISS, G. D. Diagnostic test for small ruminat lentiviruses. Vet Microbiol 2005;107(1-2):49-62. 7. BRINKHOF, J., VAN MAANEN C. Evaluation of Five Enzyme-Linked Immunosorbent Assays and an Agar Gel Immunodiffusion Test for Detection of Antibodies to Small Ruminant Lentiviruses. Clin Vac Immunol 2007;14:9,1210-1214. 8. Zprávy o činnosti v oblasti ochrany zdraví zvířat. Státní veterinární správa, Odbor ochrany zdraví a pohody zvířat, Praha. 1994-2015. 9. ZANONI, R., VOGT, H. R., POHL, B., BOTTCHER, J., BOMMELI, W., PETERHANS, E. An ELISA based on whole virus for the detection of antibodies to smallruminant lentiviruses. Zentralbl Veterinarmed B 1994;41:662-669. 10. CELER, J. R., V., CELER, V., NEMCOVA, H. R., ZANONI, R., PETERHANS, E. Serologic diagnosis of ovine lentiviruses by whole virus ELISA and AGID test. Zentralbl Veterinarmed [B] 1998;45:183-188. 11. HERRMANN-HOESING, L. M., BROUGHTON-NEISWANGER, L. E., GOUINE, K. C., WHITE, S. N., MOUSEL, M. R., LEWIS, G. S., MARSHALL, K. L., KNOWLES, D. P. Evaluation of a Caprine Arthritis-Encephalitis Virus/Maedi-Visna Virus Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay in the Serological Diagnosis of Ovine Progressive Pneumonia Virus in U.S. Sheep. Clin Diagn Lab Immunol 2010;17(2):307-310. 12. SAMAN E., VAN EYNDE G., LUJAN L., EXTRAMIANA B., HARKISS G., TOLARI F., GONZALEZ L., AMORENA B., WATT N. AND BADIOLA J. A New Sensitive Serological Assay for Detection of Lentivirus Infections in Small Ruminants. Clin Diagn Lab Immunol 1999;6:734-740. 13. COMTET, L., FELIZIANI, F., LESCEU, S. Validation of the ID Screen Maedi Visna Indirect ELISA: specificity on BTV-8 vaccinated sheep and detection of seroconversion. Poster presented at the 2010 EAVLD meeting, Lelystad, Holland. 14. NOWICKA, D., CZOPOWICZ, M., MICKIEWICZ, M., SZALUŚ-JORDANOW, O., WITKOWSKI, L., BAGNICKA, E., KABA, J. Diagnostic performance of ID Screen MVV-CAEV Indirect Screening ELISA in identifying small ruminant lentiviruses infected goats. Pol J Vet Sci 2014;17(3):501-6. 15. HERRMANN, L. M., CHEEVERS, W. P., MCGUIRE, T. C., ADAMS, D. S., HUTTON, M. M., GAVIN, W. G., KNOWLES, D. P. Competitive-inhibition enzyme-linked immunosorbent assay for detection of serum antibodies to caprine arthritisencephalitis virus: Diagnostic tool for successful eradication. Clin Diagn Lab Immunol 2003;10(2):267-271. 16. HERRMANN, L. M., CHEEVERS, W. P., MARSHALL, K. L., MCGUIRE, T. C., HUTTON, M.M., LEWIS, G.S., KNOWLES, D.P. Detection of serum antibodies to ovine progressive pneumonia virus in sheep by using a caprine arthritis-encephalitis virus competitive-inhibition enzyme-linked immunosorbent assay. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2003;10(5):862-5. 17. VAREA R. et al. Early detection of maedi-visna (ovine progressive pneumonia) virus seroconversion in field sheep samples. J Vet Diagn Invest 2001;13(4):301-7. 18. CELER JR., V., ZANONI, R., PETERHANS, E. Comparison of various antigens in the diagnosis of caprine arthritis-encephalitis virus using the ELISA test. Vet Med (Praha) 1993; 38:237-244. 19. KWANG, CUTLIP, J. R. Detection of Antibodies to Ovine Lentivirus Using a Recombinant Antigen Derived From the Env Gene. Biochem Biophys Res Commun1992;183(3):1040-1046. 20. BOSHOFF, C. H., DUNGU, B., WILLIAMS, R., VORSTER, J., CONRADIE, J. D., VERWOERD, D. W., YORK, D. F. Detection of Maedi-Visna virus antibodies using a single fusion transmembrane-core p25 recombinant protein ELISA and a modified receiver-operating characteristic analysis to determine cut-off values. J Virol Methods 1997;63:47-56. 21. OIE Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines. Chapter 1.1.3: Principles of validation of diagnostic assays for infectious disease. 2000:15-23. 22. KRASSNIG, R., SCHULLER, W. Continuation of the observation and serological investigation of a maedi-visna-virus-infected sheep flock from January 1990 to June 1996. Dtsch Tieraztl Wschr 1998;105:50-53. Adresa autora: MVDr. Pavel Barták, Ph.D. Státní veterinární ústav Jihlava Rantířovská 93 586 05 Jihlava bartak@svujihlava.cz 232 VETERINÁŘSTVÍ 3/2017