ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE FAKULTA BIOMEDICÍNSKÉHO INŽENÝRSTVÍ

ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE FAKULTA BIOMEDICÍNSKÉHO INŽENÝRSTVÍ Katedra biomedicínské techniky TÝMOVÝ PROJEKT

2012 Jitka Pelikánová ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE FAKULTA BIOMEDICÍNSKÉHO INŽENÝRSTVÍ Katedra biomedicínské techniky Stanovení biogenních aminů pro fluorescenční senzory: Příprava citlivé vrstvy s rutheniovým komplexem a enzymem. Týmový projekt Vedoucí projektu: Ing. Marie Pospíšilová, CSc. Studentka: Jitka Pelikánová leden 2012

Anotace Název práce: Autor: Konzultant práce: Abstrakt: Stanovení biogenních aminů pro fluorescenční senzory: Příprava citlivé vrstvy s rutheniovým komplexem a enzymem Jitka Pelikánová Ing. Marie Pospíšilová, CSc. Cílem projektu bylo připravit citlivé vrstvy s rutheinovým komplexem a enzymem pro měření fluorescenčími senzory. Pomocí biogenních aminů je snaha jejich využití v humánní medicíně, proto je třeba dobře znát jejich vlastnosti. Práce se zkládá z teoretických kapitol, týkajících se luminiscence, biosenzorů, biogenních aminů a experimentální části s popisem přípravy citlivé vrstvy čočky. Klíčová slova: Biogenní aminy, polyaminy, fluorescenční senzory, biosenzory, luminiscence

Title: Author: Supervisor: Abstract: Key words: Determination of biogenic amine for fluorescence sensors: Preparation of sensing layer with Ru-complex and enzyme Jitka Pelikánová Ing. Marie Pospíšilová, CSc. The main tasks of thesis was to prepare the sensitive layer with Ru-komplex and enzyme for measuring fluorescence sensors. Use of biogenic amines is the effort to their use in human medicine, therefor it s necessary to have a good knowledge their properties. The project is composed of theoretical chapters of luminiscence, biosensors, biogenic amines and experimental section with a description preparation of sensitive layers of the lents. Biogenic amines, polyamines, fluorescence sensors, biosensors, luminiscence

Poděkování: Chtěla bych poděkovat Ing. Marii Pospíšilové CSc. za vysvětlení témata a objasnění všech nejasností. Dále bych chtěla poděkovat Ing. Gabriele Kuncové CSc. za pomoc v laboratoři ÚChP AV ČR, užitečné rady a doplňující informace při měření. Tato práce by nevznikla bez spolupráce Heleny Paďourkové a Terezy Juráskové při měření v laboratoři ÚChP AV ČR.

Prohlášení: Prohlašuji, že jsem týmový projekt s názvem Stanovení biogenních aminů pro fluorescenční senzory: Příprava citlivé vrstvy s rutheniovým komplexem a enzymem, vypracovala samostatně a použila k tomu úplný výčet citací použitých pramenů, které uvádím v seznamu přiloženém k práci. Nemám závažný důvod proti užití tohoto školního díla ve smyslu 60 Zákona č.121/2000 Sb., o právu autorském, o právech souvisejících s právem autorským a o změně některých zákonů (autorský zákon). V Praze dne 3.1.2012. Podpis

Obsah Úvod... 10 Teoretická část...15 Luminiscence... 11 Fluorescence... 11 Fosforescence... 12 Chemiluminiscence... 12 Biosenzory... 12 Optické vláknové biosenzory... 12 Enzymatické převodníky... 12 Biogenní aminy... 13 Tyramin... 13 Histamin... 14 Putrescin... 14 Kadaverin... 15 Bakterie podílející se na produktivitě biogenních aminů... 15 Potenciální zdravotní problémy... 15 Polyaminy... 16 Experimentální část... 17 Použité chemikálie... 17 Použité pomůcky... 17 Použité přístroje... 17 Příprava citlivé vrstvy čočky... 18 Příprava citlivé vrstvy... 18 Závěr... 20

Seznam obrázků Obr. 1: Jablonskeho diagram.[13]... 11 Obr. 2: Strukturní vzorec Tyramin (C 8 H 11 NO) [10]... 13 Obr. 3:Strukturní vzorec Histaminu (C 5 H 9 N 3 ). [7]... 14 Obr. 4:Strukturní vzorec Putrescinu (C 4 H 12 N 2 )... 14 Obr. 5: Strukturní vzorec Kadaverinu (C 5 H 14 N 2 ). [9]... 15 Obr. 6: Čočka bez citlivé vrstvy... 21 Obr. 7: Čočka s citlivou vrstvou... 18 Obr. 8:Struktura citlivé vrstvy senzoru... 19 Obr. 9:UV lampa pro vytvrzování... 19

Úvod Fluorescenční senzor využívající jako převodníku enzym s Rutheiniovým komplexem (3) patří do skupiny biosenzorů.(13) Stanovení biogeních aminů je v současné době využíváno především v potravinářském průmyslu. Snahou je jejich využití v humánní medicíně, proto je důležité znát jejich vlasnosti. Byl izololován nový enzym diaminooxidáza, který se ukazuje být vhodným převodníkem pro biosenzory, využívající princip zhášení fluorescence (14). Mým úkolem bylo připravit aktivní vrstvu na bázi ORMOCERu do které byl imobilizován tento enzym s Rutheniovým komplexem, jako fluorescenčním převodníkem. Tato vrstva se nanesla na optickou čočku, jež tvoří aktivní část biosenzoru. Aktivní vrstva obsahuje enzym diaminooxidáza, který katalyzuje reakci s kyslíkem a tím dojde i ke snížení koncentrace kyslíku v roztoku. Kyslík zháší fluorescenci převodníku Rutheinového komplexu na λ e ~ 620 nm, která je excitovaná s λ α ~ 460 nm. Práce je členěna na dvě základní části, na Teoretickou a Experimentální část. Teoretická část je dále dělena do podkapitol týkajících se luminiscense, biosenzorů a biogeních aminů. V Experimentální části se zabývám dílčím tématem, a to přípravou citlivé vrstvy s rutheniovým komplexem a enzymem.

Teoretická část Luminiscence Luminiscence je samovolné záření látky s maximem na vlnové délce λ max, úměrné rozdílu energií excitované a základní hladiny látky, jako výsledek absorpce záření na vlnové délce s λ α s látkou. Přižemž platí s λ α < λ max. Vlnová délka absorbovaného záření λ α je nižší než vlnová délka λ e. Jejich rozdíl Δ λ se nazývá Stokesův posuv. Jeho velikost charakterizuje daný materiál. Tyto energetické přechody jsou graficky znázorněny v Jablonskeho diagramu (obr. 1). VR vibrační relaxace IC interní přechod ISC Mezisystémový přechod Obr. 1: Jablonskeho diagram.[13] Luminiscence se dělí na fluorescenci a fosforescenci. Fluorescence Při fluorescenci dochází k nezářivému přechodu molekuly z vyšší na základní vibrační hladinu excitované energetické hladiny a poté k zářivému přechdu na základní energetickou hladinu (viz. Obr. 1).

Fosforescence Během fosforescence přejde molekula na přechodný tripletový stav, přitom se změní spin a poté přechází zářivým přechodem na základní energetickou hladinu. Fosforescence odeznívá mnohem pomaleji než fluorescence. Chemiluminiscence Speciálním případem luminiscence je chemiluminiscence, kdy je molekula excitována na vyšší energetické hladině energií z chemické reakce. Biosenzory Biosenzor je integrované zařízení, které je schopné poskytovat specifickou kvantitativní nebo semikvantitativní analytickou informaci, obsahující biologickou (bioelement) nebo od biologie odvozenou složku (receptor), která je v přímém nebo úzkém kontaktu s převodníkem. Bioelement plní rekogniční funkci, tzn., rozpoznává analyt až na molekulové úrovni, což zaručuje vysokou citlivost, specifičnost a možnost optimalizace senzoru pro daný analytický problém. Naproti tomu chemické senzory, jako např. sodné nebo draselné iontově selektivní elektrody, jsou často používány k monitorování těchto iontů v tělních tekutinách, jako moč nebo krev. Převodník (senzor) je zařízení umožňující převod signálu k dalšímu zpracování. [15] Optické vláknové biosenzory Optický biosenzor je optickým senzorem, kde je v detekčním místě zachycen biologický opticko-chemický převodník (dále biopřevodník). Interakcí analyzované látky s tímto převodníkem dojde ke změně optických vlastností v detekčním místě a tím se změní výstupní signál senzoru. Jako převodníky jsou využívány látky z biologických systémů, (např. buňky získané z myší či králíků), proto jim přisuzujeme přívlastek biologický. [13] Enzymatické převodníky Enzymatické nebo také katalytické biopřevodníky zahrnují různé enzymy, tj. složité bílkoviny, které katalyzují (umožňují, urychlují) chemické reakce.

Tabulka Příklady enzymatických senzorů pro lékařství. [13] Analyt Enzym Matrice; Detekován Převodník Glukóza Glukosooxidáza Akrylamid Kyslík Ru(phen) 2 Cl 2 Bilirubin Bilirubinoxidáza Akrylamid Kyslík Ru(phen) 2 Cl 2 Cholesterol Cholesteroloxidáza Grafit Kyslík Ru(phen) 2 Cl 2 Penicilin Penicilináza/Penicilin Polyvinyl ph Aminofluorescein G amidáza Alkohol Močovina Ureáza Polyvinyl ph Aminofluorescein Alkohol Cholin Cholinooxidáza PVA gel H 2 O 2 Luminol Biogenní aminy Biogenní aminy jsou organické sloučeniny osahující dusík. Jsou tvořeny enzymatickou dekarboxylací přirozeně se vyskytující aminokyseliny, které se běžně podílejí na metabolických procesech v živých tkáních a vykazují různé biologické účinky. Největší nárůst hladiny biogenních aminů je obvykle pozorován během procesu stárnutí. [2] Mohou přímo fungovat jako hormony (histamin) nebo mohou být např. stavební látkou pro biosyntézu hormonů (např. fenylethylamin) nebo alkaloidů (halucinogenní účinky). V nízkých koncentracích jsou biogenní aminy přirozenou složkou řady potravin. Mezi 4 nejobvyklejší biogenní aminy vyskytujících se ve víně patří Tyramin, Histamin, Putrescin a Kadaverin. [8] Tyramin Tyramin (4-hydroxyphenethylamine, para-tyramin, mydrial nebo uteramin) je aromatický amin, působí jako katecholaminy ( dopamin, noradrenalin, adrenalin ). Vyskytuje se hojně v rostlinách a zvířatech a je metabolizován enzymem monoaminooxidázy. V potravinách je často produkován dekarboxylací z tyrosinu v průběhu kvašení a rozkladu. Obr. 2: Strukturní vzorec Tyramin (C 8 H 11 NO) [10]

Histamin Fyziologicky je histamin velmi účinný. Působí na hladké svalstvo, způsobuje intenzivní kontrakce dělohy, rozšiřuje cévy a tím snižuje krevní tlak. Je to látka vznikající z aminokyseliny histidinu. Vyskytuje se zejména v některých bílých krvinkách, ale také i v ostatních orgánech. Jeho nadměrné uvolnění při alergické reakci způsobuje zúžení průdušek (u astmatu), kopřivku aj. Histamin se uplatňuje i při vzniku zánětu a zvyšuje též vylučování žaludeční šťávy. Potlačení jeho působení je součástí léčby alergických stavů (antihistaminika H1) a žaludečního vředu (antihistaminika H2). Obr. 3:Strukturní vzorec Histaminu (C 5 H 9 N 3 ). [7] Putrescin Putrescin, nazývaný též tetramethylendiamin nebo butan-1,4-diamin, je alifatickým diaminem. Vzniká dekarboxylací aminokyseliny lysin či aminokyseliny ornithin. Vzniká také při hnití masa. Jeho toxické účinky jsou téměř stejné jako u amoniaku, někdy se proto označuje společně s dalšími aminy jako mrtvolné jedy. Obr. 4:Strukturní vzorec Putrescinu (C 4 H 12 N 2 )

Kadaverin Kadaverin, nazývaný též pentamethylendiamin či pentan-1,5-diamin, je alifatickým diaminem. Vzniká podobně jako putrescin, dekarboxylací aminokyselin lysinu, ornithinu a při hnití masa Obr. 5: Strukturní vzorec Kadaverinu (C 5 H 14 N 2 ). [9] Bakterie podílející se na produktivitě biogenních aminů Mnoho kmenů bakterií (např. Lactobacillus, Pediococcus) ve zkaženém víně má schopnost vytvářet biogenní aminy. K tomu, aby mohl být biogenní amin produkován, je třeba tří podmínek: 1) Ve víně musí být přítomny aminokyseliny, jako je arginin, histidin a tyrosin. 2) Stálé prostředí ve víně, např. ph, alkohol, stálá teplota příznivá pro růst bakterií 3) Bakterie musí obsahovat odpovídající enzym pro dekarboxylaci dostupné aminokyseliny. Potenciální zdravotní problémy V lidském organismu se z buněk kůže a sliznice tvoří histamin, který se při nadměrném vylučování stává průvodním znakem alergické reakce. Jeho uvolňování může vyvolat symptomy jako je například svědění, bolesti hlavy, pokles krevního tlaku a kožní vyrážka. Pokud je organismus intaktní, spouštějí se určité mechanismy, které likvidují histamin produkovaný vlastním tělem. Do těla je Histamin také přijímán potravou. Vzniká při mikrobiologickém rozkladu potravin, a proto se velmi hojně vyskytuje v potravinách živočišného původu, jako jsou ryby, mléčné výrobky nebo maso. Kromě toho může být obsažen i ve výrobcích procházejících mikrobiologickým kvašením a fermentací, např. v pivu, vínu, kyselém zelí, uzeninách či sýru. [11]

Přítomné množství histaminu lze použít jako indikátor čerstvosti (zkažené maso obsahuje cca 60mg/kg kadaverinu a putrescinu). [8] Polyaminy Polyaminy jsou polykationty alifatických aminů se dvěma nebo více amino skupinami. Základní polyaminy jsou spermidin, putrescin a spermin, které vzniknou syntetizováním L- argininu a L-methioninu. Polyaminy jsou důležitými růstovými faktory, protože stabilizují nukleovou strukturu kyseliny a podporují tak syntézu bílkovin, jsou tak nezbytné pro dělení a růst buněk či pro aktivitu imunitního systému. Podporují však zároveň růst nádorů, i když samy nejsou karcinogenní. Putrescin je syntetizován z buněk Escherichia coli.

Experimentální část Použité chemikálie Benzen Aceton Ethanol 96%,p.a. Třená sacharosa, p.a. Odstředěné Sepabeads EC-HA403 s imobilizovanou diaminooxidasou (DAOX ) ORMOCER KSK1238 s Ru-komplexem Fosfátový pufr (0,1 mol/l, ph 5,9 při 25 ) Použité pomůcky Mistička s tloučkem Ochranné brýle pro manipulaci s UV zářením 3 podložní sklíčka Pinzeta 2 Eppendorfovy zkumavky 2 optické čočky d 7,00 mm, th. 2,2mm, f 12,75mm Kovová špachtlička Použité přístroje UV lampa Analytické váhy Lednice Předvážky

Příprava citlivé vrstvy čočky Čočka je připravena z citlivé vrstvy, která se skládá ze složek: 1) ORMOCER KSK1238 organicko anorganický kopolymer se siloxanovou strukturou s Rutheinovým komplexem 2) Enzym diaminoxidasa (DAOX) imobilizovaná na sepabeads 3) Sacharosa pro lepší přístup monitorované látky k enzymu Obr. 6: Čočka bez citlivé vrstvy Obr. 7: Čočka s citlivou vrstvou Příprava citlivé vrstvy K přípravě citlivé vrstvy je potřeba odstředěné Sepabeads s imobilizovanou DAOX, které je třeba rozetřít v mističce s tloučkem na jemnou kašičku. Jednotlivé složky citlivé vrstvy se smíchají na předem očištěném podložním sklíčku. Podložní skla se očistí vatou, postupně namočenou v benzenu, acetonu a etanolu, aby se odstranila mastnota a drobné nečistoty. Na jednom podložním sklíčku se naváží 0,01g třené sacharosy a 0,04g třených Sepabeads s navázanou DAOX, které se následně smíchají. Sacharosa zde chrání enzym a slouží jako porogen. Uložením čočky do pufru se z pórů sacharosa vyplavuje. Ke směsi se naváží 0,04g ORMOCER KSK1238 s Ru-komplexem. Všechny složky se dohromady smíchají v mističce s tloučkem, dokud se nevytvoří hladká kašička. Pomocí pinzety se na zbylá podložní sklíčka připraví čočky. Kovovou špachtličkou se na ně rovnoměrně nanese tenká vrstvička směsi. Směs se musí nanášet rychle, neboť rychle vysychá a poté se špatně roztírá, čímž dochází k nerovnoměrnému rozvrstvení citlivé vrstvy.

Obr. 8:Struktura citlivé vrstvy senzoru Nyní se čočky vloží pod zdroj UV a po dobu 20min se nechají vytvrzovat. Je nutné zapnout UV lampu 30min před vytvrzováním, aby se záření stabilizovalo. Intenzita se nastaví na maximální intenzitu do výšky 10cm. Po vytvrzení se čočky uchovávají v Eppendorfových zkumavkách s fosfátovým pufrem (0,1mol/l, ph 5,9 při 25 ) aby se uchovala aktivita enzymu. Na noc se zkumavky uloží do lednice. V ní je třeba je ponechat po dobu 16 hodin. Obr. 9:UV lampa pro vytvrzování

Závěr Cílem projektu bylo zvládnutí stanovení biogenních aminů s jejich využitím pro fluorescenční senzory, zjištěním vlastností měřeného enzymu a seznámením se s přístroji, se kterýmy jsme pracovaly. Ve své dílčí části jsem vytvořila citlivou vrstvu čočky s rutheniovým komplexem a enzymem, která určuje selektivitu a citlivost biosenzoru. Během nanášení citlivé vrsvy na čočku se musí postupovat opatrně, něboť směs rychle vysychá a následně se loupe. Při měření jsme naměřily lineární odezvu na dávky putrescinu, což slibuje do budoucna perspektivu při dalších měření.

Seznam použité literatury [1] Y. Ramot, M. Pietila, G. Giuliani, F. Rinaldi, L. Alhonen, R. Paus,: Polyamines and hair: a couple in search of perfection, Experimental Dermatology 2010; 19: 784 790 [2] Biogenic Amines, TECHNICAL BULLETIN, 20 January 2011 [3] J. Lakowitz.: Fundamental of fluorescence Spectroscopy, ed.3, Springer, 2006, Vybrané kapitoly, ISBN 978-0306460937 [4] E. Václavíková.: Enzymové biosensory pro fermentační procesy, Diplomová práce, VSCHT Praha, (2008). [5] S. Kurihara, H. Suzuki, M. Oshida, Y Benno.: A novel Putrescine importer required for type 1 pili-driven surface motility induced by extracellular Putrescine in Escherichia coli, JBC, 25 January 2011 [6] http://www.safibra.cz/matinoes, on-line [7] http://cs.wikipedia.org/wiki/histamin, on-line [8] http://www.agronavigator.cz/az/vis.aspx?id=76472, [9] http://cs.wikipedia.org/wiki/kadaverin, on-line [10] http://en.wikipedia.org/wiki/tyramine, on-line [11] http://zdrava-vyziva.doktorka.cz/reakce-histamin-potravinach, on-line [12] http://www.bezpecnostpotravin.cz/biogenni-aminy-a-polyaminy-v-potravinach.aspx, on-line [13] M. Pospíšilová, I. Kašík.: Vláknová optika pro biologii a medicínu, ČVUT 2011 [14] M. Šebela, Z. Lamplot, M. Petřivalský, D. Kopečný, K. Lemr, I. Frébort, P.Peč: Recent news related to substrates and inhibitors of plant amine oxidases, BBA, January 2003 [15] http://www.peta.unas.cz/biosenzory/biosenzory_soubory/definice.htm, on-line