Proteinové znaky dětské leukémie identifikované pomocí genových expresních profilů M.Vášková a spol. Klinika dětské hematologie a onkologie 2.LF UK a FN Motol Childhood Leukemia Investigation Prague
Průtoková cytometrie v diagnostice dětské leukémie AML T ALL (zralá B vs.) BCP ALL prob ALL call praeb ALL Mejstříková et al., Haematologica 2010 CD19+CD10neg CD19+CD10+ iigmneg CD19+CD10+ iigmpoz + exprese aberantních molekul, stanovení DNA ploidie (DNA indexu)
Genotypové podskupiny dětské ALL B prekursorová ALL Zralá B ALL T ALL Pui et al., N ENGL J MED, 2004
Pui et al., Blood 2012
Genové expresní profily dětské ALL Yeoh et al., 2002, Ross et al. 2003,.. geny korelující s imunofenotypovými a genotypovými podskupinami, odpovědí na léčbu, rezistencí na léčebné přípravky, odlišující maligní buňky od nemaligních
Výběr nových proteinových znaků pro průtokovou cytometrii Proteiny korelující s genotypem, rizikem relapsu, odpovědí na léčbu odlišující maligní a nemaligní buňky analýza autorů naše reanalýza dat FC testování v případě dostupné protilátky protilátka nedostupná ověření pomocí RQ-PCR příprava vlastní protilátky
Reanalýza primárních dat cutoff pro každý gen 100 80 CD44 prediktory negativity x% y% % pacientů nad cutoff, negativní 60 40 20 0 0 20 nekorelující geny 40 60 prediktory pozitivity 80 % pacientů nad cutoff, TEL/AML1 pozitivní CD27 100 Vášková et al., Leukemia 2005
Identifikace TEL/AML1 pozitivních pacientů pomocí exprese CD44 a CD27 CD44 (Pgp-1): receptor pro kyselinu hyaluronovou (%) CD27 (TNFRSF7): tumor necrosis factor receptor superfamily T buňky, NK buňky, paměťové B buňky, časné prekurzory B buněk (%) n=526
PCR TEL/AML1 negativní pacienti Žaliová et al., Pediatr Blood Cancer 2011: TEL/AML1-positive patients lacking TEL exon 5 resemble canonical TEL/AML1 cases Tel_ex5/Aml1_ex2/3 1 2 3 4 5 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 3 4 5 6 7 8 916 : Tel_ex4/Aml1_ex3 1078 : Tel_ex4/Aml1_ex2 Ostatní negativní pacienti společné genetické změny?
Hledání OPÁLu C. Willman et al, Albuquerque, NM, USA 100 OPAL-1 (Outcome Predictor in Acute Leukemia 1) % pacientů nad cutoff, relaps 80 60 40 20 0 0 20 40 60 80 100 % patientů nad cutoff, bez relapsu OPAL1
prediktor TEL/AML1 TEL/AML1 100 % patientů nad cutoff, negativní 80 60 40 20 0 0 20 40 60 80 100 OPAL1 % patientů nad cutoff, pozitivní
SEC-MAP Size-exclusion Chromatography - Microsphere-based Affinity Proteomics umoţňuje detekci více neţ 1700 proteinů v buněčném lyzátu 1 izolace proteinů 2 značení proteinů biotinem 3 rozdělení proteinů na chromatografické koloně 4 imunoprecipitace chromatografických frakcí se SEC-MAP array 5 detekce proteinů pomocí streptavidinu-pe 6 měření na průtokovém cytometru 7 analýza protein G Goat anti Mouse PROTEIN-BIOTIN Mouse anti Human STREPTAVIDIN - PE Wu, Antibody array analysis with label-based detection and resolution of protein size. Mol Cell Proteomics 2009 Slaastad, Multiplexed immuno-precipitation with 1725 commercially available antibodies to cellular proteins. Proteomics 2011 Stuchly, An automated analysis of highly complex flow cytometry-based proteomic data. Cytometry A 2012
Drebrin Podle expresních profilů má nízká exprese předpovídat vyšší riziko relapsu a špatnou odpověď na léčbu Podle FC korelace s TEL/AML1 podle SEC-MAP BCP ALL vyšší exprese neţ AML n=20 n=66 Vášková et al., Leukemia Research 2011
Další metody pro verifikaci proteinové exprese Průtoková cytometrie: CD27, CD44, CD135, CD49f, CD99, CD103, TNFRR2, ICOSL, IL10RB, CD97 Potvrzení korelace pomocí RQ-PCR a následná příprava protilátky: Drebrin, OPAL1, ARHGEF4, CLIC5, DDIT4L, PCLO, LARGE probíhající: SEC-MAP plánovaná: buněčná analýza hmotnostní cytometrií verifikace a další biologické informace v širším kontextu
Poděkování O. Hrušák E. Mejstříková T. Kalina V. Kanderová D. Černá J. Stuchlý M. Kováč P. Volná M. Ţaliová J. Zuna J. Trka J. Starý V. Hořejší T. Brdička P. Angelisová J. Špička K. Drbal F. Lund-Johansen
Le Bien, Blood 2000 Loken, Blood 1987 prob Loken I preb I Loken II preb II immature B Loken III CD19+CD10+ : 44-27- 44+27-27-44-27+44-27+44+ 44+27-27-44+ 27-44- 44-27- 27-44- 27-44- cytoplasmic IgM TdT RAG-1 highcd10 CD34, cytoplasmic VpreB V H J H rearranged L chain rearranged leukemias TELAML1 others large cells (FSc) CD20 Vášková et al., Tissue Antigens 2007
Size-exclusion Chromatography FPLC = fast protein liquid chromatography 670 kda 10 kda 24 frakcí
automatická detekce populací kuliček definice proteinových forem čárový graf kvantifikace