ELISA-VIDITEST anti-toxo IgM capture

1023 ELISA-VIDITEST anti-toxo IgM capture OD-243 Návod k použití soupravy VÝROBCE: VIDIA spol. s r.o., Nad Safinou II č. 365, Vestec, 252 42 Jesenice, tel.: +420 261 090 565, www.vidia.cz 1. NÁZEV SOUPRAVY ELISA-VIDITEST anti-toxo IgM capture ELISA souprava pro detekci protilátek třídy IgM proti Toxoplasma gondii v lidském séru a plazmě. 2. POUŽITÍ Pro diagnostické účely je doporučeno kombinovat více testů pro odlišení akutní a dříve proběhlé infekce. Vyšetření přítomnosti specifických protilátek třídy IgG je pozitivní za 1 až 2 týdny po primární infekci. Titr protilátek dosahuje maxima po několika týdnech, potom v průběhu následujících měsíců klesá. Obyčejně zůstávají protilátky měřitelné po zbytek života. Detekce IgM třídy protilátek je důležitou známkou akutní infekce nebo vrozené toxoplazmózy. Při primární infekci se IgM protilátky objevují po několika dnech a zpravidla vymizí po 3-5 měsících, ale mohou také zůstat zvýšené několik let, proto je pro objasnění stádia infekce nutné provedení dalších testů. Přítomnost protilátek třídy IgA je známkou akutní infekce. Specifické protilátky IgA se objevují po 10-30 dnech od začátku infekce, tedy o něco později než protilátky třídy IgM, a vymizí po 3-6 měsících. 3. PRINCIP TESTU ELISA-VIDITEST anti-toxo IgM capture je imunoanalytický test na pevné fázi pracující na principu anti--capture. Na povrchu jamek mikrotitračních destiček je imobilizovaná protilátka proti lidskému IgM. Během první inkubace dojde k navázání všech typů IgM protilátek přítomných v séru pacienta na imobilizovanou protilátku. V dalším kroku je přidán antigen/peroxidázový konjugát, který se váže na zachycené Toxoplazma-specifické IgM protilátky. Množství navázaného konjugátu se stanoví barevnou enzymatickou reakcí s chromogenním substrátem. Reakce je zastavena přidáním stop roztoku. Intenzita zbarvení roztoku je závislá na množství specifických IgM protilátek ve vzorku. 4. OBSAH SOUPRAVY Odlamovací stripy po 8 jamkách, potažené protilátkou anti-hu IgM STRIPS Ab 12 ks Negativní kontrola r.t.u. 1), 1,2 ml CONTROL - Pozitivní kontrola r.t.u., 1,2 ml CONTROL + Cut-off kontrola r.t.u., 1,2 ml CUTOFF Antigen/Px konjugát 51x konc., 0,32 ml CONJ 51x Ředicí roztok pro konjugát, r.t.u., 12mL CONJ DIL Promývací roztok 25x konc., 80 ml WASH 25x Ředicí roztoku r.t.u., 100 ml DIL Chromogensubstrátový roztok TMB r.t.u., 13 ml TMB Stop roztok r.t.u., 15 ml STOP krycí fólie, rámeček sáček se zipem + vysoušedlo návod k použití soupravy, certifikát kontroly kvality 1) r.t.u., ready to use (připraveno k použití = v pracovní koncentraci) 1

5. POTŘEBNÝ MATERIÁL NEDODÁVANÝ SE SOUPRAVOU Destilovaná/deionizovaná voda, pipetovací zařízení (mikropipety a špičky k mikropipetám), stojánek na ředění vzorků, odměrný válec pro ředění promývacího roztoku, nádoby pro rozplňování roztoků a promývání stripů, papírové ubrousky, spektrofotometr/kolorimetr pro měření absorbance mikrotitrační destičky při 450 nm s referenčním filtrem 630/620 nm, stopky, inkubátor s teplotou +37 C s vysokou relativní vlhkostí. 6. PŘÍPRAVA REAGENCIÍ a. Vytemperujte všechny složky soupravy na laboratorní teplotu. b. Před použitím důkladně zamíchejte jednotlivé roztoky, kontroly a peroxidázový konjugát. c. Těsně před vyšetřením důkladně zamíchejte vzorky vyšetřovaných sér. Testovaná séra řeďte ředicím roztokem 1:100 (např. 5 L séra + 500L ředicího roztoku). d. Připravte pracovní koncentraci promývacího roztoku jeho naředěním 25x ve vhodném objemu destilované/deionizované vody (např. 40 ml promývacího roztoku + 960 ml H2O). Pokud jsou v koncentrovaném roztoku krystaly soli, zahřejte ho ve vodní lázni +32 C až +37 C a před naředěním dobře promíchejte. Nespotřebovaný promývací roztok v pracovní koncentraci lze skladovat 1 měsíc při teplotě +2 C až +8 C. e. Kontrolní séra, chromogensubstrátový roztok TMB a stop roztok neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u.). 7. PRACOVNÍ POSTUP a. Připravte si potřebný počet stripů a umístěte je do rámečku. Zatavené stripy nechte před otevřením sáčku vytemperovat na laboratorní teplotu, aby nedošlo k jejich orosení. Nepoužité stripy společně s vysoušedlem důkladně uzavřete do sáčku se zipem nebo vakuově zatavte. b. Naplňte příslušné jamky po 100 μl kontrolními séry a naředěnými testovaných sér podle schématu (viz Obr. 1 Schéma aplikace vzorků). První jamku ponechte prázdnou pro stanovení pozadí reakce (Blank). Další dvě jamky naplňte cut-off kontrolou (CUTOFF). Další jamky naplňte negativní kontrolou (CONTROL -) a pozitivní kontrolou (CONTROL +). Zbývající jamky naplňte naředěnými testovanými séry (S1 ). Každé sérum stačí aplikovat na jednu jamku (S1, S2, S3, ). Pokud chcete vyloučit případnou laboratorní chybu, aplikujte vyšetřovaná séra po dvou jamkách. Stripy přelepte krycí fólií nebo překryjte víčkem. Inkubujte 60 minut (+/- 5 min.) v inkubátoru při teplotě +37 C (+/- 1 C). Pozn.: Vzhledem k délce pipetování je doporučeno, aby se cut-off kontrola (CUTOFF) zopakovala vždy po 6 stripech (nebo po 7 minutách pipetování). Vzorky pipetované po opakované cut-off kontrole se tak mohou hodnotit s nově vypočítanou hodnotou. c. Během posledních 15 minut inkubace nařeďte antigen/px konjugát 51x (CONJ 51x) ředicím roztokem pro konjugát (CONJ DIL) (např. 0,24 ml antigen/px konjugátu + 12,0 ml ředicího roztoku pro konjugát). Pro zpracování 12 stripů (tj. 1 rámečku) je zapotřebí cca 12 ml ředěného antigen/px konjugátu.). d. Odsajte obsah jamek do sběrné láhve obsahující vhodný dezinfekční prostředek (viz BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY). Jamky poté 4 x promyjte 300 μl promývacího roztoku (roztok ponechte v jamkách asi 30 sec.). Vyvarujte se přetékání roztoku ven z jamek. Obsah jamek odsajte a destičku vyklepněte na přířez buničité vaty. e. Napipetujte do všech jamek kromě první jamky (Blank) po 100 μl naředěného antigen/px konjugátu. Inkubujte 30 minut (+/- 2 min.) v inkubátoru při teplotě +37 C (+/- 1 C). f. Kapalinu z jamek odsajte a promyjte je 4 x 300 μl promývacího roztoku (viz bod d). g. Napipetujte do všech jamek po 100 μl chromogensubstrátového roztoku (TMB). Inkubujte 30 minut při laboratorní teplotě. Dobu inkubace začněte měřit po napipetování 1. stripu 2

destičky. Dodržujte toto pravidlo, vyvarujete se tak nedodržení časového intervalu. Pipetujte rychle v pravidelném rytmu, případně použijte vhodný dispenzor. Překryjte stripy neprůhledným víčkem, nebo je po dobu reakce uložte na temné místo. h. Zastavte reakci přidáním 100 μl stop roztoku (STOP) do každé jamky. Pipetujte ve stejném rytmu jako při rozplňování chromogensubstrátového roztoku, aby enzymatická reakce probíhala ve všech jamkách po stejnou dobu. Zkontrolujte, zda nejsou v jamkách bubliny, pokud ano, jemným poklepem na rámeček destičky je odstraňte. i. Intenzitu barevné reakce změřte na spektrofotometru/kolorimetru při 450 nm nejpozději do 10 minut od zastavení reakce. Doporučujeme použít referenční filtr 630 (620) nm. Pozn.: Nenechte jamky během inkubací vyschnout. Nezaměňujte reagencie a neprovádějte inkubaci mimo rozmezí teplot. Obr. 1 Schéma aplikace vzorků: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 a blank S4 b CUTOFF S5 c CUTOFF S... d CONTROL - e CONTROL + f g h S1 S2 S3 8. HODNOCENÍ TESTU Nejdříve odečtěte absorbanci jamky pro stanovení pozadí reakce (Blank) od hodnot kontrol a testovaných sér. 8.1. Kvalitativní hodnocení 1. Spočítejte průměrnou hodnotu OD cut-off kontroly (CUTOFF) ze dvou jamek. 2. Stanovte Cut-off hodnotu. Cut-off hodnota odpovídá průměru OD cut-off kontroly. 3. Spočítejte rozmezí cut-off hodnoty +/- 10%. cut-off hodnota = OD CUTOFF séra s hodnotou OD < cut-off hodnota - 10% jsou negativní séra s hodnotou OD > cut-off hodnota + 10% jsou pozitivní Výsledek je nejistý v rozmezí: cut-off hodnota - 10% OD vzorku cut-off hodnota +10%. V případě tohoto výsledku test opakujte. Leží-li sérum po opakovaném testování opět v rozmezí šedé zóny, opakujte testování alternativní metodou nebo použijte sérum z nového odběru od téhož jedince. Doporučujeme zvážit a vyloučit nespecifické reakce resp. zkříženou reaktivitu, která také může být příčinou nejistého výsledku. 8.2. Hodnocení pomocí indexu protilátek Stanovte hodnotu indexu pozitivity pro jednotlivé vzorky sér: 1. Nejdříve stanovte cut-off hodnotu jako v předešlém způsobu hodnocení (viz čl. 8.1.). 2. Stanovte hodnotu indexu pro jednotlivé vzorky sér podle vzorce: hodnota indexu = OD vzorku / hodnota cut-off 3

3. Odečtěte v tabulce odpovídající stupeň reaktivity séra. hodnota indexu vyhodnocení < 0,9 negativní (-) 0,9 1,1 hraniční (+/-) > 1,1 pozitivní (+) Hodnocení +/- znamená, že sérum leží v rozmezí šedé zóny. V případě tohoto výsledku test opakujte. Leží-li sérum po opakovaném testování opět v rozmezí šedé zóny, opakujte testování alternativní metodou nebo použijte sérum z nového odběru od téhož jedince. Doporučujeme zvážit a vyloučit nespecifické reakce resp. zkříženou reaktivitu, která také může být příčinou nejistého výsledku. 9. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ (pozn. k tabulce: - negativní, + pozitivní) IgG IgM Interpretace výsledků Doporučená doplňující vyšetření - - Séronegativita. Sérologie nedokazuje infekci. Během těhotenství kontrolní vyšetření ve 2. a 3. trimestru. - + Časná fáze infekce. Kontrola protilátek IgG a IgM po 10-14 dnech pro určení sérokonverze. + + + - Recentní infekce, re-infekce nebo latentní infekce. Dříve prodělaná infekce. Vrozená infekce nebo reinfekce. Provedení doplňujících testů (např. IFA, ISAGA, immunoblot), stanovení specifických IgA protilátek a stanovení avidity specifických IgG protilátek. Sledování IgG a IgM protilátek (odběr vzorků za 10-14 dní) pro sledování dynamiky tvorby protilátek. Při podezření na akutní infekci - doplňující testy a sledování protilátek (viz výše). 10. CHARAKTERISTIKY TESTU 10.1. Platnost testu V každém testu je nutno aplikovat všechny kontroly/kalibrátory. Hodnota absorbance OD pro Blank (pozadí reakce) by měla být < 0,100. Průměrná hodnota OD cut-off kontroly (CUTOFF) by měla být v rozmezí uvedeném v Certifikátu kontroly kvality. Hodnota OD negativní kontroly (CONTROL -) by měla být v rozmezí uvedeném v Certifikátu kontroly kvality. Hodnota indexu pozitivní kontroly (CONTROL +) by měla být v rozmezí uvedeném v Certifikátu kontroly kvality. Pokud není předepsaných hodnot dosaženo, nejsou výsledky testu validní a test je nutné opakovat. 4

10.2. Přesnost testu Pro stanovení variability mezi jednotlivými testy (reprodukovatelnosti, interassay) a během testu (opakovatelnosti, intraassay) bylo provedeno měření vzorků s různými hodnotami OD. 10.2.1. Opakovatelnost (intraassay) příklad (n = počet paralelních jamek na téže destičce) n A CV opak. 22 0,430 0,032 7,4 % 22 1,532 0,058 3,8 % 10.2.2. Reprodukovatelnost (interassay) příklad (n = počet testů) n A min max CV repro. 10 0,389 0,029 0,300 0,479 7,5% 10 1,426 0,098 1,129 1,726 6,9% 10 2,014 0,141 1,590 2,440 7,0% 10.3. Diagnostická citlivost a specifita testu Stanovení diagnostické citlivosti a specifity bylo provedeno testováním souboru 252 vzorků sér. Ověření bylo provedeno srovnávacími metodami (ELISA/IFA). Z výsledků byla vypočtena citlivost 100%. Specifita testu je 98,1%. Pro výpočet citlivosti a specifity ELISA testu byly neurčité výsledky interpretovány jako pozitivní. Výsledky byly vyhodnoceny podle skupin vzorků. 10.4. Interakce Infekce vyvolané virem Epstein-Barrové mohou vést k polyklonální stimulaci imunitního systému a tedy k falešně pozitivním nálezům IgM protilátek proti Toxoplasmě. Lipemické, hemolytické nebo ikterické vzorky lze testovat pouze s výhradami, ačkoliv při našich testech nebyl zjištěn žádný negativní vliv. Mikrobiálně kontaminované vzorky mohou vést k nespolehlivým výsledkům testů. 11. BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY Všechny složky soupravy jsou určeny pouze pro laboratorní účely (pro diagnostiku in vitro). Testy musí provádět kvalifikovaní a proškolení pracovníci. Při práci nejezte, nepijte a nekuřte. Nepipetujte ústy, ale vhodnými pipetovacími zařízeními. Používejte ochranné rukavice a po práci si důkladně umyjte ruce. Dbejte, aby nedošlo k rozlití vzorků a k tvorbě aerosolu. Lidská séra použitá v soupravě pro přípravu kontrol byla testována na nepřítomnost HBsAg, HCV a protilátek anti-hiv-1,2. Přesto s nimi nakládejte jako s infekčním materiálem. Předměty, které s nimi přišly do styku, autoklávujte 1 hodinu při 121 C, nebo dezinfikujte minimálně 30 minut 3% roztokem chloraminu. Mikrotitrační destičky jsou potaženy inaktivovaným antigenem. Nicméně je běžné s nimi v laboratoři nakládat jako s potenciálně infekčními. Odpad vzniklý při promývání stripů dezinfikujte v odpadní nádobě pomocí vhodného dezinfekčního roztoku (např. Incidur, Incidin, chloramin,...) v koncentraci doporučené výrobcem. Tekuté odpady, obsahující Stop roztok (roztok kyseliny sírové), před likvidací neutralizujte 4% roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Se stop roztokem pracujte opatrně, aby nedošlo k potřísnění kůže nebo sliznice. Stane-li se tak, omyjte postižené místo větším množstvím tekoucí vody. Roztoky obsahující azid sodný (kontroly) likvidujte naředěním v dostatečném množství vody. Azid sodný může tvořit při dlouhodobém styku s kovy explozivní sloučeniny. 5

12. UPOZORNĚNÍ a. Pokud se při použití modifikuje testovací postup popsaný v tomto návodu k použití, musí uživatel tuto metodu validovat a je za ni zodpovědný. b. Výrobce zaručuje použitelnost soupravy jako celku. c. Nezaměňujte reagencie specifické pro danou šarži soupravy, jako mikrotitrační destičky, kontroly a antigen/px konjugát. Roztok TMB r.t.u., ředicí roztok (DIL) a ředicí roztok pro konjugát (DIL CONJ) lze zaměnit pouze v případě stejné šarže uvedené na štítku lahvičky. Promývací roztok 25x konc. a stop roztok r.t.u. lze použít u všech souprav ELISA-VIDITEST anti-toxo IgG, IgM a IgA. Tyto roztoky nejsou zaměnitelné mezi ostatními soupravami vyráběnými firmou VIDIA s.r.o. d. Pracujte asepticky, aby nedošlo k mikrobiální kontaminaci sér a reagencií, reagencie po použití pečlivě uzavírejte. Při odebírání, ředění a skladování reagencií postupujte tak, aby nedošlo k jejich vzájemné kontaminaci či kontaminaci látkami inhibujícími enzymatickou aktivitu. e. Antigen/Px konjugát a ředicí roztok pro konjugát jsou konzervovány 0,049% Thiomersalem. f. Kontroly a ředicí roztok pro séra jsou konzervovány 0,095% azidem sodným. g. Chromogensubstrátový roztok nesmí přijít do styku s oxidačními látkami a kovovými povrchy. h. Dodržujte přesně pokyny uvedené v návodu. Nereprodukovatelné výsledky mohou vzniknout zejména: * nedostatečným vytemperováním a promícháním reagencií a vzorků před použitím * nepřesným pipetováním a nedodržováním času inkubací uvedených v bodě 7. * špatnou technikou promývání a potřísněním okrajů jamek vzorky nebo konjugátem * použitím stejné špičky při pipetování různých roztoků nebo záměnou uzávěrů Chyba Bez barevné reakce po přidání substrátu Obecně velmi silná reakce Obecně velmi slabá reakce Reakce blanku velmi vysoká Falešně pozitivní / negativní vzorky Nevysvětlitelné výkyvy Vysoká variabilita (v jednom testu) Vysoká variabilita (mezi jednotlivými testy) Možné příčiny Nebyl nepipetován Px-konjugát. Došlo k inaktivaci Px-konjugátu např. jeho kontaminací kontrolním sérem během pipetování. Nesprávný Px-konjugát (není z originální soupravy). Inkubační doba příliš dlouhá. Inkubační teplota příliš vysoká. Nedostatečná kvalita vody pro ředění promývacího roztoku (nízký stupeň deionizace). Nesprávný Px-konjugát (není z originální soupravy). Inkubační doba příliš krátká. Inkubační teplota příliš nízká. Nesprávné pipetování ředicího roztoku. Kontaminované reagencie. Reagencie po expiraci. Překročení inkubační doby a teploty. Vnější znečištění dna mikrotitrační destičky (pečlivě očistěte!). Nesprávné ředění vzorků. Lipemické, hemolytické nebo ikterické vzorky. Bakteriální kontaminace vzorků. Kontaminace pipet, špiček nebo použitých nádob. Přítomnost kovů (železo, měď atd.). Nedostatečné promývání. Reagencie nebo stripy nebyly vytemperovány na laboratorní teplotu. Promývačka nepracuje správně. Inkubační podmínky nejsou konstantní (čas, teplota). Kontroly a vzorky nejsou zpracovány současně (ve stejném intervalu) - prověřte postup pipetování. Lidský faktor. Vysušení stripů během promývání. 6

13. SKLADOVÁNÍ A EXPIRACE a. Soupravu a její složky skladujte při teplotě +2 C až +8 C. Složky nezmrazujte, chraňte je před přímým slunečním zářením. Za těchto podmínek je expirační doba celé soupravy uvedena na centrálním štítku na obalu soupravy, expirace jednotlivých složek je uvedena na jejich obalu. b. Používejte pouze stripy neporušeně vakuově zatavené. Načaté nespotřebované stripy dobře uzavřete do plastikového sáčku společně s desikantem (vysoušedlem). Takto uložené stripy jsou stabilní po dobu 4 týdnů. c. Po použití pečlivě uzavřete lahvičky reagencií víčky a dále je uchovávejte při +2 C až +8 C. d. Nespotřebovaný naředěný promývací roztok je stabilní po dobu 4 týdnů, pokud je uchován při teplotě +2 C až +8 C. e. Vzorky séra nebo plazmy (heparin) odebrané standardním laboratorním způsobem jsou vhodné k vyšetření. Vzorky inaktivované působením vysokých teplot se nesmí používat. Nespotřebovaná testovaná séra uchovávejte v neředěném stavu rozplněná na alikvoty a zmrazená při teplotě -18 C až -28 C. Časté zmrazování a rozmrazování se nedoporučuje. Pokud skladujete séra při teplotě +2 C až +8 C, pak je spotřebujte do jednoho týdne. f. Vzorky naředěné v ředícím roztoku nelze skladovat a je potřeba je použít tentýž den. g. Soupravy se přepravují chlazené v termotaškách, doba přepravy do 72 hodin nemá na expiraci vliv. Jestliže po obdržení soupravy zjistíte vážné poškození obalu jakékoliv složky soupravy, ihned informujte výrobce. 7

14. TESTOVACÍ SCHÉMA Krok 1. Krok 2. Krok 3. Krok 4. Připravte reagencie a testované vzorky v pracovním ředění Aplikujte 100 L/ jamku kontrol a testovaných vzorků Inkubujte 60 minut v inkubátoru při 37 C 4x promyjte (300 L/ jamku, 30 sec. nechte roztok v jamkách), vyklepněte Aplikujte 100 L/ jamku peroxidázového konjugátu Inkubujte 30 minut v inkubátoru při 37 C 4x promyjte (300 L/ jamku, 30 sec. nechte roztok v jamkách), vyklepněte Aplikujte 100 L/ jamku chromogensubstrátového roztoku TMB Inkubujte 30 minut ve tmě při laboratorní teplotě Krok 5. Krok 6. Aplikujte 100 L/ jamku stop roztoku Změřte absorbanci při 450 nm do 10 minut Doporučená literatura: Gross, U. et al.: Immun. Insekt. 20, 151-154 (1992). Janitschke, K.: Klin. Lab. 40, 1059-1064 (1994). Datum poslední verze tohoto návodu: 05/2014 8