Rutinní imunologická vyšetření neplodných párů Marcela Drahošová Ústav klinické imunologie a alergologie LF UK a FN Hradec Králové
reprodukční imunologie dnes patří mezi lékařské disciplíny, které se podílejí na výzkumu, diagnostice a léčbě neplodných párů imunitní systém se na reprodukčních neúspěších podílí až z dvaceti procent
abnormálně regulované fce IS zasahují do reprodukčního procesu na mnoha úrovních negativně ovlivňují: fci endokrinních žláz přímo poškozují zárodečné tkáně negativně působí na kvalitu pohl. buněk negativně působí na vlastní proces fertilizace, nidace, vývoj embrya a placenty mohou mít za následek ztrátu plodu
je známo několik desítek poruch imunity, které mohou vyústit ve sterilitu případně infertilitu mužský faktor se na neplodnosti párů podílí minimálně stejným dílem případy, u nichž se možné příčiny neplodnosti kombinují případy, kdy původ potíží s koncepcí není možné současnými diagnostickými prostředky odhalit
laboratorní imunologická vyšetření, spolu se stanovením kvality ejakulátu včetně akrozomu spermií, tvoří mozaiku pomocí níž lze mnohé imunopatologie odhalit podíl imunologické příčiny na snížení plodnosti (neplodnosti), však nemůžeme sledovat odděleně, ale vždy komplexně s ohledem na ostatní funkce neuroendokrinního aparátu (Ulčová-Gallová, 1999)
parametry vyšetřované v reprodukční imunologii protilátky proti spermiím ASA (antisperm antibodies) protilátky proti zoně pellucidě anti ovariální protilátky protilátky proti membránovým fosfolipidům buněčná imunita proti spermiím buněčná imunita proti trofoblastu (spermiogram) stanovení kvality ejakulátu antitg, antitpo, celiakie (event.další parametry)
preanalytická fáze ejakulát Odběr do sterilní nádoby bez aditiv. Před vyšetřením je nutná konstantní doba bez ejakulace (dle WHO manuálu 48 hodin až 7 dnů). Pokud pacient není schopen, je možný odběr v domácím prostředí. Transport nesmí trvat déle jak 60 minut, musí proběhnout ve tmě a teplotě blízké teplotě těla. sérum Odběr do standartní zkumavky bez protisrážlivých prostředků nebo s použitím separačních gelů a akcelerátorů.
preanalytická fáze krev na fenotypizaci lymfocytů a krev na funkční vyšetření lymfocytů odběr do zkumavek s protisrážlivým prostředkem (heparin sodný nebo lithný, EDTA). seminální plasma nativní ejakulát získaný výše uvedeným postupem se centrifuguje rychlostí 3600 rpm po dobu 6 minut, poté se odsaje supernatant horní vrstva seminální plasmy.
MUŽ spermiogram dle WHO základ protilátky proti spermiím ASA shlukující spermaglutinační znemožňující pohyb spermií spermimobilizační poškozující spermie - spermcytotoxické, namířené především na enzymatický aparát části hlavičky spermií
MUŽ ASA a jejich laboratorní vyšetření: stanovení ASA v ejakulátu přímým MAR testem (mixed antiglobulin reaction) charakteristika: test slouží k přímému průkazu autoprotilátek navázaných na spermie v pacientově ejakulátu protilátky se stanovují ve třídě IgG a IgA hodnoty: do 10% negativní 10% - 39% suspektní více jak 39% pozitivní
MUŽ stanovení ASA v seminální tekutině nepřímým MAR testem (mixed antiglobulin reaction) charakteristika: mohou být přítomny i u normospermika protilátky se stanovují ve třídě IgG a IgA hodnoty: do 10% negativní 10% - 39% suspektní více jak 39% pozitivní
MUŽ MAR test
MUŽ stanovení ASA v séru aglutinací (Tray Aglutinační Test TAT) princip metody: aglutinace spermií protilátkami v séru materiál: venózní srážlivá krev nebo sérum obou partnerů a současně čerstvý ejakulát v případě pozitivity se uvádí procento aglutinovaných spermií z celkového počtu stanovení ASA v séru nepřímým MAR testem
MUŽ aglutinace spermií
MUŽ stanovení ASA v séru testem ELISA výsledek aglutinační reakce nemusí korelovat s výsledky ELISA princip metody: enzymová imunoanalýza (ELISA) materiál: venózní srážlivá krev nebo sérum obou partnerů diskrepance výsledků v závislosti na výrobci kitu
MUŽ buněčná imunita proti spermiím funkční aktivita NK - cytometrie (kultivace buněk periferní krve s antigeny spermií, exprese aktivačních molekul) test inhibice migrace pod agarózou v testu stanovujeme poměr plochy migrační zóny leukocytů kultivovaných v přítomnosti antigenů spermií a migrační zóny leukocytů kultivovaných bez těchto antigenů výsledek vyjadřujeme v procentech normální hodnoty jsou 65 120%
MUŽ funkční aktivita NK buněk cytometrie, stimulace vlastními spermiemi, pozitivní kontrola PWM negat.ko pozit.ko spermie pozitivní Spermatest
MUŽ inhibice migrace - spermie
MUŽ kvalita ejakulátu - SpermFlow Test tento test umožňuje vyšetřit v ejakulátu metodou průtokové cytometrie následující parametry: počet spermií počet leukocytů vitalita spermií integrita akrozomu spermií přítomnost intra-akrozomálního proteinu ve spermiích charakteristika: při využití průtokové cytometrie dochází k měření velkého počtu spermií a také k detekci buněk na základě specifického značení pomocí monoklonálních protilátek
MUŽ počet spermií a počet leukocytů měření je založeno na přidání vnitřního standardu (fluorescenčních kuliček o známém počtu) ke vzorku ejakulátu detekce leukocytů ve vzorku je prováděna pomocí protilátky anti-cd45/pe-dy647 vitalita spermií měříme pomocí propidium jodidu, který proniká narušenou membránou mrtvých buňek a váže se na DNA
MUŽ integrita akrozomu Detekujeme intraakrozomální protein (IAP), který je přítomen v akrozomu. Pokud akrozom spermie není narušen, není tento protein možno detekovat. U spermií s narušenou membránou je tento protein dostupný pro protilátku proti IAP a je detekován. (Hs-8, Hs-14), cytometrie, mikroskopie přítomnost intra-akrozomálního proteinu: Po narušení nebo permeabilizaci membrány spermií se IAP stává stává dostupný pro protilátku proti IAP a je detekován. V případě že spermie IAP neobsahují, není po permeabilizaci spermií protilátkou proti IAP detekován. (Hs-8, Hs-18) cytometrie, mikroskopie
MUŽ SpermFlow Kit (Exbio) integrita akrozomu exprese intraakrozomálního proteinu Hs-14 (Exbio) na: neperm.spermie perm.spermie normální nález
MUŽ SpermFlow Kit (Exbio) integrita akrozomu exprese intraakrozomálního proteinu Hs-14 (Exbio) na: neperm.spermie perm.spermie patologický nález
MUŽ akrozom spermií Metoda využívá lektin hrachu konjugovaný s fluoresceinem, který se vyznačuje afinitou k vnitřní membráně akrozomu nebo monoklonálních protilátek, které se váží na intraakrozomální proteiny. princip metody: přímá imunofluorescence (mikroskop) materiál: čerstvý ejakulát hodnocení: výsledky udáváme v procentech spermií s normálním výskytem akrosinu v hlavičce z celkového počtu normální hodnoty jsou v rozmezí 50 100%
MUŽ světélkující akrozom spermií
MUŽ další možnosti mitochondrialní potenciál (motilita) (rhodamin) struktura (integrita) chromatinu (akridin. oranž) ubikvitin Ca 2+ intracelularní koncentrace (motilita, viabilita, kapacitace) Ab anti spermie
MUŽ souhrn spermiogram kvalita ejakulátu protilátky proti spermiím v ejakulátu (v seminální tekutině, navázané na spermie) protilátky proti spermiím v séru funkční aktivita NK buněk, MIF screening syst. imunopatol. onemocnění (ANF, ATTG, anti-endomysium) dle potřeby provést další vyšetření
ŽENA protilátky proti zoně pellucidě stanovení antizonálních protilátek hemaglutinačně hodnocení: pozitivní/negativní, po dohodě lze uvést titr pozitivní hemaglutinační stanovení antizonálních protilátek
ŽENA protilátky proti membránovým fosfolipidům kardiolipin, autoprotilátky IgG, IgM hodnocení: výsledky uvádíme ve specifických jednotkách GPL U/ml pro třídu IgG a MPL U/ml pro třídu IgM
ŽENA beta 2 glykoprotein I, autoprotilátky IgG,IgM princip metody: ELISA materiál: venózní srážlivá krev nebo sérum hodnocení: výsledky uvádíme v U/ml
ŽENA princip metody: ELISA fosfatidyletolamin fosfatidylinositol fosfatidylserin kyselina fosfatidová materiál: venózní srážlivá krev nebo sérum hodnocení: výsledky uvádíme v U/ml
ŽENA protilátky proti kofaktorům β2-glykoprotein-1 protrombin annexin V protein C, S fosfolipáza A kininogen trombomodulin
ŽENA sensitivita IgG anti protrombinových protilátek sekundární APS primární APS ztráta plodu 74% 78% časná ztráta plodu (1.trimestr) 80% 84%
ŽENA annexin V: protilátky proti annexinu V 36kD, protein vázající fosfolipid lokalizován na placentátrních klcích jeho množství na klcích redukováno u APS pacientek annexin-protektivní působení, kryje fosfolipidovou membránu, zábrana koagulace Ab narušují shluky annexinu, protrombotický stav, porucha reprodukce
ŽENA další možnost: protilátky proti lamininu I mohou ovlivnit implantaci embrya organogenezi vaskularizaci placenty transport živin signifikantní asociace s endometriózou u infertilních žen u 30% žen s rekurentními potraty
ŽENA buněčná imunita proti trofoblastu a spermiím funkční aktivita NK stimulace spermiemi partnera, antigeny trofoblastu (cytometrie) (kultivace buněk periferní krve, exprese aktivačních molekul (CD69) test inhibice migrace pod agarózou hodnocení: v testu stanovujeme poměr plochy migrační zóny leukocytů kultivovaných v přítomnosti antigenů trofoblastu a migrační zóny leukocytů kultivovaných bez těchto antigenů výsledek vyjadřujeme v procentech normální hodnoty jsou 75 120%
ŽENA inhibice migrace spermie, trofoblast
ŽENA funkční aktivita NK buněk negat.ko pozit.ko trofoblast
ŽENA jiné imunopatologie související s neplodností závěrem výčtu testovaných imunopatologií je nutné uvést fakt, že existuje celá řada dalších imunopatologických pochodů a markerů, které mohou souviset s neplodností. (endomysium, TTG, ATG, ATPO, ANF)
ŽENA primární sterilita: souhrn protilátky proti zona pellucida protilátky proti spermiím v séru ATG, ATPO, ATTG, endomysium, DM protilátky proti spermiím v cervik. hlenu funkční aktivita NK (spermie, trofoblast) buněk ACLA, beta 2 GP1, (lépe panel APLA) ANF protilátky proti ovariím deficit Ig
ŽENA souhrn opakované ztráty plodu: ACLA, (lépe APLA profil ) anti β2 glykoprotein anti protrombin anti annexin V funkční aktivita NK (spermie, trofoblast) ATG, ATPO, ATTG, endomysium ANF, ev. další
retrospektivní vyhodnocení výsledků neplodných párů vyšetřovaných v naší laboratoři v rámci reprodukční imunologie celkem 165 partnerských dvojic (t.j.330 pacientů) s poruchami plodnosti (zejména sterilitou, opakovanými potraty a opakovaným selháním IVF).
laboratorní imunologická vyšetření, kterým se pacienti v naší laboratoři podrobili: humorální imunita: 1. stanovení protilátek proti spermiím u muže v krvi a seminální plasmě 2. stanovení protilátek proti spermiím v séru ženy 3. stanovení protilátek proti zona pellucida v séru 4. stanovení antifosfolipidových protilátek u infertilních pacientek v séru
laboratorní imunologická vyšetření, kterým se pacienti v naší laboratoři podrobili: buněčná imunita: 1. stanovení buněčné imunity proti spermiím u muže 2. stanovení buněčné imunity proti spermiím u ženy 3. stanovení buněčné imunity proti trofoblastu u ženy jiné: 1. stanovení kvality akrozomu spermií 2. případně zachycení jiných imunopatogenit
závěr: Výsledky zaznamenané v naší laboratoři poukazují na stoupající prevalenci imunopatologií u neplodných párů. Obzvláště je pak tento nárust zaznamenán u mužů.
při detailnějším pohledu na všechny pozitivní případy v korelaci s párovou příslušností, mírně převládá pozitivní nález imunopatologií u mužů tato skutečnost zřejmě souvisí s celkovým zhoršením reprodukčního zdraví v mužské populaci zatímco až do devadesátých let minulého století byla příčina neplodnosti páru nalézána častěji na straně ženy a to asi v 50%, u mužů v 40% a u obou partnerů současně v 10% v současnosti je poměr vyrovnán, spíše je již patrné, že se tento poměr posouvá v neprospěch mužů
z rozboru jednotlivých markerů vyplynulo, že u žen se na imunopatologických dějích souvisejících s neplodností nejčastěji uplatňuje porucha v oblasti humorální i buněčné imunitě současně posoudíme-li tyto ukazatele u mužů, docházíme k závěru, že zde výrazně převládají imunopatologie v buněčné složce imunity
v souvislosti s kvalitou spermiogramu uvádíme, že při vyšetření imunopatologických markerů je také v našich laboratořích při manipulaci s pacientovým spermatem sledována vizkozita ejakulátu poměrně často je zachycena zvýšená viskosita ejakulátu, což samo osobě může negativně ovlivňovat fyziologický proces koncepce a pacientům je tato skutečnost sdělována spolu s ostatními nálezy
u skupiny pacientek, kterým byla diagnostikována infertilita, byl imunopatologický nález pozitivní více jak v polovině případů téměř ve 13 % byla u žen s pozitivním imunopatologickým nálezem zachycena i jiná imunopatologie a to konkrétně námi sledované protilátky proti štítné žláze, což je ve shodě s dosavadními empirickými zjištěními o výskytu sdružených imunopatologických procesů. (Shoenfeld et al. 2006)
ze získaných dat dále vyplývá, do jaké míry se může uplatnit hraniční imunopatologický nález u partnera nebo partnerky pravděpodobně zde dochází k manifestaci subfertility, která by v případě absolutní kompenzace druhým partnerem nemusela vést k neplodnosti, a daný pár by nepodstoupil imunologické vyšetření
zdá se tedy, že prevalence imunopatologií v reprodukční oblasti by se v rámci celé populace mohla vyskytovat mnohem více, než jak se dosud předpokládá (viz úvod) a než také odhaluje naše práce
31 pacientek z našeho souboru podstoupilo imunologické vyšetření až po provedení několika nezdařilých invazivních metod asistované reprodukce přičemž u 11 z nich byla diagnostikována imunopatologická porucha, která by mohla vysvětlovat příčinu neplodnosti u čtyř z nich byl nález hraniční z těchto 11 pacientek již podstoupili tři a v jednom případě dokonce 4 nezdařilé IVF programy, u zbylých bylo provedeno několik nezdařilých pokusů in utero inseminace než byly odeslány na imunologické vyšetření
pokud by metodiky v reprodukční imunologii, byly prioritně zařazeny do diagnostického a léčebného harmonogramu, mohly by několikanásobně zvýšit pravděpodobnost úspěšnosti přirozeného početí či případně následně použitých invazivních metodik asistované reprodukce