Chm. Listy 93, 528-532 (1999) Laboratorní přístroj a postupy LABORATORNÍ PŘÍSTROJE A POSTUPY NOVÉ POSTUPY DIAGNOSTIKY DĚDIČNÝCH PORUCH PURINOVÉHO A PYREVIIDINOVÉHO METABOLISMU POMOCÍ KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZY* DAVID FRIEDECKÝ 3, TOMÁŠ ADAM b ', JURAJ ŠEVČÍK 3 a PETR BARTÁK"' "Katdra analytické chmi Univrzita Palackého, Třída Svobody 8, 771 46 Olomouc, Laboratoř dědičných mtabolických poruch, Ustav klinické biochmi, Fakultní nmocnic, I. P. Pavlova 6, 775 2 Olomouc, c Cntrum analytické chmi molkulárních struktur, Univrzita Palackého, Třída Svobody 8, 771 46, Olomouc Došlo dn 17.11.1999 Klíčová slova: kapilární lktroforéza, mtabolismus, puriny, pyrimidiny Uvod Mtabolismu purinů a pyrimidinů s účastní asi 5 známých nzymů. Dosud j známo 2 nzymových dfktů a jjich klinické souvislosti'. Důsldkm poruchy nzymu j akumulac látk (substrátů, vdljších produktů) v krvi, odkud jsou fktivně liminovány ldvinami. Analýza purinů a pyrimidinů v moči j tdy základm scrningu těchto onmocnění. Pro správnou diagnostiku j nzbytné, aby mtody byly dostatčně robustní, jdnoduché, rychlé při idntifikaci purinů a pyrimidinů, finančně dostupné a schopné dtgovat všchny známé poruchy. Z analytického hldiska by mělo být dosažno optimální rozlišní všch purinů a pyrimidinů od hlavních konstituntů moči. V současné době s používá tnkovrstvná chromatografi 1 a vysoc účinná kapalinová chromatografi 2. Exprimntálně byla tstována také izotachoforéza 3. I výš uvdné rutinní mtody s však potýkají s časovou náročností, vysokými provozními náklady a problmatickou idntifikací. Použití kapilární lktroforézy přináší nové možnosti v idntifikaci purinových a pyrimidinových látk 4 ' 6. V práci jsou popsány dva přístupy, tzv. aniontový a kationtový mód pro srning dfktů purinového a pyrimidinového mtabolismu. Mtody byly tstovány na zdravých jdincích i na pacintch s vroznými mtabolickými poruchami. Exprimntální podmínky Chmikáli: kyslina boritá, kyslina fosforčná, hydroxid sodný, mthl, actonitril a y-cyklodxtrin (Mrck, Darmstadt, Němcko), báz, nuklosidy, dodcylsulfát sodný (SDS), kyslina 3-(cyklohxylamino)-l-propansulfonová (CAPS), a-cyklodxtrin, P-cyklodxtrin, hptakis-(2,6-di-o-mthyl)- -P-cyklodxtrin (Sigma, St. Louis, USA), sulfatovaný P-cyklodxtrin (Aldrich, Stinhim, Němcko), vš analytické čistoty. Pro přípravu všch roztoků byla použita dionizovaná voda(18mq.cm"'). Kapilární lktroforéza: Exprimnty byly prováděny na přístroji P/ACE 551 s dtktorm s diodovým polm (Bckman Instrumnts, Fullrton, USA). Látky byly sparovány v npokryté křmnné kapilář o vnitřním průměru 75 \\m a vnějším průměru 375 \xm (Polymicro Tchnologis, Phonix, USA). Kapilára měřila 47 cm a jjí fktivní délka byla 4 cm. Pro snadnou idntifikaci byla dtkc prováděna v UV oblasti v rozmzí 19-3 nm.vzorky byly dávkovány hydrodynamicky (tlak 4,2 kpa, čas 1-15 s). Analýzy byly prováděny při konstantním napětí (15-3 kv) s náběhovou rampou,5 min. Každý dn přd započtím xprimntů byla kapilára promyta vodou,,1 mol.1"' NaOH, poté opět vodou a základním lktrolytm, vždy 5 minut. Mzi xprimnty byla kapilára promývána,5 min,1 mol.1"' NaOH a 1 min základním lktrolytm. Přd analýzou byly vzorky 15 minut sonifikovány v ultrazvukové lázni a odstřděny 5 minut při 3 g. Vysoc účinná kapalinová chromatografi: Exprimnty byly prováděny na přístroji Milipor-Watrs s UV dtktorm snímajícím současně dvě vlnové délky (25 a 28 nm). Pro sparac byla použita analytická kolona Hichrom sphrisorb 5 im ODS-2 o délc 12,5 cm a vnitřním průměru 4,6 mm. Výsldky a diskus Chmickou povahou jsou všchny puriny slabými kyslinami. Imidazolový proton (v pozici 9) j dprotonizován s pk d okolo 1. Analogickou disociaci lz vypozorovat v případě pyrimidinů. Většina diagnosticky významných látk můž být také za vlmi nízkých ph protonizována. Pro analýzu purinů a pyrimidinů lz tdy aplikovat dvojí přístup: alkalické prostřdí (aniontový mód) a kyslé prostřdí (kationtový mód). Aniontový mód Pro alkalickou oblast ph byla postupně na standardní směsi a směsi močí optimalizována řada paramtrů (tab. I). Cílm bylo dosažní úplné sparac diagnosticky významných mtabolitů a majoritních složk moči a maximální sparační kapacity pro rálné vzorky moč (co njvětší počt sparovaných píku). Z této optimalizac byl jako njvhodnější vybrán systém:,15 mol.1" 1 ttraboritan sodný +,8 mol.1" 1 SDS, ph při napětí 15 kv (obr. la). Za těchto podmínk bylo dosažno sparac víc nž 6 složk moči. Sparační účinnost s pro sldované analyty pohybuj okolo 23 tortických patr. Rprodukovatlnost migračních časů okolo 1 % poskytuj dobré přdpoklady pro idntifikaci jdnotlivých analytů. Mimo obcně známých sparačních principů s v boráto- Tato prác získala 1. cnu v soutěži odborných prací studntů analytické chmi 2. listopadu 1998 na VŠCHT v Praz 528
Chm. Listy 93, 528-532 (1999) Laboratorní přístroj a postupy Tabulka I Optimalizac aniontového módu Složní pufru d ph Aditiva Sparac b analytů moč c Sp. účinnost (TP), pro HX Rprod. b t m Fosforčnan, boritan CAPS 7-9, SDS, CD... _,8 M-SDS,8 M-SDS +,1 M-CD(a,(3,y),8 M-SDS + 1 % MOH, AcCN - n n n n 65 66 29 23 G 1,% 2,% 'Spolčný kationt - Na +, = ntstováno, c počt spar. píku (19 nm) v směsi močí 6-ti zdravých dětí A, mau Obr. 1. Sparac standardní směsi purinů a pyrimidinů, a) aniontový mód, podmínky:,15 mol.l" ttraboritan sodný +,8 mol.l" SDS, ph, 15 kv, b) kationtový mód, podmínky:,2 mol.l" 1 fosforčnan sodný, ph 1,8, 18,5 kv vém pufru uplatňuj také komplxac analytů obsahujících cis-diolové sskupní, což umožňuj oddělní ribonuklosidů od doxyribonuklosidů nbo samotných bází. Použití SDS zvyšuj počt sparovaných píku v moči (nnabité analyty v moči s sparují na základě agrgac do micl), avšak npodílí s na mchanismch sparac purinů a pyrimidinů. účinnost byla okolo 1 tortických patr. Přídavk organických aditiv nzpůsoboval významné změny sparační účinnosti a slktivity. Při tomto ph byla sparována většina látk, kromě analytů s nízkou (gusin, xanthin, močovina) nbo aniontovou mobilitou (kyslina orotová). Kyslinu orotovou lz vzhldm k absnci lktroosmotického toku úspěšně sparovat při obrácné polaritě. Kationtový mód Analýza rálných vzorků Druhou možností analýzy purinů a pyrimidinů jsou sparac v kyslém prostřdí. Byla provdna optimalizac ph fosfátového pufru a přídavku aditiv (tab. II). Jako optimální systém byl zvoln,2 mol.l"' fosforčnan sodný při xtrémně nízkém ph 1,8 a napětí 18,5 kv (obr. lb). Sparační Na obrázcích jsou uvdny sparac močí zdravých jdinců (obr. 2) a pacintů s dfkty orotidinkarboxylasy - OTC (obr. 3) a purinnuklosidfosforylasy - PNP (obr. 4). Vdl sb jsou vždy srovnány sparac v aniontovém a kationtovém módu. Z lktrofrogramů lz jdnoznačně podl migračních 529
Chm. Listy 93, 528-532 (1999) Laboratorní přístroj a postupy Obr. 2. Sparac směsi močí zdravých dětí, a) aniontový mód, podmínky:,15 mol.i" ttraboritan sodný +,8 mol.l b) kationtový mód, podmínky:,2 mol.l fosforčnan sodný, ph 1,8, 18,5 kv SDS, ph, 15 kv, Obr. 3. Sparac vzorku pacinta s dficitm OTC a) aniontový mód, podmínky:,15 mol.l" 1 ttraboritan sodný +,8 moll" 1 SDS, ph, 15 kv, b) kationtový mód, podmínky:,2 mol.l" 1 fosforčnan sodný, ph 1,8, 18,5 kv 53
Chm. Listy 93, 528-532 (1999) Laboratorní přístroj a postupy Obr. 4. Sparac vzorku pacinta s dficitm PNP a) aniontový mód, podmínky:,15 mol.l" ttraboritan sodný +,8 mol.l" SDS, ph, 15 kv, b) kationtový mód, podmínky:,2 mol.l fosforčnan sodný, ph 1,8, 18,5 kv Obr. 5. Sparac vzorku pacinta s dficitm APRT a), b) c) kationtový mód, podmínky:,2 mou" 1 fosforčnan sodný, ph 1,8, 18,5kV - 19,26 a3 nm, d) aniontový mód, podmínky:,15 mol.l ttraboritan sodný +,8 mol.l" 1 SDS, ph,15kv, ) HPLC analýza, podmínky: mobilní fáz - pufr ttrabutylamonium (,5 mol.l" 1 ) + octan (,4 mol.l' 1 ), ph 2,75, průtok 1 mimin" 1, dtkc při 25 nm 531
Chm. Listy 93, 528-532 (1999) Laboratorní přístroj a postupy Tabulka II Optimalizac kationtového módu Slož. pufru P H Aditiva Sparac analytů Sp. účinnost a (TP) Poznámka Fosforčnan Fosforčnan Fosforčnan Fosforčnan 1,6 1,8 1,8 >2 MOH, AcCN n 18 G vysoký proud nvýznamné změny ndost, ionizac (GR...) a = ntstováno časů idntifikovat akumulované mtabolity (OTC - kyslina orotová, PNP - inosin, doxyinosin, gusin, doxygusin). Při idntifikaci byla navíc použita databáz UV spktr vytvořných z měřní standardů. Dál j uvdno srovnání CE s dns používu tchnikou HPLC (obr. 5). Jdná s o tntýž vzork pacinta s vadou adninfosforibosyltransfrasy - APRT. Z analýz vyplývá, ž HPCE j asi 3x účinnější, 3x rychljší a podstatně slktivnější. Finanční náklady na provdní jdné analýzy jsou u HPCE také výrazně nižší. Závěr Kombinací obou módů lz dosáhnout spolhlivého urční přítomnosti mtabolitů v vzorcích močí, což j nzbytné pro diagnostiku dědičných mtabolických poruch. Aniontový mód umožňuj sparaci všch významných konstituntů moči včtně purinů a pyrimidinů. Idntifikac však můž být někdy ztížna širokým spktrm sparovaných látk (běžně j v jdnom vzorku sparováno 5 UV - absorptivních látk). V kationtovém módu nmigrují něktré diagnosticky významné mtabolity (X, HR, UA). Mtoda však umožňuj diagnostikovat většinu poruch purinového a pyrimidinového mtabolismu. Jjí přdností j, ž dochází k podstatně mnším intrfrncím, což zjdnodušuj intrprtaci analýz. V současnosti jsou tyto systémy využívány v diagnostické praxi Laboratoř dědičných mtabolických poruch FN Olo- PNP SDS UA ura X purinnuklosidfosforylasa dodcylsulfát sodný kyslina močová močovina xanthin Tato prác byla podpořna granty IGA MZ ČR 3439-3 a MŠMT ČR VŠ 9621. Autoři děkují Dr. L. D. Fairbanks (Purin Rsarch Laboratory, London) za poskytnutí vzorků a provdní srovnávacích HPLC měřní. LITERATURA 1. Van Gnnip A. H., Van Noordburg-Huistra D. Y., D BrP. K., Wadman S. K.: Clin. Chim. Acta<S<5,7 (1978). 2. Simmonds H. A., Duly J. A., Davis P. M.: Tchniqus in Diagnostic Human Biochmical Gntics: A Laboratory Manuál. Homms F. A., Nw York 1991. 3. Bruchlt G., Nithammr D., Schmidt K. H.: J. Chromatogr. 618, 57 (1993). 4. Bory C, Chantin C, Bouliu R.: J. Chromatogr. A 73, 329 (1996). 5. Švčík J., Adam T., Mazáčová H.: Clin. Chim. Acta 245, 85 (1996). 6. Švčík J., Adam T., Sázl V.: Clin. Chim. Acta 259, 73 (1997). Sznam zkratk A adnin AR adnosin APRT adninfosforibosyltransfrasa CAPS kyslina 3-(cyklohxylamino)-l-propansulfonová crat kratinin dar doxy adnosin dgr doxygusin DHA 2,8-dihydroxy adnin dhr doxyinosin GR hipp HR HX OA OTC gusin kyslina hippurová inosin hypoxanthin kyslina orotová orotidinkarbosylasa D. Fridcký 3, T. Adam bc, J. Švčík ac, and P. Barták ac ("Dpartmnt of Analytical Chmistry, Palacký Univrsity, Olomouc, b Laboratory of Hrditary Mtabolic Disordrs, Institut ofclinical Biochmistry, Faculty Hospital, Olomouc, c Cntr of Analytical Chmistry of Molcular Structurs, Palacký Univrsity, Olomouc): Nw Tchniqus in Diagnostics by Capillary Elctrophorsis of Hrditary Disordrs of Purin and Pyrimidin Mtabolism Purin and pyrimidin compounds wr analyzd by capillary lctrophorsis in urin of patints with inhritd disordrs purin and pyrimidin mtabolism. Two sparation of systms (alkalin-anionic and acid-cationic mod) háv bn compard. Th us of a strongly acidic background lctrolyt (ph 1.8) improvs th slctivity and informativ pithinss of th mthod. A combination of both anionic and cationic mods incrass th rliability of diagnosis in hrditary disordrs. 532