Stanovení koncentrace (kvantifikace) proteinů Bioanalytické metody Prof. RNDr. Pavel Peč, CSc. Úvod Kritéria výběru metod stanovení koncentrace proteinů jsou založena na možnostech pro vlastní analýzu, množství a charakter analyzovaného proteinu, přítomnosti interferujících látek a požadavkem na přesnost. Např. Lowryho metoda je velmi citlivá, ale na druhé straně je dvoustupňová a vyžaduje minimální dobu inkubace 40 min. Metoda dle Bradfordové je mnohem citlivější a výsledek můžeme znát již za 5 minut, avšak pro proteiny s velmi nízkým obsahem argininu je nepoužitelná. Problém odhadu obsahu a charakteru proteinů je v tom, že jako standard používáme čistý protein, ale analyzujeme obvykle směs, nebo protein o neznámém aminokyselinovém složení. Kriteria budou diskutována u jednotlivých metod. Literatura pro podrobnější studium: Stoscheck,, C.M. Quantitation of Protein. Methods in Enzymology 182: 50-69 (1990). 1
Stanovení koncentrace (kvantifikace) proteinů Velmi důležitá, i když nenápadná analýza bez drahých instrumentů. Dnes se preferují spektrofotometrické metody, stanovení dusíku (po mineralizaci) v Kjeldahlově metodě, nebo gravimetrie a refraktometrie již patří minulosti. 1. Biuretová metoda; reakce peptidové vazby s Cu(II) v alkalickém prostředí. Tvoří se modrofialové zbarvení, λmax = 540 nm. Činidlo obsahuje CuSO 4, vínan sodno-draselný a NaOH. Nutný standard (BSA, ovalbumin), metoda nezávisí na aminokyselinovém složení, ale je málo citlivá (1-20 mg). Ruší např. NH 4+, Tris. 2. Lowryho metoda, od roku 1951, modif. 1972, jedna z nejcitovanějších prací (viz obr.). Citlivost biuretové metody zvýšena přídavkem Folin-Ciocalteauova fenolového činidla. biuret Lowry 2
Lowryho metoda mnohem více závisí na složení proteinu. K reakci peptidové vazby s Cu(II) se přispívá redukce fosfomolybdenanů a fosfowolframanů tyrosinem (ale i tryptofanem a cysteinem). Principem je nejprve provedení biuretové reakce a pak přídavek Folinova činidla. Měří se při 650 nm (750 nm), široká absorpce, pro kalibraci nutné standardy (BSA, OVA). Vyšší citlivost než biuretová reakce (2-100 µg), zbarvení však není v čase stabilní. Ruší např. NH 4+. 3. BCA metoda; od 1985, využívá sodné soli kyseliny bicinchoninové (BCA), která komplexuje ionty Cu(I) tvořené reakcí peptidové vazby s Cu(II). Činidlo se připravuje smísením roztoků sodné soli BCA v alkalickém prostředí (100 dílů) a CuSO 4 (1 díl). Měří se při 562 nm, citlivost na úrovni Lowryho metody, menší interference (NH 4+ ano). Kalibrace na standardy (BSA). 3
4. Metoda Bradfordové; principem je adsorpční vazba barviva Coomassie Brilliant Blue G-250 na molekulu proteinu. Závisí na obsahu bazických (zvl. Arg), ale i aromatických aminokyselin. Metoda je velmi populární, protože je rychlá (5 min), množství látek však interferuje, negativně zejména detergenty (SDS, Triton). Nedává tedy tak spolehlivé výsledky jako obdobně citlivá BCA metoda, kde tyto látky neruší. Citlivost je 5 x vyšší než u Lowyho metody, lineární kalibrace max. po 20 µg proteinu. Činidlo (vodný roztok) obsahuje barvivo, ethanol a H 3 PO 4. Barva hnědá, po reakci s proteinem intenzivně modrá, λmax = 595 nm. Všechny dosud zmíněné metody jsou destruktivní, vzorek je pro další analýzu nepoužitelný! 5. Přímá spektrofotometrická stanovení (UV oblast); díky přítomnosti chromoforů v molekulách proteinů, které absorbují v UV oblasti spektra. Velkou výhodou je, že jde o nedestruktivní metodu. Pracuje se s křemennými kyvetami, nikoli sklo ani plast. V blízké UV oblasti (280 nm) není velká citlivost, v daleké UV oblasti (205 nm) pak dochází ke značné interferenci. Samozřejmě je zde velká závislost na aminokyselinovém složení proteinu. Vzhledem k tomu, že UV absorpce je dána aromatickými AK (hlavně Trp a Tyr), je nutná jejich přítomnost. Interference širokého absorpčního pásu nukleových kyselin (λmax( = 260 nm) se eliminuje měřením při dvou vlnových délkách a početní korekcí. V daleké UV oblasti se využívá vlnová délka 205 nm (maximum absorpce peptidové vazby je při 192 nm). 4
Molární absorpce Vlnová délka (nm) Při měření v daleké UV oblasti je nutno precizně volit pufr (aby neabsorboval), vzorky by měly být zbaveny malých částic (a tím i opalescence) centrifugací, pokud možno bez velkého obsahu O 2. Vzorce pro přímé UV stanovení: c (mg/ml) = 1.55 A280-0.76 A260 c (mg/ml) = (A235 - A280)/ 2.51 c (mg/ml) = (A224 - A233)/5.01 c (µg/ml)( = A205 [27 + 120 (A280/A205)] 6. Edelhochova metoda; při znalosti aminokyselinového složení je možné spočíst extinkční koeficient proteinu ε 280. Podmínkou je přítomnost tryptofanu nebo tyrosinu v molekule. 280 = ntrp.5500 + ntyr.1490 + ncys.125 (M - 1.cm - 1 ) ε 280 5
7. Fluorescenční stanovení; fluorimetrické stanovení proteinů je založeno na reakci primárních aminoskupin v proteinu (Lys,, N-koncová N aminoskupina) ) s o-ftalaldehydemo ftalaldehydem. Citlivost metody může být zvýšena hydrolýzou proteinů před měřením. Ruší pufry s obsahem primárních aminoskupin (Tris), nejlépe použít borátový pufr, ph 10.4. CHO CHO Měří se po přídavku hydroxidu sodného, excitační vlnová délka 340 nm, emise mezi 440 a 455 nm. Každý vzorek se měří pouze jednou, ozáření snižuje intenzitu fluorescence. 6